微生物磷脂酶D的克隆表達研究進展

董自星，楊爽爽，唐存多，姚倫廣，闞云超

（1.南陽師范學院昆蟲生物反應器河南省工程實驗室和河南省南水北調中線水源區生態安全重點實驗室, 河南南陽 473061；2.南陽師范學院體育學院, 河南南陽473061）

磷脂酶是指催化磷脂的各種水解反應的一類酶。根據水解磷脂位置的不同，可以將磷脂酶分為五類：磷脂酶A1、A2、B、C和D。其中，磷脂酶D（Phospholipase D，簡稱PLD，EC 3.1.4.4）是作用于磷脂分子中磷酸與有機堿間磷酰氧鍵（P-O）的一類酶[1]。作為磷酸二酯酶超家族的一員，PLD是催化磷脂水解第一步反應的關鍵酶之一，參與細胞脂質代謝、信號轉導及生物膜形成等[2]。此外，它還可以催化各種羥基化合物與磷脂堿基結合形成新的磷脂，這一重要的特性稱為磷脂酶D的堿基交換反應（Base exchange reaction），也稱為轉磷脂反應（Transphosphatidylation）[3]。利用PLD的這一重要特性可以合成稀有磷脂（如磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油以及新型甘油醚磷脂等）[4?6]、新型藥物釋放系統[7]等。因此，PLD被廣泛應用于細胞生物學、食品和醫藥等領域。

磷脂酶D廣泛分布于病毒、動物、植物和微生物中[3]。由于具有較好的轉磷脂活性、較廣泛的底物特異性和較強的底物耐受性，微生物來源的磷脂酶D在工業生產中的應用較為廣泛。自20世紀70年代以來，已報道的PLD主要來源于革蘭氏陽性菌，包括鏈霉菌屬（Streptomyces）[8?10]、輪枝鏈霉菌屬（Streptoverticillium）[11]、馬杜拉放線菌屬（Actinomadura）[12]、芽胞桿菌屬（Bacillus）[13]、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）[14]和 熱 密 卷 菌 屬（Thermocrispum）[15]等。其中，鏈霉菌來源的PLD是目前報道最多的，且它們具有較好的水解和轉磷脂活性[1]。一些革蘭氏陰性菌也具有PLD活性，如不動桿菌屬（Acinetobacter）[4]、希瓦氏菌屬（Shewanella）[16]、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）[17]、大腸桿菌屬（Escherichia）[18,19]、沙門氏菌屬（Salmonella）[20]、變形桿菌屬（Proteus）[20]、假單胞菌屬（Pseudomonas）[20]、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）[21]和弧菌屬（Vibrio）[22]等。此外，少數酵母菌和絲狀真菌也能生產PLD，包括酵母屬（Saccharomyces）[23]、假絲酵母屬（Candida）[24]、裂 殖 酵 母 屬（Schizosaccaromyces）[25]、曲 霉 屬（Aspergillus）[26]、地霉屬（Geotrichum）[27]和鐮刀菌屬（Fusarium）[28]等。

目前，國外對微生物PLD的研究已較為成熟，一些酶制劑公司已篩選出高產PLD的鏈霉菌菌株。但鏈霉菌較長的生長周期（近7 d）給實際生產和應用帶來了許多困難，而且商品化PLD的價格非常昂貴，如Sigma-Aldrich公司的Streptomycessp. PLD酶制劑，每毫克售價約一千元人民幣左右。而目前國內由微生物發酵制備PLD的研究才剛剛起步，基本上都停留在實驗室水平，還沒有相關的PLD產品。隨著應用研究的不斷深入，對微生物PLD的屬性特別是生物活性與生化特征多樣性的需求也越來越迫切。因此，如何獲得催化性能優良的PLD，并實現其大規模生產成為當前研究的核心任務。除了從自然界中篩選、誘變育種和原生質體融合等傳統方法，通過分子克隆與基因重組技術將pld基因進行克隆表達，也是實現其高效表達的一條有效途徑。本文先對已克隆的微生物PLD的來源、基因序列和轉磷脂活性進行了比較，然后同時從分子水平和發酵水平對其高效表達方面的研究進展進行了分析，并對其未來的發展趨勢進行了展望。

1 微生物磷脂酶D的克隆

獲得具有優良催化特性、適合工業化應用的酶源是實現其大規模工業化生產的物質基礎。目前已克隆的微生物磷脂酶D大部分來源于細菌（主要是鏈霉菌），少部分來源于酵母和絲狀真菌，但只有細菌來源的PLD被表達（表1）。其中，細菌PLD一般由307～587個氨基酸殘基組成，其單體的相對分子質量為29.0～64.0 kDa，而已克隆的酵母和真菌PLD比較大，由833～1823個氨基酸組成，其理論分子量為95.7～204.8 kDa。進化樹的分析表明，已克隆表達的細菌來源PLD可以分為三類：I和III類主要來源于鏈霉菌屬，對磷脂酰絲氨酸的轉化率為4%～91.4%；而II類PLD則來源于其它細菌，它們對磷脂酰絲氨酸的轉化率較高，可達到86%～100%（圖1）[4,19]。其中，ArPLD沒有水解活性，只有轉磷脂活性，它對磷酯酰絲氨酸和二十二碳六烯酸-磷脂酰絲氨酸的轉化率和選擇性均為100%，這是目前已報道的唯一具有此優良催化特性的磷脂酶D[4]。此外，微生物PLD一般含有兩個高度保守的、與催化活性有關的HXKX4D（X為任意氨基酸，簡稱HKD）基序，其中一個His是攻擊磷原子的親核基團，而另一個His是酸堿催化劑。由圖2可知，I類PLD含有兩個保守的HKD基序，二者之間相差247～364 aa；II類PLD也含有兩個保守的HKD基序。其中，第一個HKD基序與I類PLD的第一個HKD基序是對應的，但第二個HKD不相互對應，且兩個HKD基序相差123～216 aa。而III類PLD的兩個HKD基序分別是HXKX3D和HXKX7D[29]，而且它們不是高度保守的，二個基序之間相差12 aa。其中，CpPLD和TsPLD不含有HKD基序，它們中可能參與催化的兩個His用粗體標出[15]。

圖1 進化樹描述細菌來源PLDs的親緣關系Fig.1 Phylogenetic tree describing the genetic distances among bacterial PLDs

表1 微生物來源磷脂酶D的克隆表達Table 1 Various microbial PLDs that have been cloned and expressed

續表 1

2 微生物磷脂酶D的高效表達策略

2.1 分子水平

2.1.1 表達系統的選擇與優化 重組蛋白的表達調控是一個復雜的系統，構建表達系統需要特定的元件，它們的配置對蛋白的表達有著重要影響。選擇合適的表達系統（包括表達宿主和表達載體）是高水平生產重組酶的第一步。其中，表達載體通常包括啟動子、信號肽、密碼子、核糖體結合位點、轉錄終止子和拷貝數等（圖3）。通過對這些基因調控元件進行優化、改造并加以組合，可以提高微生物來源PLD的表達量。迄今為止，已有不少研究者對微生物來源PLD進行了克隆表達的嘗試。由表1可知，目前PLD的異源表達主要是在大腸桿菌中進行的，也有少數在畢赤酵母、解脂耶氏酵母、變鉛鏈霉菌、谷氨酸棒桿菌以及枯草芽胞桿菌中進行克隆表達的報道。

圖3 微生物PLDs高效表達的相關策略Fig.3 Strategies for the high-efficiency expression of microbial PLDs

2.1.1.1 PLD在大腸桿菌中的克隆表達 由于生長迅速、培養成本低廉，大腸桿菌成為微生物PLD的主要異源表達系統。但在大腸桿菌中對PLD進行異源表達時，它們對表達宿主有明顯的毒害作用[45]，或影響其細胞生長[9,13]，或引起重組質粒大量丟失[39]，這是導致其表達量較低的重要原因。因此，應該采取措施減少PLD對細胞的毒性，比如將PLD進行分泌表達或細胞表面展示。目前，在大腸桿菌中克隆表達pld基因時，所采用的質粒大多數不含信號肽，如pETDuet、pET-21a （+）、pET-23a （+）、pET-24a （+）、pET-28a （+）、pET-30b （+）以及pET-32b （+）等。因此，所表達的重組PLD均為胞內酶，且酶活較低（表1）。雖然李斌等[10]、Songer等[14]、Iwasaki等[36]以 及Xiong等[37]分 別 嘗 試 采 用PelB或PLD自身信 號肽將ScPLD2、CpPLD和SaPLD2分泌到大腸桿菌細胞外，但獲得的重組PLD主要分布在胞內或周質空間。而Zambonelli等[9]雖然采用PelB信號肽將SsPLD3在大腸桿菌的胞外進行了表達，但其胞外酶活只有15 mU/mL，且胞內也有積累。2017年，陳可泉等[46]進一步根據大腸桿菌的密碼子偏好性將該酶進行了密碼子優化，使該酶的胞外表達量提高了近20倍。此外，Zhang等[34]通過將自主轉運蛋白ADIA-1的序列、信號肽CtxB的N端序列與SgPLD的序列融合后，使其在大腸桿菌的表面進行了展示，其酶活為0.39 U/mL。

選擇合適的表達宿主、降低誘導溫度或將PLD表達成包涵體等也是降低其對細胞毒性的重要措施。Xiong等[37]通過使用嚴謹型啟動子PBAD、在表達質粒中插入pSC101的par區域以及大腸桿菌recA突變株等策略保持質粒的穩定遺傳，同時根據大腸桿菌的密碼子偏好性進行密碼子優化、補加天冬氨酸或天冬酰胺等、18 ℃飽和誘導以及施加NaCl脅迫，從而緩解了SaPLD2對宿主細胞的毒性，延長了其合成時間，使其PLD在5 L發酵罐中的酶活和比產率分別達到120 U/mL和4300 U/（L·h），是目前發酵罐上報道的最高水平。

2.1.1.2 PLD在其它表達系統中的克隆表達 近年來，研究者們也嘗試采用畢赤酵母、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）、變鉛鏈霉菌和枯草芽胞桿菌等表達系統對PLD進行高效表達。為減少PLD對細胞的毒性，克隆表達主要是在胞外或細胞表面進行的。2012年，張瑩[39]將ShPLD分別在畢赤酵母、解脂耶氏酵母和變鉛鏈霉菌中進行了分泌表達，搖瓶發酵水平上，其胞外酶活分別為1.0、0.2和69.12 U/mL，其中變鉛鏈霉菌中的PLD酶活是目前報道的搖瓶發酵水平上的最高酶活。2019年，劉逸寒等[40]進一步采用Flolp錨定信號序列將該磷脂酶D在畢赤酵母表面進行了展示，使其酶活達到315 U/g細胞干重。此外，該研究團隊還將ScPLD2和S. septatusTCCC 21057來源PLD進行了密碼子優化，并分別在畢赤酵母中進行了表面展示和分泌表達，其酶活分別為0.0884 U/mg和2.37 U/mL[35,41]。Matsumoto等[42]和Ogino等[11]分別將SsPLD4和ScPLD3在變鉛鏈霉菌中進行了分泌表達，其胞外酶活分別為9.6 U/mg和55 U/mL （表達量為118 mg/L），純化后的比酶活分別為384和468 U/mg，遠高于商品化PLD的比酶活（30～150 U/mg）[21]。2009年，路福平課題組[19]將EcPLD2在枯草芽胞桿菌的胞外進行了表達，重組酶的胞外酶活為1.68 U/mL。2011年，Nakazawa等[43]利用大腸桿菌-變鉛鏈霉菌穿梭質粒將SrPLD在變鉛鏈霉菌中進行了分泌表達，搖瓶水平的酶活為30 U/mL，比野生菌的酶活提高了近90倍。2018年，Huang等[44]進一步將該PLD在枯草芽胞桿菌WB600的胞外進行了表達，胞外酶活為1.8 U/mL；再通過對信號肽、表達載體、核糖體結合位點以及spacer區進行優化，使其搖瓶中胞外酶活提高了約12.4倍，達到24.2 U/mL，15 L發酵罐中的酶活達到116.2 U/mL。

綜上所述，PLD對宿主細胞有一定的毒害作用，應采用分泌表達、細胞表面展示等方法減少其毒性。而目前微生物來源PLD的異源表達主要是在大腸桿菌的胞內進行的，所獲得的重組酶容易形成包涵體，且活性較低，后期分離純化較為困難，難以進一步實現其高水平表達。與大腸桿菌相比，PLD在枯草芽胞桿菌、畢赤酵母、解脂耶氏酵母、變鉛鏈霉菌中的表達量較高，而且更容易實現分泌表達或表面展示。因此，使用這些表達系統可能更有利于實現PLD的高效表達。此外，目前的研究只集中于對一種或幾種表達元件進行優化，這也很難提高PLD的表達量，應該將它們進行改造、優化并加以組合。

2.1.2 分子改造 微生物PLD中含有兩個保守HKD活性基序，這兩個保守序列是酶活性中心，任意氨基酸的改變都會影響PLD的催化活性。因此，通過對這些關鍵氨基酸殘基進行定點突變，可以提高其催化效率和比酶活，從而可以間接提高其表達量。徐銀鳳等[47]發現BcPLD只含有一個HKD保守序列，而另外一個是HRD（圖2）。通過定點突變將HRD突變為HKD后，使其酶活提高了10%左右。另外，Fedeli等[45]將SsPLD3中兩個高度保守的HKD基序中的His167、His440、Lys169和Lys442分別進行定點突變后，其表達量顯著提高，而且突變體的空間結構沒有明顯改變，但它們完全失活。Yang等[30]的研究也表明，將ScPLD1中保守HKD基序的His187和His200突變為Ala后，其二級結構發生改變且酶活顯著下降；但若將其突變為Asn，突變體的酶活和結構則沒有明顯變化。Ogino等[48]證明了ScPLD3中兩個HKD基序中的GG和GS基序（特別是絲氨酸殘基，圖2）會影響酶的轉磷脂活性和穩定性，其中突變體G215S、G216S和G216S/S489G的轉磷脂活性是野生酶的9～27倍。此外，通過定向進化也可以提高PLD的表達量。Zhang等[34]采用DNA shuffling將大腸桿菌表面展示的SgPLD進行改造后，使其酶活提高了約90%，達到0.074 U/mL。

2.2 發酵水平

2.2.1 培養基成分優化 培養基中的氮源、氮源以及表面活性劑等會影響PLD的表達量（圖3）。大量研究表明，葡萄糖和蛋白胨分別是PLD生產的最佳碳源和氮源。如Chiaki等[11]研究發現，在2 L發酵罐中對重組變鉛鏈霉菌進行發酵，當起始葡萄糖濃度為17.5 g/L，且同時補加葡萄糖和胰蛋白胨時，重組酶ScPLD3的酶活和表達量分別從20 U/mL和42 mg/L提高到55 U/mL和118 mg/L。進一步將該重組菌進行固定化，且同時在起始培養基中添加葡萄糖和胰蛋白胨時，重組酶的胞外表達量提高了1倍[49]。表面活性劑可以提高細胞膜的通透性，從而可以提高蛋白質的胞外表達量。Yang等[18]研究了不同的表面活性劑對EcPLD1表達量的影響，其中0.4%曲拉通X-100可以使其胞外酶活從3.2 U/mL提高到13.5 U/mL。此外，曲拉通X-100也對SsPLD4的水解活性有顯著影響[42]。而韓海霞等[50]則發現30 g/L吐溫20可以使鏈霉菌CA-1的PLD活性提高了4.5倍，達到1.198 U/mL。

2.2.2 發酵條件優化 研究表明，發酵條件也是影響PLD表達量的重要因素之一。所用的發酵菌株和發酵設備不同，則其PLD發酵條件也不同，應該通過優化進行確定。劉逸寒等[51]通過單因素實驗對細胞表面展示表達PLD的重組畢赤酵母菌株GS115/pKFS-pld的搖瓶發酵培養條件（包括誘導溫度、起始pH、甲醇濃度、裝液量及轉速等）進行了優化，使其酶活提高了44%。進一步對5 L發酵罐的分批補料培養條件（包括甘油流加速度、甲醇流加模式）進行優化后，使其產酶水平比搖瓶提高了53%。Iwasaki等[36]研究了培養基、誘導溫度和誘導OD600nm對重組大腸桿菌表達SaPLD2的影響，在最佳培養條件下重組酶的酶活比原來提高了18.3倍，達到了3.47 U/mL。

2.2.3 固定化 固定化細胞發酵產酶可以提高產酶效率、發酵穩定性好、縮短發酵周期和提高設備利用率。Ogino等[49]利用生物質載體顆粒對重組變鉛鏈霉菌進行固定化，使其能連續8個批次穩定生產PLD，2個批次后其發酵周期從48 h降低到24 h，酶活提高了8倍多，達到15 U/mL。Fukuda等[52]采用多孔顆粒將S.cinnamoneumNBRC12852固定化后，將其進行連續分批發酵，磷脂酶D的生產效率達到57.9 IU/（L·h），比原來提高了1倍多。

3 結語

目前克隆表達的主要是鏈霉菌PLD，它們對磷脂酰絲氨酸的轉化率偏低。隨著分子生物學技術的發展，以ArPLD為探針，采用基因組挖礦或宏基因組技術可以獲得催化性能更優異、更適合工業化應用的II類PLD酶源，為其大規模生產提供良好的物質材料。目前PLD的異源表達主要是在大腸桿菌中進行的，但PLD對細胞的毒性限制了其表達。可以嘗試其它表達系統，還可以構建新的表達系統或多個磷脂酶D基因共表達系統，進而實現其高效制備。此外，目前的研究中只采取了一種或少數幾種高效表達策略，在提高PLD的表達量方面效果有限。后續研究應同時使用更多策略，如：綜合運用表達元件的分子改造與組合、PLD的分子改造、發酵工藝優化以及固定化等技術，同時從分子水平和發酵水平上實現微生物PLD的高豐度表達；同時運用單因素實驗、響應面優化以及遺傳算法等實驗設計技術進一步從發酵水平上提高PLD的表達量。隨著研究的不斷深入，相信我國微生物PLD的高效制備與工業應用研究必將進入一個新的歷史階段。