藍(lán)莓酵素的體外抗氧化及對(duì)秀麗隱桿線蟲的氧化應(yīng)激保護(hù)作用

王高堅(jiān)，王珍珍，李嘉嘉，范昊安，沙如意, ，毛建衛(wèi),2,

（1.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江杭州 310023；2.浙江工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江紹興 312000）

食用酵素是以一種或多種新鮮蔬菜類、水果類、谷豆類、海藻類、食藥兩用本草類、菌菇類等食材為原料，加（或不加）糖類物質(zhì)，經(jīng)多種有益菌通過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵而生產(chǎn)的功能性微生物發(fā)酵產(chǎn)品[1]，擁有豐富的次生代謝產(chǎn)物，益生菌等功能性成分，特別是富含小分子功能成分，研究表明該類產(chǎn)品具有抗衰老、抗菌消炎、抗癌、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力及解毒等多種保健功能[2?4]。

藍(lán)莓，又名越橘（VacciniumSpp），杜鵑花科越橘屬[5]，原產(chǎn)于北美，目前國(guó)內(nèi)藍(lán)莓種植主要分布在云南、江浙、山東及東北三省[6]。因其果實(shí)中含有大量多酚、花青素、氨基酸、膳食纖維、維生素等物質(zhì)，而被廣泛栽培種植。但其果實(shí)成熟后極易變軟破碎，且采摘季節(jié)主要在夏季，極大增加了運(yùn)輸和儲(chǔ)藏的成本。目前，我國(guó)市場(chǎng)銷售的藍(lán)莓產(chǎn)品主要以果汁果酒類、蜜餞類、果醬類等[7]粗加工產(chǎn)品為主，對(duì)于藍(lán)莓發(fā)酵產(chǎn)品如藍(lán)莓果酒、果醋，酵素等研究主要集中于工藝、功效及風(fēng)味物質(zhì)等[8]，而對(duì)其作用機(jī)理還有待研究開(kāi)發(fā)[9]。鑒于有關(guān)藍(lán)莓加工產(chǎn)品的抗氧化作用及其作用機(jī)制的報(bào)道較少，本文研究了藍(lán)莓酵素發(fā)酵過(guò)程中主要代謝產(chǎn)物變化及體外抗氧化指標(biāo)，并結(jié)合秀麗隱桿線蟲模型，對(duì)藍(lán)莓酵素的體內(nèi)抗氧化能力進(jìn)行綜合考量，以期為藍(lán)莓的深加工以及高附加值產(chǎn)品開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大興安嶺野生藍(lán)莓 浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；白砂糖（食品級(jí)） 太古糖業(yè)（中國(guó)）有限公司；酵液（含酵母菌、乳酸菌，醋酸菌等）浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；野生型秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，Bristol N2），雌雄同體、尿嘧啶合成缺陷型大腸桿菌（E.coliOP50） 上海南方模式生物科技股份有限公司；2,2′-偶氮二異丁脒鹽酸鹽（2,2′-Azobis（2-methylpropionamidine） dihydrochloride，AAPH）、三羥甲基氨基甲烷（Tris(hydroxymethyl)methyl aminomethane，Tris）、熒光素鈉（fluorescein，F(xiàn)L）、水溶性維生素E（6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic Acid，Trolox） 上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；脂質(zhì)氧化（MDA）檢測(cè)試劑盒、過(guò)氧化氫酶（CAT）檢測(cè)試劑盒、總超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）測(cè)定試劑盒 碧云天生物技術(shù)有限公司。

20 L不銹鋼（316L）發(fā)酵罐 浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；FS-750T超聲波細(xì)胞破碎機(jī) 上海生析超聲儀器有限公司；LRH-150恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SpectraMax iD5多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)美谷分子儀器公司；奧林巴斯SZ680體視顯微鏡 日本Olympus公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藍(lán)莓酵素的制備 用無(wú)菌水沖洗新鮮藍(lán)莓（果實(shí)成熟且無(wú)蟲害潰爛），自然瀝干后，將藍(lán)莓和白砂糖以質(zhì)量比1:1加入高壓蒸汽滅菌過(guò)的20 L不銹鋼發(fā)酵罐中，并加入適量酵液，于（20±5）℃下發(fā)酵，定期取樣，將樣品于10000 r/min下離心10 min，取上清，置于?80 ℃超低溫冰箱中保藏，待測(cè)[4]。

1.2.2 總花青素含量的測(cè)定 采用pH示差法測(cè)定藍(lán)莓酵素中總花青素含量[10]，取0.5 mL酵素樣品，分別用0.2 mol/L KCl-HCl緩 沖溶液（pH1.0）和0.2 mol/L NaAc-HAc緩沖溶液（pH4.5）的緩沖液稀釋50倍，于23 ℃下靜置15 min后，在510 nm和700 nm處測(cè)定其吸光值。

總花青素含量計(jì)算采用以下公式如下：

X為花青素含量，mg/mL；Mw為相對(duì)分子質(zhì)量，以矢車菊3-O-葡糖糖苷為參照，其值為449.2；Df為稀釋倍數(shù)；?為摩爾消光系數(shù)，其值為26900；L為光程，其值為1。

1.2.3 總酚含量的測(cè)定 采用福林酚法[11]測(cè)定藍(lán)莓酵素中總酚含量。取5 μL酵素樣品，用去離子水稀釋至0.5 mL，加入2.5 mL 10%的福林酚溶液（v/v），避光靜置3 min后，加入2 mL 75 g/L Na2CO3溶液，混勻。25 ℃反應(yīng)1 h，在765 nm處測(cè)定吸光度。并以沒(méi)食子酸作為標(biāo)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 總黃酮含量的測(cè)定 采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法[12]測(cè)定藍(lán)莓酵素中總黃酮含量。取500 μL酵素樣品加入60%乙醇溶液（v/v）至5 mL，加入0.3 mL 10%的NaNO2溶液（m/v），混合均勻，放置 3 min；加入0.3 mL 10%的Al（NO3）3溶液（m/v），靜置6 min；加入2.0 mL 8%NaOH溶液（m/v），用60%乙醇定容至10 mL，混勻靜置15 min，在500 nm處測(cè)定吸光度值。并以蘆丁作為標(biāo)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 取5 μL酵素樣品，用去離子水稀釋至2 mL，加入0.1 mmol/L DPPH-甲醇溶液4 mL，50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH7.4）450 μL，于25 ℃恒溫反應(yīng)30 min，以去離子水為空白對(duì)照溶液，在517 nm處測(cè)定吸光度[13]。自由基清除率計(jì)算如式（3）所示：

其中A0是空白對(duì)照液的吸光度，A1為樣品吸光度，A2為樣品本底管的吸光度。

1.2.6 還原力的測(cè)定 取5 μL酵素樣品，去離子水補(bǔ)至1 mL，加入1 mL 10 g/L鐵氰化鉀，混合均勻，于50 ℃反應(yīng)30 min，再加入1 mL 100 g/L三氯乙酸，混合均勻，靜置10 min取1 mL上清液，加入去離子水1 mL和200 μL 1 g/L三氯化鐵，混勻。以去離子水為空白對(duì)照溶液，在700 nm處測(cè)定吸光度[14]，還原力的強(qiáng)弱用吸光度大小來(lái)表示。

1.2.7 氧自由基吸收能力（oxygen-radical absorbance capacity，ORAC） 參考Grajedaiglesias等[15]方法略加改動(dòng)。取10 μL藍(lán)莓酵素發(fā)酵液，用75 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.4）稀釋20倍得樣品待測(cè)液。向96孔板各孔加50 μL稀釋后的樣品，隨后每孔加入100 μL 0.02 μmol/L FL 37 ℃孵化20 min，迅速加入50 μL 30 mmol/L AAPH溶液，在激發(fā)波長(zhǎng)480 nm和發(fā)射波長(zhǎng)530 nm處連續(xù)測(cè)定100 min，每分鐘測(cè)定一次各孔熒光強(qiáng)度，直至熒光衰減呈基線為止，循環(huán)100次。配制1、2、4、8、16 μmol/L Trolox溶液，重復(fù)上述操作。計(jì)算結(jié)果以Trolox當(dāng)量表示（μmol TE/mL）。

計(jì)算公式如下：

其中：f0為初始點(diǎn)熒光值；f100為第100次循環(huán)時(shí)的熒光值,fi為第i次循環(huán)時(shí)的熒光值；AUCsample、AUCblank，AUCFL分別為樣品組熒光信號(hào)積分面積、空白孔熒光信號(hào)積分面積（未加FL）和樣品空白組熒光信號(hào)積分面積。

1.2.8 線蟲培養(yǎng)和同期化 本文所用線蟲均在含有大腸桿菌OP50的NGM平板上，20 ℃下進(jìn)行培養(yǎng)。取藍(lán)莓酵素與大腸桿菌OP50菌液（OD值=0.6）等體積混勻后，取40 μL涂布于NGM平板上。同期化后的線蟲分別在給藥板和只含有大腸桿菌OP50的NGM上培養(yǎng)[16]。

為保證實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，選取體內(nèi)含有大量蟲卵的成蟲NGM板，用5 mL M9緩沖液反復(fù)沖洗平板，直至將大部分線蟲沖下并轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中；8000 r/min離心2 min，棄上清后加入3 mL裂解液重懸，裂解3 min后加入5 mL M9緩沖液終止裂解；8000 r/min下離心1 min，棄去上清液；加入M9緩沖液重懸，洗滌3～5次。離心棄去上清液后，加入5 mL M9緩沖液，置于20 ℃恒溫培養(yǎng)過(guò)夜，即得到大量L1期線蟲。

1.2.9 線蟲急性氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn) 同期化的L4期線蟲（蟲齡4 d）轉(zhuǎn)移至NGM給藥平板中（分別含有用E.coliOP50菌液稀釋10、20、40倍的藍(lán)莓酵素，并記作LM-10、LM-20、LM-40），其中對(duì)照組僅含E.coliOP50菌液。每板含50條線蟲。20 ℃培養(yǎng)2 d后，將各組線蟲轉(zhuǎn)移至24孔板中，記為急性氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)的第0 h。每組6孔，每孔5條，孔內(nèi)預(yù)先加入400 μL M9緩沖液（含終濃度為5 mmol/L H2O2）。每間隔1 h觀察線蟲存活及死亡數(shù)目并記錄，直至所有線蟲死亡[17]。

1.2.10 線蟲體內(nèi)活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）含量測(cè)定 線蟲分組處理同急性氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)，孔內(nèi)預(yù)先加入150 μL M9緩沖液。每孔加入終濃度25 μmol/L的DCFH-DA溶液，37 ℃避光反應(yīng)，采用酶標(biāo)儀于激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)535 nm處檢測(cè)熒光值。每間隔20 min檢測(cè)1次，共反應(yīng)3 h，每次讀數(shù)前振蕩[18]。計(jì)算公式如下：

其中AUC樣品組、AUC對(duì)照組分別為樣品組和對(duì)照組熒光信號(hào)積分面積

1.2.11 線蟲體內(nèi)丙二醛含量、抗氧化酶系水平的測(cè)定 線蟲分組處理同急性氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)。用M9緩沖液將線蟲沖洗至離心管中，于4 ℃，1000 r/min離心10 min，去除上清液，重復(fù)清洗2～3次。加入0.5 mL M9緩沖液重懸線蟲，并于冰浴條件下超聲破碎2 min。超聲條件如下：超聲功率400 W，超聲2 s，間隔2 s。于4 ℃，12000 r/min離心10 min，取上清液按照試劑盒說(shuō)明書步驟測(cè)定線蟲體內(nèi)丙二醛（malondialdehyde，MDA）、抗氧化酶系水平及蛋白質(zhì)濃度[19]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）的形式表示。采用Origin 8.6軟件繪制圖表，SPSS 24軟件進(jìn)行相關(guān)性和單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過(guò)程中總花青素含量變化

研究表明，藍(lán)莓中的花青素主要是飛燕草素、矮牽牛素、錦葵色素等，并且多以糖苷的形式存在，具有抗氧化、抗癌、抗動(dòng)脈粥樣硬化、保護(hù)肝臟等功效[20]。本文參考植物酵素行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB T 5323-2018對(duì)取樣間隔時(shí)間進(jìn)行選擇。如圖1所示，發(fā)酵前期，花青素含量迅速上升，在發(fā)酵第50 d時(shí)達(dá)到了0.52±0.01 mg/mL，這可能是藍(lán)莓果中的花青素不斷溶出所形成的[21]。但隨后，花青素含量開(kāi)始迅速下降并隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)下降速度逐漸減緩，直至300 d時(shí)趨于穩(wěn)定。這可能是隨著發(fā)酵的進(jìn)行，總花青素通過(guò)微生物代謝轉(zhuǎn)化成了其他小分子物質(zhì)如酚酸類物質(zhì)。大量研究表明，在微生物作用下，花青素可被脫去糖基，轉(zhuǎn)化為酚酸和醛酮類等小分子物質(zhì)。Cheng等[22]研究表明腸道菌群可將花青素轉(zhuǎn)化為綠原酸、隱綠原酸、阿魏酸等酚酸類物質(zhì)，韋仕靜[21]研究發(fā)現(xiàn)桑葚酵素在發(fā)酵過(guò)程中花青素含量不斷下降，且伴隨著原兒茶酸、高香草酸、肉桂酸等酚酸類物質(zhì)的增加。

圖1 發(fā)酵過(guò)程中總花青素含量的變化Fig.1 Changes of total anthocyanin content during fermentation

2.2 發(fā)酵過(guò)程中總酚含量變化

水果中的多酚及黃酮類物質(zhì)能夠消除體內(nèi)的自由基，并且攝入一定量的水果還可以減緩細(xì)胞氧化損傷、保護(hù)心腦血管、減少癌癥發(fā)生概率等[23]。總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：y=0.0057x+0.0236R2= 0.9991。由圖2可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，藍(lán)莓酵素總酚含量不斷上升，發(fā)酵前40 d，總酚含量快速上升至2.45±0.02 mg/mL，一是由于多酚類物質(zhì)不斷溶出，二是一些大分子酚類物質(zhì)被微生物分解為小分子的酚類化合物[24]。發(fā)酵中后期，藍(lán)莓酵素總酚含量呈緩慢上升的趨勢(shì)，在發(fā)酵后期逐漸趨于穩(wěn)定。并在第300 d時(shí)達(dá)到2.81±0.02 mg/mL，這一結(jié)果要遠(yuǎn)高于藍(lán)莓果酒[25]（1.31 mg/mL），總酚含量變化與花青素含量變化呈負(fù)相關(guān)性，這也符合上述花青素可能轉(zhuǎn)化為其他酚類物質(zhì)的猜想。

圖2 發(fā)酵過(guò)程中總酚含量的變化Fig.2 Changes of total phenolic content during fermentation

2.3 發(fā)酵過(guò)程中黃酮含量變化

黃酮類物質(zhì)具有抗氧化、抗炎、抗病毒等功效。富含黃酮的果蔬加工制品可以預(yù)防多種慢性疾病，如癌癥、糖尿病、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病。研究表明攝入一定量的黃酮類物質(zhì)能夠有效預(yù)防糖尿病及其并發(fā)癥的產(chǎn)生與發(fā)展[26]。總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：y=0.3531x+0.0241R2= 0.9999。如圖3所示，在發(fā)酵前30 d，藍(lán)莓酵素總黃酮含量快速上升。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，總黃酮含量出現(xiàn)輕微波動(dòng)，于發(fā)酵第300 d達(dá)到3.17±0.02 mg/mL，其值明顯高于文獻(xiàn)中報(bào)道的未經(jīng)發(fā)酵的夏普藍(lán)1.18±0.07 mg/g、奧尼爾1.21±0.02 mg/g等[27]。上述結(jié)果表明，長(zhǎng)期發(fā)酵有助于提高藍(lán)莓酵素中黃酮類物質(zhì)的含量。

圖3 發(fā)酵過(guò)程中黃酮含量變化Fig.3 Changes of total flavonoid content during fermentation

2.4 發(fā)酵過(guò)程中DPPH自由基清除能力變化

藍(lán)莓酵素發(fā)酵過(guò)程中對(duì)DPPH自由基清除能力的變化如圖4所示，隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，DPPH自由基清除率呈現(xiàn)迅速上升后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。發(fā)酵前60 d，DPPH自由基清除能力快速上升至54.25%±0.46%。發(fā)酵第91 d，清除率達(dá)到最大值55.07%±0.93%，之后清除率變化趨于平穩(wěn)。Pertuzatti等[28]研究表明藍(lán)莓具有較好的清除DPPH自由基的能力，且其清除率變化趨勢(shì)與多酚，黃酮變化趨勢(shì)較為接近，由此推測(cè)藍(lán)莓酵素發(fā)酵過(guò)程中DPPH自由基清除率的變化可能是多酚類物質(zhì)有關(guān)。

圖4 發(fā)酵過(guò)程中DPPH自由基清除率的變化Fig.4 Changes of DPPH radical scavenging activity during fermentation

2.5 發(fā)酵過(guò)程中還原力變化

如圖5所示，藍(lán)莓酵素在發(fā)酵過(guò)程中還原力呈現(xiàn)先迅速上升后逐漸趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。發(fā)酵40 d與發(fā)酵10 d相比，提高了40.63%；發(fā)酵到143 d后還原力達(dá)到最高0.357±0.01，之后趨于穩(wěn)定。發(fā)酵300 d后，還原力提升了42.27%。這一結(jié)果要明顯高于蔣增良等[2]制備的藍(lán)莓酵素，說(shuō)明發(fā)酵有助于提高還原力水平。

圖5 發(fā)酵過(guò)程中還原力的變化Fig.5 Changes of reducing power during fermentation

2.6 發(fā)酵過(guò)程中ORAC值變化

自由基是生物體生命活動(dòng)中由細(xì)胞產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，自由基的清除和產(chǎn)生應(yīng)是處于動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，但當(dāng)失去平衡時(shí)，大量的自由基堆積，易引起諸多疾病[29]。ORAC方法模擬了體內(nèi)環(huán)境中抗氧化劑與自由基反應(yīng)的情況，表示抗氧化物在特定的生理pH下對(duì)氧自由基的抑制作用。如圖6所示，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，藍(lán)莓酵素ORAC值逐漸增大，在91 d時(shí)達(dá)到最大值86.09±4.1 μmol TE/mL。相較于西蘭花酵素（12.23±0.21 μmol TE/mL）、藍(lán)莓果（67.5±1.2 μmol TE/mL）、葡 萄 酒 醋（11.5±1.1 μmol TE/mL）[30]，藍(lán)莓酵素的氧自由基的吸收能力更強(qiáng)。

圖6 發(fā)酵過(guò)程中氧自由基吸收能力（ORAC）變化Fig.6 Changes of oxygen-radical absorbance capacity during fermentation

2.7 發(fā)酵過(guò)程中體外抗氧化活性與活性成分相關(guān)性分析

對(duì)藍(lán)莓酵素發(fā)酵過(guò)程中的功能成分與體外抗氧化活性進(jìn)行Pearson法相關(guān)性分析，結(jié)果如表1所示，藍(lán)莓酵素發(fā)酵過(guò)程中體外抗氧化活性和總酚、總黃酮含量存在極顯著的相關(guān)性（P＜0.01），說(shuō)明藍(lán)莓酵素中的多酚類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)具有抗氧化能力。總酚含量與總花青素存在極顯著的負(fù)相關(guān)性（P＜0.01），這一結(jié)果也與花青素含量下降可能是轉(zhuǎn)化成具有抗氧化活性的酚酸類小分子物質(zhì)的猜想相符。

表1 發(fā)酵過(guò)程中各參數(shù)相關(guān)性Table 1 Correlation of parameters during fermentation

2.8 藍(lán)莓酵素對(duì)線蟲氧化應(yīng)激能力的影響

綜合考量總酚、總黃酮、花青素等物質(zhì)的變化情況及藍(lán)莓酵素體外抗氧化效果，選擇發(fā)酵第300 d的藍(lán)莓酵素進(jìn)行線蟲實(shí)驗(yàn)。研究表明，雙氧水會(huì)誘導(dǎo)線蟲體內(nèi)細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[31]。如圖7所示，對(duì)照組、LM-40、LM-20，LM-10的平均壽命分別為7.95±0.58、8.4±0.51、9.05±0.50、9.7±0.51 h。相較于對(duì)照組，LM-10組生存曲線顯著右移（P＜0.05），表明藍(lán)莓酵素能夠顯著增強(qiáng)線蟲的抵抗氧化應(yīng)激能力，從而減緩雙氧水對(duì)線蟲的氧化脅迫。藍(lán)莓酵素含有的黃酮、多酚等抗氧化活性成分，一方面可能抑制了與線蟲體內(nèi)與自由基生成相關(guān)的酶如脂氧化酶、髓過(guò)氧化酶等的活性，另一方面抗氧化活性成分能夠增強(qiáng)線蟲體內(nèi)抗氧化酶活性，從而起到抗氧化作用，因而提高了線蟲氧化應(yīng)激能力[32]。

圖7 藍(lán)莓酵素對(duì)秀麗隱桿線蟲雙氧水刺激下壽命的影響Fig.7 Effect of blueberry Jiaosu on lifespan of C. elegans under hydrogen peroxide

2.9 藍(lán)莓酵素對(duì)線蟲體內(nèi)ROS相對(duì)含量的影響

細(xì)胞內(nèi)的ROS過(guò)量產(chǎn)生，會(huì)導(dǎo)致大量有害反應(yīng)的發(fā)生，如脂質(zhì)過(guò)氧化、DNA突變和蛋白質(zhì)變性等，它與癌癥、心血管疾病，衰老等多種疾病密切有關(guān)[33]。由圖8可知，LM-40、LM-20、LM-10的ROS水平較對(duì)照組均顯著降低，分別減少了12.01%±7.49%、44.18%±7.49%和49.15%±3.75%，經(jīng)藍(lán)莓酵素處理后可有效降低線蟲體內(nèi)的ROS含量，且隨著藍(lán)莓酵素濃度的增加，線蟲體內(nèi)的ROS含量逐漸減少，呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系。

圖8 藍(lán)莓酵素對(duì)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ROS含量的影響Fig.8 Effect of blueberry Jiaosu on ROS in C. elegans

2.10 藍(lán)莓酵素對(duì)線蟲體內(nèi)MDA含量的影響

過(guò)量的ROS會(huì)與細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)，從而導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物MDA的堆積。其具有一定的細(xì)胞毒性，因此其含量可以反映生物體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，間接反映出細(xì)胞受損情況。由圖9可知，相較于對(duì)照組，LM-40、LM-20，LM-10組線蟲體內(nèi)MDA含量分別降低了17.14%±2.44%、27.56%±2.95%、52.44%±3.17%，且呈劑量依賴性。相較于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組均可極顯著抑制MDA的生成（P＜0.001）。鄭飛[34]研究表明藍(lán)莓中粗多糖可以顯著提高小鼠體內(nèi)的超氧化物歧化酶和乳酸脫氫酶活性，并降低丙二醛含量，從而延長(zhǎng)小鼠壽命。這與本實(shí)驗(yàn)線蟲作為模型結(jié)果相一致。

圖9 藍(lán)莓酵素對(duì)線蟲體內(nèi)MDA含量的影響Fig.9 Effect of blueberry Jiaosu on MDA in C. elegans

2.11 藍(lán)莓酵素對(duì)線蟲體內(nèi)抗氧化酶的影響

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）是內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分[35]。可以催化分解胞內(nèi)O2?、·OH、H2O2等ROS基團(tuán)，有利于維持機(jī)體的平衡狀態(tài)，延緩線蟲衰老[36]。由圖10a中可知，經(jīng)藍(lán)莓酵素處理后能夠顯著提高線蟲體內(nèi)SOD活力，且存在一定劑量依賴關(guān)系。相比與對(duì)照組，LM-40組、LM-20組、LM-10組分別提高了0.81、2.30、3.38倍（P＜0.01，P＜0.001，P＜0.001）。由圖10b可知，經(jīng)藍(lán)莓酵素處理后，LM-40組、LM-20組、LM-10組CAT酶活分別為對(duì)照組的1.08、1.28、2.44倍，僅LM-10組的CAT水平較對(duì)照組顯著提升（P＜0.01）。由圖10c可知，各處理組的GSH-Px活力均無(wú)顯著性差異（P＞0.05），說(shuō)明藍(lán)莓酵素對(duì)線蟲體內(nèi)GSHPx活性無(wú)明顯影響，這與楊金月[37]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，這可能是因?yàn)榫€蟲體內(nèi)的主要抗氧化酶為SOD和CAT，兩者在抵御氧化損傷上起著關(guān)鍵作用[38]。由此可知，藍(lán)莓酵素主要通過(guò)上調(diào)SOD、CAT水平，以提升線蟲體內(nèi)抗氧化能力，從而減緩衰老。Peng等[39]研究藍(lán)莓提取物可使果蠅的壽命延長(zhǎng)10%并伴隨著SOD、CAT以及Rpn11相關(guān)基因的上調(diào)。Wang等[40]研究表明藍(lán)莓提取物可以通過(guò)上調(diào)抗氧化相關(guān)基因（sod-3、cat-1、mev-1、skn-1、sek-1和nhr-8）的表達(dá)，進(jìn)而增加抗氧化酶基因的表達(dá)，提高線蟲對(duì)氧化應(yīng)激的抵抗力，延緩線蟲的衰老。綜上所述，藍(lán)莓酵素可能是通過(guò)上調(diào)抗氧化基因?qū)崿F(xiàn)了抗氧化應(yīng)激能力的提升。

圖10 藍(lán)莓酵素對(duì)線蟲體內(nèi)抗氧化酶的影響Fig.10 Effect of blueberry Jiaosu on antioxidant enzyme in C. elegans

3 結(jié)論

藍(lán)莓經(jīng)長(zhǎng)期自然發(fā)酵后，制備得藍(lán)莓酵素。總酚、總黃酮含量有了顯著的提升；發(fā)酵第300 d，總酚含量達(dá)2.81±0.02 mg/mL，總黃酮含量達(dá)3.17±0.02 mg/mL。總花青素含量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，花青素含量變化與總酚、總黃酮含量變化呈負(fù)相關(guān)性。通過(guò)體外抗氧化實(shí)驗(yàn)（還原力測(cè)定、DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)、氧化自由基吸收能力測(cè)定），證明發(fā)酵后藍(lán)莓酵素的體外抗氧化能力有了明顯的提高，分別可達(dá)0.347±0.01、53.86%±1.40%、77.88±1.49 μmol TE/mL，且抗氧化功效與總酚、總黃酮含量呈極顯著相關(guān)性。并以秀麗隱桿線蟲為模型，評(píng)價(jià)了藍(lán)莓酵素在體內(nèi)的抗氧化水平。結(jié)果表明，藍(lán)莓酵素是通過(guò)上調(diào)了內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)組成部分CAT與SOD的酶活水平并且降低線蟲體內(nèi)的ROS和MDA含量，從而達(dá)到有效減緩由H2O2引起的氧化應(yīng)激，延長(zhǎng)線蟲的存活時(shí)間。本研究闡明了藍(lán)莓酵素發(fā)酵代謝產(chǎn)物及其與抗氧化功效間的相關(guān)性，并且為深入探究其作用機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。