頂空固相微萃取-全二維氣相色譜/飛行時間質譜測定三種芒果香氣成分

黃 豆，曹烙文，岑延相，區梓峰，胡 韓，譚國斌，麥澤彬，黃正旭,，李 雪，吳曼曼,

（1.廣州禾信儀器股份有限公司，廣東廣州 510530；2.暨南大學質譜儀器與大氣環境研究所，廣東廣州 510632；3.廣州智達實驗室科技有限公司，廣東廣州 510632）

芒果（Mango）被稱為“熱帶水果之王”，是杧果的通俗名，屬漆樹科（Anacardiaceae）杧果屬（Mangifera）。芒果原產于印度的常綠大喬木，地理上主要分布在印度、孟加拉、中南半島、馬來西亞和中國（云南、廣西、廣東、福建、海南以及臺灣）[1]。在我國，芒果的栽培面積是僅次于荔枝、龍眼及香蕉，排名第四的重要熱帶水果[2]。芒果富含大量維生素A，可抗癌、美化皮膚、防止高血壓和動脈硬化、防止便秘、殺菌[3]等。

近年來，食品香味成分的研究引起了人們的廣泛關注。果實的香氣成分種類和含量是芒果的主要品質特性之一，是芒果風味與商品價值的一個重要參考指標[4?5]。劉傳和等[6]利用頂空固相微萃取（Headspace Solid Phase Microextraction, HS-SPME）結合氣相色譜-質譜法（Gas Chromatograph/Mass Spectrometer，GC-MS），對凱特芒、象牙芒、臺農一號、四季芒四種芒果的果肉香氣成分進行分析，四種芒果的果實共測到20種香氣物質，萜烯是最主要的香氣成分。張浩等[7]應用電子舌與SPME/GC-MS技術檢測出金芒、青芒、紅玉和貴妃四種芒果含有萜烯類、酯類與醛類等7大類揮發性有機物，并進行PCA（主成分分析法）分析確定了用于區分四種芒果的特征揮發性有機物。以上均采用HS-SPME結合GC-MS進行研究，受限于常規GC-MS的分離能力，檢出的香氣成分較少。全二維氣相色譜（Comprehensive Two-dimensional Gas ChromatoGraph，GC×GC）技術是上世紀末逐漸發展起來的一種高效分離檢測技術，與常規GC技術相比，具有高峰容量、高分辨率、高靈敏度、族分離等特點[8?9]，對復雜樣品的全組分分離具有極強的優勢。而飛行時間質譜儀（Time of Flight Mass Spectrometer, TOFMS）每秒能產生大于100張的全譜圖，在高速采集的同時完整的保留質譜數據，是全二維色譜的最理想檢測器[10?12]，因而全二維氣相色譜結合具有高速采集功能的飛行時間質譜儀非常適用于石油[13?15]，風味[16?17]及環境[18?20]等復雜樣品的分析。

目前國內外學者較多采用常規GC-MS對芒果中香氣成分進行研究，尚未見到GC×GC-TOFMS用于研究芒果香氣成分的相關報道。本文采用全自動HS-SPME結合GC×GC-TOFMS，對市面上常見芒果品種金煌芒、小臺芒和青皮芒的香氣成分進行了定性及對比分析，確定不同芒果品種在香氣成分上的差異，旨在為芒果等果蔬類植物風味物質的精細分析開拓新方向。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金煌芒、小臺芒和青皮芒 選取市面上大小均一、果實成熟完全、完整新鮮的芒果，購自永輝超市，數量若干，洗凈去皮備用。

GGT 0620型全二維氣相色譜-飛行時間質譜聯用儀 廣州禾信儀器股份有限公司；瑞士CTC全自動多功能在線前處理進樣平臺 廣州智達實驗室科技有限公司；769S型攪拌機 余姚市海蒂詩家用電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 將3種芒果果肉分別置于攪拌機搗碎，并稱取5 g果肉于20 mL固相微萃取樣品瓶中。

1.2.2 HS-SPME條件 萃取前老化溫度為260 ℃，老化時間為15 min，振搖速度為350 r/min，萃取溫度為60 ℃，萃取時間為60 min，進樣深度為35 mm，解析溫度為250 ℃。

1.2.3 GC×GC-TOFMS條件

1.2.3.1 氣相色譜條件 進樣口溫度250 ℃；分流進樣，分流比為5:1；一維色譜柱MEGA-WAX Plus（30 m×0.25 mm×0.25 μm），二維色譜柱DB-17MS（1.3 m×0.18 mm×0.18 μm）；載氣為氦氣，柱流量為1 mL/min；柱箱溫度采用程序升溫，起始溫度為35 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升溫到240 ℃，保持5 min，共49 min。

1.2.3.2 全二維氣相調制器條件 采用固態熱調制器，選擇HV調制柱（1.2 m×0.25 mm），調制周期為5 s，其中解析時間為1 s；調制器進口和出口同步GC升溫程序，進口始終比柱箱高30 ℃，出口始終比柱箱高120 ℃，冷阱保持?50 ℃。

1.2.3.3 飛行時間質譜條件 電子轟擊離子源（Electron Impact Ion Source，EI），燈絲發射電流100 μA，電離能70 eV；離子源溫度為230 ℃，傳輸線溫度為280 ℃；檢測器電壓為?1900 V；采集質量范圍為40～500 u，采集速度為100譜/s。

1.3 數據處理

采用全二維數據處理工作站軟件Canvas載入數據，自動繪制全二維TIC輪廓圖，并對圖中信噪比大于3的峰自動識別，標識出的每一個峰點即代表一種化合物，每個化合物由一對保留時間確定，X軸方向為第一維保留時間（min），Y軸方向為第二維保留時間（s）。

在Canvas軟件上通過對每個化合物的質譜圖進行NIST17標準質譜數據庫比對檢索、結合保留指數[21?22]（Retention index，RI）等信息，對化合物進行定性分析；同時，軟件采用峰面積歸一化法自動生成各成分的相對含量。根據各化合物的定性定量信息，統計三種芒果鮮肉樣品中的特征香氣成分，并根據化合物官能團對香氣成分進行分類并統計個數和相對含量。

2 結果與分析

2.1 HS-SPME條件優化

2.1.1 萃取頭選擇 以金煌芒為例，實驗過程中對比100 μm PDMS（Polydimethylsiloxane）單相萃取頭和50/30 μm DVB/CAR/PDMS（Divinylbenzene/Carboxen/Polydimethylsiloxane）三相萃取頭，從表1中觀察發現后者可萃取到更多的組分，其萃取的峰個數和總峰面積均多于100 μm PDMS萃取頭。DVB/CAR/PDMS三相萃取頭可以兼顧到極性與非極性各類組分，得到更為全面的分析結果，更適用于含有較多極性化合物組分的風味物質分析，本研究最終選用三相萃取頭進行實驗。

表1 不同萃取頭的萃取效果Table 1 Extraction effect of different fiber

2.1.2 萃取溫度優化 選擇三相萃取頭，實驗過程中選擇50、60和70 ℃的萃取溫度，其余條件不變，依次測試金煌芒。萃取溫度對SPME萃取效率的影響具有雙面性，觀察到較低的萃取溫度有利于低沸點組分的萃取，較高的溫度下有利于高沸點組分的萃取。根據表2的結果，本研究選擇60 ℃的萃取溫度，兼顧不同沸點的組分，有利于檢測到更多的揮發性組分。

表2 不同萃取溫度下的萃取效果Table 2 Extraction effect of different extraction temperature

2.1.3 萃取時間優化 選擇三相萃取頭，實驗過程中分別使用50、60和70 min的萃取時間，其余條件不變，依次測試金煌芒。經過實驗優化，從表3可知，萃取時間達到60 min后檢測到的組分數量及總峰面積不再增加，確保分析物在樣品與萃取頭上達到分配平衡，同時盡量地縮短分析時間，故選取萃取時間為60 min。

表3 不同萃取時間下的萃取效果Table 3 Extraction effect of different extraction time

2.1.4 解吸參數優化 選擇三相萃取頭，實驗過程中選擇240、250和260 ℃的解吸溫度，其余條件不變，依次測試金煌芒。較低的解吸溫度不利于高沸點的組分進入色譜，太高的解吸溫度會影響萃取頭的使用壽命，同時也會帶來更多的本底（如帶來較多硅氧烷干擾）。通過表4可知，250 ℃的解吸溫度時，總峰面積和有效化合物個數最多，故本研究選取250 ℃作為解吸溫度。

表4 不同解吸溫度下的萃取效果Table 4 Extraction effect of different desorption temperature

2.2 GC×GC-TOFMS條件優化

2.2.1 升溫程序優化 常規的GC-MS在分析復雜的食品風味時，為了達到較好的色譜分離效果，需要采用低升溫速率（1～3 ℃/min），或者采用梯度升溫方式，最終導致整個分析周期很長（接近1.5 h）。本實驗使用的GC×GC-TOFMS可以采用5 ℃/min快速升溫讓組分快速流出色譜柱，不到50 min即可完成整個采集過程。以某個局部分離效果為例（見圖1），原本在保留時間28 min附近存在三個未分開的組分峰，但經過調制器捕集和二維柱再次分離后測得三個完全分離的十四醛（峰序號171）、5-丁基二氫-2（3H）-呋喃酮（峰序號170）和苯乙醇（峰序號172）。以上表明GC×GC-TOFMS測試芒果香氣成分相比常規GC-MS具有良好的色譜分離效果。

圖1 GC×GC和GC分離效果對比圖Fig.1 Separation effect comparison of GC×GC and GC

2.2.2 柱系統優化 實驗對比了反、正向全二維柱系統測試金煌芒的測試效果，其中反向柱系統一維柱采用強極性的MEGA-WAX Plus（30 m×0.25 mm×0.25 μm），二維柱采用中等極性的DB-17ms（1.3 m×0.18 mm×0.18 μm）；正向柱系統一維柱采用非極性的DB-5ms（30 m×0.25 mm×0.25 μm），二維柱采用中等極性的DB-17ms（1.3 m×0.18 mm×0.18 μm）。圖2為采用反向和正向柱系統測試金煌芒的二維色譜輪廓圖，觀察到采用正向柱系統時，極性較強的組分整體分離度差（如保留時間在5、15和27.5 min等區域），而且會出現二維峰拖尾（如多數極性較大的色譜峰存在明顯的拖尾）以及峰迂回（極性較強的酸類迂回到下一周期）的情況，會對定性結果產生干擾；而在反向柱系統下，極性組分在一維柱拖尾現象顯著減弱，同時極性相近組分分離度得到明顯提升，故最終采用了反向柱系統。

圖2 反向和正向柱系統測試金煌芒的二維色譜輪廓圖Fig.2 Chromatogram of JinHuang mango tested by reverse and forward column systems

2.3 芒果香氣成分質譜匹配結果

圖3 分別為3-蒈烯、萜品油烯、鄰傘花烴和α，α，4-三甲基苯甲醇4種含量較高的香氣成分的實驗質譜圖與NIST 17譜庫質譜圖的匹配結果圖，其中每張圖的上部分為實驗質譜圖，下部分為NIST 17譜庫的質譜圖。實驗結果顯示4種化合物的正向匹配度（Forward Match，MF）和反向匹配度（Reverse Forward Match，RMF）均大于900，因此實驗儀器定性的結果可靠。

圖3 四種香氣成分的質譜匹配圖Fig.3 Mass spectrum matching map of four kinds of aroma components

2.4 三種芒果香氣成分分析

2.4.1 芒果果實香氣成分GC×GC-TOFMS輪廓圖圖4為金煌芒、小臺芒和青皮芒的果實香氣成分GC×GC-TOFMS輪廓圖。使用Canvas工作站對三種芒果香氣成分數據進行了自動峰積分，并使用NIST 17譜庫結合保留指數對每個峰進行檢索定性。金煌芒共檢測到的揮發性組分有114種，其中香氣成分96種，香氣成分峰面積占比74.04%；小臺芒檢測到113種揮發性組分，香氣成分有90種，峰面積占比90.75%；青皮芒檢測到79種揮發性組分，香氣成分68種，峰面積占比78.91%，可以看到不同品種芒果的香氣組成化合物及其含量存在明顯差異。前人研究芒果香氣時，大多數采用常規GCMS分析芒果的香氣成分，單個品種的芒果測到的香氣組分一般不會超過50種[6?7]。而借助全二維強大的分離能力和高靈敏度，一方面能夠測到共流出的組分，另一方面可以測到含量極低的組分，而這些痕量物質對芒果香氣的貢獻值卻較大，需要著重研究。

圖4 三種芒果的二維色譜輪廓圖Fig.4 Chromatogram of three kinds of mangos

2.4.2 三種芒果果實香氣成分對比分析 由表5可知，在170種香氣成分中，三種芒果同時含有的香氣成分有26種。三種芒果果實共有的26種香氣成分中包含15種烯烴/環烷烴、4種醇類、1種酯類、1種酮類、1種酸類和2種芳香烴類。烯烴中單萜烯及倍半萜烯烴類化合物在三種芒果香氣成分構成中都占有較大比率，特別是3-蒈烯（松木香氣）及萜品油烯（又叫異松油烯，松木樹脂味），兩者總量在三種芒果香氣成分中占比都超過20%，對形成芒果特有的香氣都有重大的貢獻，與前人研究的結果相似[6,23?24]。而2-蒈烯（甜香味）、檸檬烯（檸檬果香味）、α-水芹烯（清香味）和β-月桂烯（清淡的香脂香氣）則進一步形成芒果特有的香氣。三種芒果共有的香氣成分有26種，比如萜品油烯、3-蒈烯、β-月桂烯、石竹烯、珂巴烯和γ-依蘭油烯等萜烯類組分，組成芒果基本的香氣，但共有成分在不同品種芒果中含量存在明顯差異，比如金煌芒中3-蒈烯的含量明顯更高，達到10.783%，小臺芒中萜品油烯含量明顯更高，為17.545%。

表5 三種芒果的香氣成分及相對含量Table 5 Aroma components and relative contents of three kinds of mangos

將三種芒果中170種香氣成分按照官能團分類，芒果香氣成分主要由7類化合物構成。烯烴類（含環烷烴）56種、酯類46種、醇類25種、酮類18種、醛類15種、酸類6種、芳香烴4種。三種芒果香氣成分中含量最高的均為烯烴類化合物，烯烴類是草香型香氣物質；不同的是，金煌芒還含有較多的酯類、醛類及醇類等含氧化合物，酯類是果香型香氣物質，對果實濃郁起主要貢獻作用[25]；對小臺芒及青皮芒而言，烯烴類化合物占據極大的比例，而含氧香氣化合物明顯較金煌芒偏低，另外兩者都含有5%以上的芳烴香氣（特異芳香味[26]）成分。

續表 5

續表 5

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對于不同芒果品種中各自獨有的成分，其中金煌芒有51種，占金煌芒香氣成分含量的30.00%；小臺芒有38種，占小臺芒香氣成分含量的22.35%；青皮芒有25種，占青皮芒香氣成分含量的14.71%。金煌芒中丁酸乙酯、反,順-2,6-壬二烯醛、十四醛、紫羅蘭酮、呋喃酮及苯甲酸芐酯等低含量的組分，因其較低的氣味閾值，呈現出對整體香氣具有突出的貢獻作用。可以看出，金煌芒獨有的香味成分，比如酯類（果汁香韻及果香香韻）、醛類（清香韻）以及醇類（醇香韻）等含量更多，更加豐富；對應的青皮芒獨有的香味成分則相對較少，這也是金煌芒香氣濃郁，而青皮芒香氣較寡淡的原因。

3 結論

采用HS-SPME-GC×GC-TOFMS法在三種芒果品種共檢測出170種香氣成分，其中金煌芒、小臺芒、青皮芒中分別測到96、90、68種香氣成分，相對含量占各自總揮發性成分的74.04%、90.75%、78.91%。三種芒果共有的香氣成分有26種，烯烴中單萜烯及倍半萜烯烴類化合物在三種芒果香氣成分構成中都占有較大比率，特別是3-蒈烯（松木香氣）及萜品油烯（松木樹脂味），兩者總量在三種芒果香氣成分中占比都超過20%，對形成芒果特有的香氣都有重大的貢獻。而2-蒈烯（甜香味）、檸檬烯（檸檬果香味）、α-水芹烯（清香味）和β-月桂烯（清淡的香脂香氣）則進一步形成芒果特有的香氣，但共有成分的含量在不同品種芒果間存在差別。7類化合物中烯烴類化合物在三種芒果中含量占比最高，金煌芒與其他兩種芒果相比，含有更多的酯類、醛類和醇類等香氣成分，對應的青皮芒獨有的香味成分則相對較少，這也是金煌芒香氣濃郁，而青皮芒香氣較寡淡的原因。結果表明，憑借全二維氣相色譜-飛行時間質譜聯用儀強大的分離及定性能力，可以獲得比常規氣相色譜-質譜聯用儀更多的香氣成分信息，對香精香料的精細化發展起到重要的促進作用。