蜂膠乙醇提取物對小鼠主動脈內皮細胞損傷的保護作用

楊 博，朱宇軒，繆曉青，徐曉蘭2,, ，楊文超,2,,

（1.福建農林大學食品科學學院，福建福州 350000；2.福建農林大學動物科學學院（蜂學學院），福建福州 350000；3.蜂產品加工與應用教育部工程中心，福建福州 350000）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是目前常見的心腦血管疾病發病的主要原因。它的發生機理主要是代謝障礙導致脂質在血管中積累，形成斑塊，使得動脈腔隙變窄，進而導致組織或器官的缺血或壞死[1?2]。血管內皮細胞的損傷是動脈粥樣硬化的關鍵環節，血管內皮細胞的損傷會分泌大量的促炎因子和黏附因子，導致炎癥反應的發生，進而加速AS進程[3?4]。

蜂膠是工蜂采集膠源植物的樹脂與其上顎腺、蠟腺等分泌物混合而成的具有黏性的固體膠狀物[5]。蜂膠的化學成分因膠源植物的不同而不同，其中，中國蜂膠主要的膠源植物為楊樹屬，目前已從中國蜂膠中鑒定出300多種化學成分，包括酚酸類、黃酮類、萜烯類、醇類、香豆素類和脂類等[6?8]。課題組前期的實驗已分析過中國蜂膠的化學成分，主要有喬松素、短松葉素、高良姜素、白楊素等，含量最多的化學成分為黃酮類化合物，占71.92%[9]。現代藥理研究表明，蜂膠具有抗微生物，抗腫瘤，調節血糖，抗氧化以及抗炎活性[10?13]。有研究表明蜂膠具有明顯的抗炎作用，可以預防動脈粥樣硬化，減少血脂，影響血管生成，并在預防和治療心血管疾病中發揮重要作用[14?15]。Kitamura等[16]的證明蜂膠可以誘導M1型巨噬細胞向髓源性抑制細胞（MDSC）分化，有效減少M1細胞，從而抑制M1分泌重要的促炎細胞因子，如TNF-α和IL-6，將炎癥過程轉向消退。蜂膠提取物能降低飼喂高脂飲食的ApoE-/小鼠的總膽固醇（TC）、甘油三酸酯（TG）、非高密度脂蛋白膽固醇（non-HDL-C）的水平以及炎癥因子IL-6和IL-17的產生[17]。蜂膠中的主要成分白楊素也可以減輕內皮細胞間的黏附，并降低IL-1β損傷的人臍靜脈內皮細胞中炎癥因子的表達[18]。

本實驗用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激小鼠主動脈內皮細胞構建損傷模型，研究蜂膠乙醇提取物（ethanol extracts of propolis，EEP）對LPS誘導的小鼠主動脈內皮細胞內炎癥因子的影響，為治療心腦血管疾病提供新的思路和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蜂膠 膠源植物楊樹屬，?20 ℃保存，福建省神蜂科技開發有限公司；CP-M075小鼠主動脈內皮細胞、CM-M075小鼠主動脈細胞完全培養基 普諾賽生命科技有限公司；A3160802胎牛血清 賽默飛世爾科技有限公司；胰酶-EDTA、PBS、D-Hanks 吉諾生物醫藥技術有限公司；小鼠IL-6、TNF-αELISA試劑盒 欣博盛生物科技有限公司；一抗GAPDH、ICAM-1、VCAM-1、MCP-1兔 抗abcam公司；二抗 HRP-Goat anti Rabbit Elabscience公司。

SCO6WE CO2恒溫培養箱 SHEL LAB實驗器材有限公司；SW-CJ-1FD潔凈工作臺 蘇凈安泰公司；IX51倒置顯微鏡 OLYMPUS有限公司；DR-200Bs酶標檢測儀 無錫華衛德朗儀器有限公司；TD6低速離心機 湖南平凡科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 EEP的制備 參照Xu等[9]的方法進行EEP的制備：蜂膠溶于70%乙醇（v/v），室溫浸泡2 d，60 ℃，20 min，40 kHz超聲提取3次，得到的混合液離心，棄上清，真空濃縮至溶劑蒸發，儲于4 ℃備用。

1.2.2 細胞復蘇與培養 將凍有MAEC的細胞凍存管從液氮中拿出，37 ℃水浴中快速解凍后迅速轉移至裝有3 mL培養液的5 mL離心管中，1400 r/min離心4 min。離心后倒掉上清液，加1 mL培養基重懸細胞，轉移至含有3 mL培養基的細胞培養瓶中進行細胞培養，培養條件為5%的CO2，37 ℃。

1.2.3 藥物配制及細胞分組 用小鼠主動脈細胞完全培養基溶解LPS，配制成終濃度為10 μg/mL的LPS藥液；用小鼠主動脈細胞完全培養基溶解EEP，根據后續實驗配制成相應濃度的EEP藥液。使用處于生長對數期（細胞狀態好）的細胞進行實驗，濃度調整為1×105個/mL，接種于96孔板中，分為五組，空白組、LPS模型組，蜂膠低劑量組（LPS+2.5 μg/mL EEP）、中劑量組（LPS+5 μg/mL EEP）、高劑量組（LPS+10 μg/mL EEP），每組設置5個復孔。空白組給予100 μL的完全培養基，LPS模型組給予10 μg/mL的LPS藥液，蜂膠低、中、高劑量組給予10 μg/mL的LPS和2.5、5、10 μg/mL的EEP藥液共培養，培養條件37 ℃，5%的CO2。

1.2.4 細胞增殖率檢測 采用CCK-8檢測MAEC的增殖活性：按照1.2.3的方式培養細胞，24 h后將10 μLCCK-8溶液添加到每個孔中，并在37 ℃的5% CO2中培養4 h。然后，在450 nm處測量吸光度。通過以下公式計算細胞增殖率：

細胞增殖率=實驗孔的吸光度/對照孔的吸光度

1.2.5 ELISA實驗測定TNF-α、IL-6的含量 將處理后的各組細胞樣品和ELISA試劑盒取出平衡至室溫。配制標準品溶液并繪制標準曲線。隨后進行蛋白測定。空白孔中加入標準品，其余孔中加入待測樣品（100 μL/孔），封板，37 ℃孵育90 min。洗板5次。依次加入生物素化抗體工作液，封孔，37 ℃孵育60 min。洗板5次。加入酶結合物工作液，封板，37 ℃避光孵育30 min。洗板，加入顯色底物37 ℃孵育15 min。加入終止液100 μL/孔，混勻后立即在3 min內用酶標儀測量OD450值，每組三個平行。隨后將OD值帶入標準曲線中，計算得到相對含量。

1.2.6 Western Blot法 測 定ICAM-1、VCAM-1、MCP-1的表達水平 經處理后的各組細胞用TBS緩沖液洗滌3次，加入總蛋白提取試劑裂解3～5 min。收集細胞于離心管冰浴30 min后4 ℃12000 g離心5 min。總蛋白濃度用BCA試劑盒測定，每組三個平行。處理好的樣品以每組上樣量10 μL開始電泳，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓130 V，待條帶到玻璃板底部時結束電泳。隨后將樣品轉移至PVDF膜上，放入適量5%脫脂奶粉中，振蕩封閉1 h。然后與一抗封閉4 ℃孵育過夜。TBST洗滌5次，每次5 min。再于二抗中孵育1 h，TBST洗滌5次，每次5 min。隨后進行發光檢測，Alpha Ease FC軟件處理系統分析目標帶的光密度值。結果以與上樣對照甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）[18]的光密度值的比值表示。

1.3 數據處理

采用SPSS 26.0統計軟件進行統計分析，Graph Pad Prism 8.0.2作圖，所有數據以均數±標準差（±s）的形式表示，各組間采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 EEP對MAEC細胞增殖的影響

結果如圖1所示，LPS模型組MAEC的細胞增殖率下降21%，與空白組相比差異極其顯著（P＜0.001），經不同濃度的EEP處理后MAEC的增殖率均有上升，與LPS組相比，10 μg/mL EEP組差異顯著（P＜0.05），2.5 μg/mL 和5 μg/mL EEP差異極顯著（P＜0.01）。

圖1 EEP對LPS處理的MAEC細胞增殖率的影響（n=5）Fig.1 Effects of EEP on LPS-stimulated MACE proliferation rate (n=5)

2.2 EEP對MAEC細胞中IL-6、TNF-α的影響

結果如圖2所示，空白對照組中，IL-6、TNF-α有極少量的表達，經LPS刺激后的MAEC中IL-6、TNF-α的表達明顯升高，其中IL-6由空白組的29.950 pg/mL升高到126.437 pg/mL升高至原來的4.22倍，TNF-α由空白 組的37.407 pg/mL升高到123.613 pg/mL，升高至原來的3.3倍，與空白對照組相比差異極其顯著（P＜0.001），EEP的處理極其顯著降低了IL-6、TNF-α的表達（P＜0.001），且呈劑量依賴性。

圖2 EEP對小鼠主動脈內皮細胞IL-6、TNF-α表達的影響（n=3）Fig.2 Effect of EEP on the expression levels of IL-6、TNF-α in MAEC (n=3)

2.3 EEP對MAEC細胞中ICAM-1、VCAM-1、MCP-1表達的影響

結果如圖3所示，空白對照組的MAEC中ICAM-1、VCAM-1、MCP-1均 有 少 量 表 達，當LPS刺激細胞后ICAM-1、VCAM-1、MCP-1的表達均有極其顯著的上升（P＜0.001）。經不同濃度的EEP處理后，ICAM-1、VCAM-1、MCP-1均有明顯下降，且它們的表達量隨著EEP濃度的增加而降低，各蜂膠給藥組與LPS組均有不同程度的顯著差異（P＜0.01或P＜0.001）。

圖3 EEP對小鼠主動脈內皮細胞ICAM-1、VCAM-1、MCP-1表達的影響（n=3）Fig.3 Effects of EEP on the expression levels of ICAM-1,VCAM-1 and MCP-1 in MAEC (n=3)

3 討論

LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，進入血液的LPS可與單核巨噬細胞、內皮細胞等的細胞膜的受體相結合，通過胞內的信號轉導刺激機體細胞合成和釋放多種炎癥因子，從而誘導內皮細胞的損傷[19]。當內皮細胞受到LPS、ox-LDL等刺激時，可釋放多種細胞因子刺激平滑肌細胞增殖，內皮細胞與平滑肌細胞相互作用推動血管損傷和動脈粥樣硬化的發展[20]。

腫瘤壞死因子TNF-α是一種由巨噬細胞和單核細胞產生的促炎因子，在機體的炎癥反應和免疫反應中起重要的作用[21]。之前的研究構建了LPS損傷的MAEC模型，證實了LPS可以刺激MAEC產生TNF-α引發炎癥，TNF-α還可以誘導黏附分子的表達與IL-6、IL-8等細胞因子的激活，使損傷的內皮細胞通透性增加、脂質更容易穿過血管膜造成脂質堆積，形成斑塊，在炎癥反應和AS的發展過程中起關鍵性作用[22?24]。IL-6也屬于促炎因子，它可以通過激活免疫系統，募集單核細胞，刺激內皮細胞和平滑肌細胞表達，抑制調節性T細胞分化和凋亡，起到促炎作用[25?26]。本研究中Elisa的檢測結果表明LPS的刺激可以大量增加MAEC中TNF-α和IL-6的釋放，經EEP處理后MAEC中的TNF-α和IL-6的表達量與LPS模型組相比均有明顯下降。由此可見，EEP可以減少血管內皮細胞中炎癥反因子的分泌，起到抗炎作用保護內皮細胞免受損傷。

ICAM-1和VCAM-1是免疫球蛋白超家族中的黏附分子，在受損部位介導白細胞與血管內皮細胞的黏附[27]。正常生理狀況下，ICAM-1在血管內皮細胞中的表達水平極低，在細胞損傷或腫瘤壞死因子TNF-α、IL-6等炎癥介質的刺激下其表達水平上調，使白細胞和單核細胞不斷附著內皮細胞于[28?29]，VCAM-1也能在炎癥刺激的內皮細胞中過量表達，與其配體VLA-4共同作用，將炎性細胞更牢固地附著于血管內皮細胞上[30]。之前的研究表明去除ICAM-1后，高脂喂養的小鼠 AS 斑塊總量與對照組相比減少了50%左右[31]，研究證明 ApoE小鼠的VCAM-1基因沉默會減少AS斑塊的體積及斑塊內脂質的含量[32]。兩者的高表達是內皮細胞損傷的重要標志，在動脈粥樣硬化的發展的過程中也起著重要作用。本實驗中LPS的刺激下ICAM-1和VCAM-1的表達顯著增加，而EEP處理能有效降低受損MAEC中ICAM-1和VCAM-1的 表 達，說 明EEP可以減少炎性細胞的黏附，從而減輕內皮細胞的損傷。

細胞單核細胞趨化蛋白MCP-1是化學趨化因子β亞組代表，主要在炎癥細胞和內皮細胞表達，具有募集和活化特定蛋白細胞的功能[33]。LPS對MCP-1的影響主要通過激活Pyk2活化 p38 MAPK激酶，P38MAPK激酶進而激活轉錄因子NF-κB來驅動的[34]。受損的內皮細胞中MCP-1與其受體結合可以引導單核細胞的聚集并在黏附因子的作用下黏附于損傷部位，導致炎癥反應加重[35?36]。本實驗Western Blot結果表明LPS的刺激可引起MAEC中MCP-1的表達明顯增加，經EEP處理后可以有效降低MCP-1的表達，說明EEP有抑制炎癥處單核細胞的聚集，減輕血管內皮細胞的炎癥反應。

4 結論

綜上所述，LPS的刺激可以誘導MAEC炎癥的發生并降低其細胞活性。EEP能降低促炎因子IL-6、TNF-α的含量，抑制黏附因子ICAM-1、VCAM-1和趨化因子MCP-1的表達，抑制炎性細胞在血管內膜的遷移及其在病變部位的趨化作用，減少單核細胞的黏附，緩解血管內膜的炎性損傷，發揮了良好的抗炎作用。