不同品種羊肚菌揮發性物質分析及綜合評價

謝麗源，蘭秀華,2，唐 杰，彭衛紅,

（1.四川農業科學院土壤肥料研究所，四川成都 610066；2.電子科技大學生命科學與技術學院/信息生物學研究中心，四川成都 610054）

羊肚菌（Morchellaspp.）是一種珍稀名貴食用菌，屬于羊肚菌科（Morchellaceae），羊肚菌屬（Morchella）[1]。羊肚菌肉質脆嫩，味道鮮美可口，同時還含有多糖類、酮類、生物酶類等多種活性物質[2?3]，具有調節機體免疫力[4?5]、抑制腫瘤[6]、抗氧化[7?9]、抗菌[10]、降血脂[11?12]等多種功效。隨著羊肚菌馴化栽培技術的發展，羊肚菌品種日益增多，目前羊肚菌品種選育標準以感官和產量為主，并以此來指導生產。而羊肚菌等食用菌中含有特殊香氣物質[13?17]，賦予了羊肚菌獨特的風味，逐漸成為了衡量品質優劣的重要指標[18]，成為羊肚菌品種選育和利用的重要方向。課題組先后通過四川省農作物品種審定委員會審定羊肚菌品種9個，但對于不同品種間香氣成分差異一直未作評價，不利于羊肚菌品種有效利用。

本試驗采用頂空固相微萃取（HS-SPME）-氣相色譜-質譜（GC-MS）的方法檢測不同羊肚菌品種揮發性物質，分析不同品種間揮發性物質組成種類、含量和主體揮發性香氣成分差異，并采用統計學方法建立香氣綜合評價模型，以期為不同品種的羊肚菌品質提供判定依據，為羊肚菌質量評估及產品開發利用提供理論依據。

本試驗采用頂空固相微萃取（HS-SPME）-氣相色譜-質譜（GC-MS）的方法檢測不同羊肚菌品種揮發性物質，分析不同品種間揮發性物質組成種類、含量和主體揮發性香氣成分差異，并采用統計學方法建立香氣綜合評價模型，以期為不同品種的羊肚菌品質提供判定依據，為羊肚菌質量評估及產品開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

經過四川省農作物品種審定委員會審定羊肚菌品種9個（表1）；氯化鈉、氯化鈣、碳酸氫鈉等 為分析純，購自奧克生物試劑公司。

表1 供試羊肚菌品種Table 1 Morchella evaluated in this study

7890-5975氣相色譜-質譜聯用儀（GC-MS），配有電子轟擊電離源（EI） 美國Agilent公司；65 μm PDMS/DVB 萃取纖維頭 美國Supelco公司；TeledyneTekmarAtomx動態頂空自動進樣器 美國Tekmar公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的采集和處理 在四川新都基地采用相同栽培配方（麥粒30%（下層）、木屑與土壤（體積比1:1混合）70%（上層））、統一栽培模式（水旱輪作）和采收標準（子實體長度6～8 cm）得到羊肚菌子實體，經60 ℃熱風干燥、粉碎后過80目篩待用。

1.2.2 頂空固相微萃取樣品制備及萃取條件 稱取9種粉碎樣品各2.00 g放置10 mL樣品瓶中，加入1.5 g NaCl和6 mL蒸餾水混合搖勻，將溶液傾入15 mL頂空瓶中，將PDMS/DVB萃取頭于230 ℃老化20 min后插入樣品瓶，于50 ℃水浴鍋內恒溫萃取30 min，取出萃取頭插入氣相色譜進樣口，在250 ℃解吸3 min，進行分析檢測。

1.2.3 GC-MS條件 色 譜柱：DB-WAX（60 m×0.25 mm×0.50 μm）；載氣：高純氦氣；載氣流速（恒流模式）：1.0 mL/min；進樣方式：分流進樣；分流比：10:1；進樣口溫度：230 ℃；升溫程序：初始溫度35 ℃保持3 min，以5 ℃/min速率升溫至220 ℃，保持10 min，總運行30 min；

質譜條件：離子化方式為電子轟擊電離（EI）；電子能量70 eV；離子源溫度：230 ℃；接口溫度：230 ℃；掃描模式：scan掃描；掃描范圍：m/z 45～350。

1.2.4 揮發物質的定性和定量分析 運用計算機檢索與圖譜庫（NIST 2011）的標準質譜圖比較，確定各色譜峰對應化學成分，采用峰面積歸一法求得各組分相對含量。

1.2.5 主體揮發性香氣成分評定方法 揮發性物質對樣品總體風味的貢獻通過相對氣味活度值（relative odor activity value, ROVE）進行評價[19?22]，是揮發性物質濃度和閾值相對于氣味貢獻最大組分的比值，是通過最大貢獻的物質來表示其他物質的氣味貢獻大小。ROAV=100表示對樣品風味貢獻最大，其他組分的ROAV＜100，計算公式為：

式中：Ci、Ti表示為揮發性組分的相對含量，%和氣味閾值，μg/kg；Ct、Tt表示為對樣品整體風味貢獻最大組分的相對含量，%和氣味閾值，μg/kg。

ROAV≥1表示該物質為主體風味組分，且ROAV越大，說明該物質對總體風味貢獻越大；0.1≤ROAV＜1之間，表明該物質對整體風味有修飾作用[23?24]。

1.3 數據處理

IBM SPSS Statistics 22.0對數據進行主成分PCA分析。

2 結果與分析

2.1 不同羊肚菌品種干品GC-MS分析

經GC-MS分析，9種羊肚菌干品揮發性化合物匹配度大于80%的共38種，其組成及相對含量見表2所示。包括9種醛類、1種酯類、7種醇類、4種酸類、9種烴類、2種含硫化物、2種呋喃類、1種醚類、3種酮類。不同羊肚菌品種揮發性物質數量和相對含量有一定差異，共有物質9種，包括2-甲基丙醛、2-丁烯醛、2-甲基-1-丙醇、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、3-甲基-1-丁醇、正己醛、1-己醇、萘，其中2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、2-甲基丙醛相對含量較高。

1）告警發生時間/告警恢復時間：2014-09-15 11:54:51+08:00/2014-09-15 11:55:07+08:00.

表2 不同羊肚菌品種揮發性香氣組分及相對含量（%）Table 2 Volatile compounds and their relative percentage contents of Morchella (%)

9個羊肚菌品種分別檢測出24、24、21、21、10、17、21、14、17種化合物，醛類物質相對含量最高，含量在51.28%～71.16%之間，且閾值較低，賦予香氣能力較強，對整體風味影響大。M1、M3、M4、M8含硫化合物相對含量分別僅為6.38%、7.17%、6.10%，但閾值極低，對整體香氣影響超過醛類化合物。9個羊肚菌品種醇類物質相對含量次于醛類，相對含量在13.93%～27.96%，但閾值高，對總體香氣影響較小。其余化合物相對含量不高，對整體香氣影響不大。

2.2 不同品種羊肚菌干品主體揮發性香氣成分分析

隨著羊肚菌商業化栽培的成功，栽培技術和栽培品種逐漸成熟，但相較于野生品種，仍缺乏對目前馴化栽培品種的香氣成分的研究。由表2可知，9種羊肚菌干品都含有多種揮發性成分，但只有一小部分對其整體風味有重要貢獻，還有一些成分對整體風味起輔助作用，這些化合物共同形成羊肚菌的特有香氣[19,22,24]。9種羊肚菌干品揮發性香氣成分ROAV值見表3。

表3 羊肚菌樣品揮發性成分氣味貢獻Table 3 Odor contribution of volatile compounds of samples

2-甲基丙醛、2-甲基丁醛在羊肚菌中均檢測到，且相對含量高，由于氣味閾值偏低，導致相對氣味活度值較大，對羊肚菌9個品種香氣均有重要貢獻（ROAV≥1），是共有的特征香氣物質。

含硫化合物二甲基三硫化物和二甲基二硫化物氣味閾值極低，對整體風味影響大。羊肚菌品種M1、M3、M4、M5、M10檢測到含有二甲基二硫化物，M1、M3、M4、M8檢測到二甲基三硫化物，其中M1、M3、M4、M8的含硫化合物相對含量雖低于醛類化合物，因極低的閾值而對羊肚菌的香氣貢獻極大，使其具有獨特的蔬菜樣香氣。

具有葉香和果香味的正己醛在羊肚菌中均檢測到，由于不同品種間相對含量有差異，導致對羊肚菌的香氣貢獻存在差異，對整體風味起重要作用（ROAV≥1）的品種是M1、M3、M5、M6、M7、M10，對整體風味起重要修飾作用（0.1≤ROAV＜1）的為M4、M8、M9。

苯乙醛僅對M5的香氣有重要貢獻；正壬醛對M5香氣有重要貢獻，同時對M3和M4的香氣起修飾作用。

2.3 不同品種羊肚菌揮發性物質的PCA

通過SPSS 22.0軟件對9個羊肚菌品種揮發性物質的相對含量進行主成分分析，結果顯示前6個主成分的累計貢獻率為91.568%（表4），表明前6個主成分基本包含了羊肚菌揮發性物質的絕大部分信息，可用于評價綜合品質。由表4可知，前6個主成分中，第1主成分的貢獻率為24.830%，決定第1主成分的主要是呋喃、2-甲基丙酸、3-甲基丁酸、2-甲基丁酸、苯乙醛、2-甲基丙醛、2-甲基-1-丙醇、3-甲基丁醛、1-己醇等；第2主成分的貢獻率為22.374%，決定第2主成分的主要是長葉烯、二甲基二硫化物、二甲基三硫化物、十四烷；第3主成分的貢獻率為14.553%，決定第3主成分的主要是二氯苯、正戊醛、正戊烷、芳樟醇、2-丁烯醛；第4主成分的貢獻率為13.955%，決定第4主成分的主要是1-戊醇、2-庚酮、己基戊基醚、2-壬酮；第5主成分的貢獻率為9.697%，決定第5主成分的主要是正己醛、2-戊基呋喃、3-蒈烯、1-烯醇；第6主成分的貢獻率為6.159%，決定第6主成分的主要是1-戊醇、十二烷。

表4 主成分分析特征向量、特征值、方差貢獻率及累計貢獻率Table 4 Eigenvectors, eigenvalues, variance contribution rates and cumulative contribution rates and cumulative contribution rates of the principal components

續表 4

根據表4，構建各主成分得分與各揮發性物質間的線性關系式為：

以不同特征值的方差貢獻率βi（i=1, 2, 3,···, K）為加權系數，利用綜合評價函數F=β1F1+β2F2+β3F3+···βkFk計算樣品的主成分綜合得分，得到綜合評價模型：

F=24.830%F1+22.374%F2+14.553% F3+13.955%F4+9.697% F5+6.159% F6

其中F1：第一主成分得分，F2：第2主成分得分，F3：第3主成分得分，F4：第4主成分得分，F5：第5主成分得分，F6：第6主成分得分，表明品質越好。根據不同主成分綜合得分，不同羊肚菌品種香氣品質從高到低綜合排名依次為M5、M3、M1、M8、M4、M10、M7、M9、M6（表5）。

表5 不同羊肚菌樣品香氣質量評價Table 5 Aroma quality evaluation of different samples

3 結論

羊肚菌香氣物質來源于多種揮發性風味物質，一般只有一小部分對食用菌的整體風味起重要作用，還有一部分揮發性物質也會對食用菌香氣有一定的影響，這些眾多組分相互作用共同組成羊肚菌獨特的香味[16?17,22]。9個羊肚菌品種醛類物質含量豐富，且2-甲基丙醛、2-甲基丁醛是共有的主要香氣物質，且對M5、M6、M7、M9和M10香氣貢獻最大。；M1、M3、M4、M8、M10含有含硫化合物，對整體風味貢獻大，為其特有物質，且二甲基三硫化合物對M1、M3、M4、M8香氣貢獻最大；苯乙醛和正壬醛是對M5整體風味起重要作用的特有香氣物質。

利用PCA對不同品種質量進行綜合評價，建立香氣評價模型：F=24.830%F1+22.374%F2+14.553%F3+13.955%F4+9.697%F5+6.159%F6，通過綜合評價模型，不同羊肚菌品種香氣質量綜合排名由高到低為M5、M3、M1、M8、M4、M10、M7、M9、M6，為羊肚菌香氣質量評價提供新的模式，這種綜合指標評價方法可以有效指導羊肚菌生產，提高羊肚菌的商品價值，是未來食用菌品種選育、栽培工藝研究以及產品加工的重要發展方向。

本研究的9個羊肚菌品種均未檢出1-辛烯-3-醇、1-辛烯-4-醇、3-辛烯-2-醇等普遍存在于大多數食用菌的揮發性八碳化合物（C8H16O）[13?16]，可能是由于該類化合物穩定性低，干制過程或者萃取過程造成的破壞大，使得這類化合物未被檢出。因此，后續有必要對干制和萃取工藝進行研究，提高不穩定化合物檢出效率。