苗期注射接種法快速鑒定番茄青枯病抗性水平的研究

李林章，高天一，古斌權(quán)

（寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 寧波 315040）

番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）是我國重要的蔬菜作物之一，據(jù)不完全統(tǒng)計，目前我國番茄種植面積將近133.3萬hm2，其種植面積和產(chǎn)量均居世界首位；然而，在番茄長期連續(xù)地生產(chǎn)過程中，其土傳病害的發(fā)生日趨嚴重。番茄青枯病是由茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一種世界范圍內(nèi)毀滅性的土傳病害，在我國長江流域及其以南地區(qū)普遍發(fā)生，造成番茄大幅度減產(chǎn)，甚至絕收，經(jīng)濟損失巨大，嚴重威脅了我國番茄產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。目前，該病在生產(chǎn)中尚無較好的防治方法，選育抗病品種仍是最有效的解決途徑[1]。

在番茄青枯病抗病育種過程中，材料的抗性鑒定和篩選是最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。當(dāng)前主要應(yīng)用的抗性鑒定方法為田間自然鑒定和人工接種鑒定。田間自然鑒定是在創(chuàng)造利于發(fā)病的自然條件下進行田間鑒定的，而影響田間發(fā)病的因素很多，如氣候條件、土壤環(huán)境及病原微生物數(shù)量等，該方法需要建立病圃、鑒定周期長、耗費人力大，結(jié)果不穩(wěn)定，重復(fù)性差，不同年份鑒定結(jié)果經(jīng)常存在差異。人工接種鑒定可以克服以上田間自然鑒定的不足，其環(huán)境條件相對可控，大大提高鑒定結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性，但目前常用的浸根法或傷根灌注法，對于大量的群體材料苗期抗性鑒定仍存在一些缺點，如幼苗接種后需二次重新種植、接種需要菌液量大，耗時費工，效率較低[2-4]。本試驗擬通過注射接種法對番茄苗期青枯病抗性進行鑒定，并與傳統(tǒng)傷根接種法比較，為番茄苗期青枯病抗性水平鑒定提供一種簡便快捷的檢測方法。

1 材料和方法

1.1 試驗時間及地點

試驗于2019年11月在寧波市高新農(nóng)業(yè)技術(shù)實驗園區(qū)玻璃溫室及人工氣候室進行。

1.2 試驗材料

番茄鑒定材料：合作903（上海虹橋天龍種業(yè)有限公司）、桂砧1號（廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜研究所）、TZ-1（寧波市農(nóng)科院蔬菜研究所）。

青枯病病原：采集田間番茄青枯病自然發(fā)病株（寧波市鄞州區(qū)五鄉(xiāng)鎮(zhèn)番茄種植基地），并在實驗室進行病原分離、培養(yǎng)和鑒定。

1.3 試驗方法

1.3.1 番茄鑒定材料幼苗準備

選取番茄鑒定材料的健康種子若干，經(jīng)浸種、催芽后，播種于經(jīng)消毒滅菌的基質(zhì)育苗盤，待幼苗1葉1心時，分苗至經(jīng)消毒滅菌的50孔基質(zhì)育苗穴盤中培養(yǎng)，每穴盤定苗30株，待幼苗生長至5～6片葉時接種。

1.3.2 青枯病病原菌液制備

將經(jīng)實驗室分離、培養(yǎng)、鑒定的青枯病菌株于TZC瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，于30 ℃條件下培養(yǎng)48 h，挑取單菌落轉(zhuǎn)移至NA培養(yǎng)基平板培養(yǎng)，于30 ℃條件下培養(yǎng) 48 h，挑取單菌落用無菌水稀釋成濃度分別為1×108cfu/mL、1×107cfu/mL、1×106cfu/mL的菌液備用。

1.3.3 病原菌接種方法

1.3.3.1 注射接種法 番茄幼苗生長至5～6片葉時接種。使用國標6號針頭（對應(yīng)內(nèi)徑為0.34 mm）注射器，吸取菌液若干。將針頭對準幼苗第1節(jié)莖中部，沿莖斜下方向穿刺莖部后將針頭退回至莖內(nèi)部刺入點處，將菌液緩緩注入（待有菌液溢出即可），每株注射量約0.1 mL。

1.3.3.2 傷根接種法 將番茄幼苗從穴盤取出，經(jīng)清水輕輕洗凈根部，用剪刀剪掉根部1/3，然后再定植于經(jīng)消毒滅菌的基質(zhì)育苗穴盤中，同時將20 mL菌液倒入幼苗根部。

1.3.4 試驗設(shè)計

注射接種法設(shè)置了3種不同的菌液濃度處理，分別為1×108cfu/mL（T1）、1×107cfu/mL（T2）、1×106cfu/mL（T3），以無菌水為空白對照（CK0），另以傳統(tǒng)傷根接種法為接種方法對照，接種濃度為1×108cfu/mL。每個鑒定材料、每處理接種幼苗30株，3次重復(fù)。

1.3.5 抗性觀測鑒定

接種后，將幼苗置于溫度28～30 ℃，空氣相對濕度70%以上的人工氣候室進行培養(yǎng)，保持基質(zhì)濕度60%左右。期間觀測幼苗發(fā)病情況，于接種后第7、14天進行統(tǒng)計。

根據(jù)番茄青枯病病情分級標準確定0、1、2、3、4等5個發(fā)病等級，再根據(jù)發(fā)病株數(shù)及發(fā)病等級計算病情指數(shù)，最后根據(jù)發(fā)病率及病情指數(shù)確定鑒定材料青枯病抗性水平。病情分級標準為0級：無癥狀；1級：1片葉萎蔫；2級：2～3片葉萎蔫；3級：4片及以上葉萎蔫；4級：全株萎蔫或死亡。

計算公式為：發(fā)病率＝發(fā)病株數(shù)/接種總株數(shù)×100%；病情指數(shù)（DI）＝Σ（級數(shù)×發(fā)病株數(shù)）/（最高病情級數(shù)×總株數(shù)）×100。

抗性水平判定標準為抗（R）：0＜DI≤25；中抗（MR）：25＜DI≤50；中感（MS）：50＜DI≤75；感（S）：DI＞75。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同材料、不同處理下番茄青枯病發(fā)病率及病情指數(shù)的鑒定結(jié)果

由表1數(shù)據(jù)可以看出，總體上，注射接種法與傳統(tǒng)傷根接種法相比，青枯病發(fā)病病程明顯加快，其發(fā)病程度明顯加重，且3種不同材料、不同處理間表現(xiàn)趨勢基本一致。試驗中，在1×108cfu/mL相同接種濃度下，合作903、桂砧1號以及TZ-1注射接種法接種后第7天病情指數(shù)分別為60.0、60.8、58.3，明顯高于傳統(tǒng)傷根接種法接種后第7天病情指數(shù)（10.0、43.5、16.7）；注射接種法接種后第14天病情指數(shù)分別為83.3、75.0、60.0，傳統(tǒng)傷根接種法接種后第14天病情指數(shù)分別為76.7、64.2、27.5，同樣是前者高于后者。從結(jié)果可以看出，注射接種法可使病程變短，后期病情指數(shù)增加較慢，趨于穩(wěn)定，而傳統(tǒng)傷根接種法，發(fā)病病程較長，接種后第14天病情指數(shù)較接種后第7天病情指數(shù)明顯增加。注射法直接將菌液注入植株莖部輸導(dǎo)組織，減少了病原菌根部侵入及向上蔓延擴展過程，使得發(fā)病更加迅速，一般接種后第3天開始便有明顯癥狀出現(xiàn)，至第7天，參試接種材料發(fā)病率即達到85%（T1）。不同接種濃度處理表明，隨著注射接種菌液濃度的增加，其發(fā)病率及病情指數(shù)亦相應(yīng)增加，且在3種不同番茄材料間表現(xiàn)出相同的規(guī)律。

2.2 注射接種法與傷根接種法鑒定結(jié)果的比較

傳統(tǒng)傷根接種法一般以接種后第14天的發(fā)病結(jié)果作為評價材料抗性水平的依據(jù)[5]，本試驗中，以傳統(tǒng)傷根接種法，接種濃度為1×108cfu/mL，接種后第14天的病情指數(shù)鑒定結(jié)果為：合作903鑒定為感病（S），桂砧1號為中感（MS），TZ-1為抗病（R），其中合作903鑒定結(jié)果與楊琦鳳等[6]報道結(jié)果相同，桂砧1號鑒定結(jié)果與郭堂勛等[2]報道結(jié)果相同。比較不同材料，不同接種濃度第7、14天的病情指數(shù)，結(jié)果表明，通過注射接種法（接種濃度為1×107cfu/mL）接種后第7天的病情指數(shù)與傳統(tǒng)傷根接種法（接種濃度為1×108cfu/mL）接種后第14天的鑒定結(jié)果一致（除合作903外），說明注射接種法可以在更短的時間內(nèi)對材料的抗性水平進行鑒定（表1）。

表1 不同品種、不同處理青枯病發(fā)病率及病情指數(shù)

3 小結(jié)與討論

番茄青枯病是世界性的毀滅性病害，目前最為有效的途徑仍是選育抗病番茄品種或嫁接砧木，其中對育種群體材料的抗性進行快速而準確的鑒定是提高抗病育種效率的關(guān)鍵[3]。青枯病抗性鑒定接種方法很多[5]，傳統(tǒng)中仍以傷根接種法使用較多，認為接種效果穩(wěn)定，鑒定結(jié)果可靠。本試驗結(jié)果表明，通過注射接種法對番茄苗期青枯病抗性鑒定提供了可能性。青枯病病原菌侵染過程一般先附著于番茄根系表面，由根部傷口侵入皮層及維管束薄壁組織，逐漸沿木質(zhì)部向上蔓延、擴展，在此過程中病原菌分泌產(chǎn)生胞外多糖蛋白等物質(zhì)，引起導(dǎo)管堵塞，木質(zhì)部水分運輸功能減弱，使植株產(chǎn)生萎蔫癥狀[6]。 注射接種法直接將菌液接種于莖部輸導(dǎo)組織，使其病程明顯縮短，后期病情指數(shù)增加較慢，趨于穩(wěn)定；因此，接種后第7天便可以統(tǒng)計抗性鑒定結(jié)果，本試驗中，通過注射接種法（接種濃度為1×107cfu/mL）接種后第7天的病情指數(shù)與傳統(tǒng)傷根接種法（接種濃度為1×108cfu/mL）接種后第14天的鑒定結(jié)果基本一致。

試驗中，感病材料合作903的發(fā)病病程明顯比抗病材料TZ-1快，抗病材料TZ-1在接種后第7天及第14天，其病情指數(shù)增加較感病材料合作903慢，推測抗病材料能一定程度地抑制病原菌在體內(nèi)的增殖或限制病原菌活動功能，表現(xiàn)出延緩發(fā)病，但具體抗病機理有待于進一步研究證實[1]。

另外，注射接種法操作簡單，接種效率高，與傳統(tǒng)傷根接種法相比，可提高接種效率6～8倍；針尖細小，接種物理損傷小，本試驗中空白對照無菌水接種，其材料均無明顯發(fā)病癥狀，結(jié)果假陽性率低；直接注射，接種量小且易控制，需要菌液少，但接種后發(fā)病迅速，結(jié)果假陰性率亦低。接種濃度以及接種時期的選擇是鑒定結(jié)果準確性的重要考慮因素，本試驗在前期預(yù)試驗基礎(chǔ)上，以國標6號針頭，接種濃度1×107cfu/mL，幼苗5～6片葉時為最為適宜。

注射接種法與傳統(tǒng)傷根接種法比較，具有接種量小、接種效率高、鑒定時間短等諸多優(yōu)點，非常適合作為抗病育種早期世代大量群體材料的苗期抗性快速鑒定篩選，淘汰早期感病材料。前人研究表明，番茄青枯病抗性遺傳機制相當(dāng)復(fù)雜，存在苗期抗性與成株期抗性不一致現(xiàn)象[5]，為確保鑒定結(jié)果的可靠性，對篩選的抗性材料可進行進一步成株期接種鑒定。