蜂膠提取物對脂多糖誘導小鼠急性乳腺炎及乳腺屏障功能的保護作用

宋美潔，歐愛群,2，薛曉鋒，吳黎明，壽旗揚，王凱?

1中國農業科學院蜜蜂研究所，北京 100093；2福建農林大學動物科學學院（蜂學學院），福州 350000；3浙江中醫藥大學第二臨床醫院，杭州 310027

0 引言

【研究意義】奶牛乳腺炎是由多種因素引起并嚴重影響奶牛業發展的重要疾病，造成了世界范圍內乳業的巨大經濟損失，如產奶量下降，牛奶品質降低，疾病治療費用的增加等，至今尚未有徹底解決的辦法[1-2]。乳腺炎的發生取決于宿主、病原和環境因素的相互作用，而病原微生物侵染是導致奶牛乳腺炎的主要原因，其中環境性致病菌的危害尤以大腸桿菌感染突出，可導致奶牛食欲不振、死亡率升高等，嚴重損害奶牛群體健康[3-5]。而大腸桿菌中的脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）可引起乳腺的嚴重炎癥反應[6]，是大腸桿菌的關鍵毒力因子[7]。當前，采用抗生素治療奶牛乳腺炎而導致的細菌耐藥性增強及抗生素殘留，給人類健康帶來巨大威脅[8]。因此，有必要探索一種綠色、安全、高效的防治乳腺炎的方法。【前人研究進展】蜂膠是由西方蜜蜂（ApismelliferaL.）工蜂采集植物樹脂等分泌物與其上顎腺、蠟腺等分泌物混合形成的膠黏性物質，其富含酚酸和黃酮類化合物，具有多種生物學活性與藥理作用[9-10]。多種研究表明蜂膠可有效殺滅乳腺炎致病菌，可作為佐劑以增強疫苗的免疫力，且一些研究將蜂膠用于制作乳腺擦劑和乳頭保護膜來抵御乳腺炎，已被應用于獸醫臨床[11-14]。另一方面，乳腺上皮細胞間緊密連接結構形成的屏障結構是乳腺炎在發生過程中防止有害物質進入血液和選擇性釋放細胞因子進入乳汁腔的重要關卡，也是血液和乳汁腔內有機交互的關鍵，對于奶牛的泌乳啟動、維持和退化均有重要意義[15]，血乳屏障功能主要依靠上皮細胞完整性及細胞間連接方式協同實現。緊密連接是構成血乳屏障完整結構的主要成分，其主要由咬合蛋白（occludin）、緊密連接蛋白（claudin-1）等連接而成，并與閉鎖小帶緊密連接蛋白-1（ZO-1）及細胞骨架蛋白直接或間接結合，形成穩定的連接結構，任何蛋白的丟失均可導致其結構完整性的破壞[16]。【本研究切入點】盡管筆者前期研究證實蜂膠對于各種病原微生物引起的乳腺上皮細胞炎癥有明顯的改善作用[11,17]，但蜂膠抗乳腺炎的系統研究仍很匱乏，對抗乳腺炎的作用機制仍未清楚，特別是蜂膠與乳腺屏障功能和緊密連接間的作用機制也需在體內試驗層面上進一步探究。系統挖掘蜂膠對乳腺炎的保護作用機制和藥效物質基礎，將對蜂膠在奶牛乳腺炎防治中的應用產生重大的指導意義。【擬解決的關鍵問題】富含生物活性化合物的低蠟蜂膠提取物最常用乙醇作為溶劑進行提取[18-20]。此外，小鼠乳腺炎模型已被證明可模擬牛乳腺炎，并且可用于研究乳腺炎病原體在乳腺內感染的特異性宿主免疫應答，是一種有效、可重復的體內替代方法[21-22]。故本次研究通過建立LPS誘導的小鼠乳腺組織炎性損傷模型，在明確中國蜂膠乙醇提取物中主要活性組分的基礎上，從體內試驗的層面上來探索、闡明中國蜂膠乙醇提取物（ethanol extract of Chinese propolis, EECP）對LPS誘導乳腺炎的作用機制，以期為蜂膠在防治奶牛乳腺炎的應用上提供新的思路和潛在藥物靶點，進一步并為后續研究提供理論依據。

1 材料與方法

動物試驗于2019年10—11月在浙江中醫藥大學動物實驗中心完成。其余試驗于2019年7月至2020年1月、2020年10月在中國農業科學院蜜蜂研究所完成。

1.1 主要材料與試劑

蜂膠樣品為中國楊樹型蜂膠，于2017年11月采自山東省泰安市實驗蜂場。

實驗動物與飼養條件：動物試驗在浙江中醫藥大學實驗動物中心實施（試驗設施執照為 SYXK-JING-2015-0046）。32只雌性 ICR 小鼠（10周齡，30—32 g）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司（實驗動物質量認證號為SCXK-JING-2016-0006）。8只/籠飼養于光照（12 h晝夜循環）和溫度（20—23℃）穩定的房間內，并持續供應經過濾的無病原菌的空氣，保持室內相對濕度為50%。小鼠自由采食飲水，飲食供應為商業化無污染（SPF級）飼料。試驗嚴格遵守浙江中醫藥大學實驗動物中心實驗動物福利規章制度，并通過浙江中醫藥大學實驗動物中心實驗動物研究倫理學委員會批準執行。

主要試劑：咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、桑色素、咖啡酸苯乙基酯、柚皮素、芹菜素、柯因、楊梅素、槲皮素、高良姜素、松屬素、香草酸、短葉松素、短葉松素三乙酸酯、3,4-二甲氧基肉桂酸、沒食子酸、蘆丁等標準品（美國Sigma 公司）；色譜純甲醇、乙醇、乙腈（美國MREDA technology 公司）；脂多糖（Lipopo1ysaccharide 來源于大腸桿菌 0111：B4，美國Sigma公司）；黃蓍膠（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；無水乙醇、二甲苯、石炭酸 （國藥集團化學試劑有限公司）；4%多聚甲醛、地塞米松（Dexamethasone, DEX）（北京索萊寶科技有限公司）；蘇木素染液、伊紅染液 （上海碧云天生物技術有限公司）、天狼星紅染色液（杭州浩克生物科技有限公司）；Occludin 抗體、ZO-1 抗體（美國Proteintech公司）；ELISA檢測試劑盒（武漢華美生物有限公司）；DAB顯色試劑盒（美國Abcam公司）；CarryHelix RNA 提取試劑盒（北京佳利恒達生物科技有限公司）、PrimeScript RT Master kit反轉錄試劑盒、TB Green?Premix Ex Taq II試劑盒（日本Takara 公司）；RT-qPCR引物（生工生物工程技術服務有限公司）；一抗（Occludin、ZO-1）、羊抗兔二抗（HRP）（美國proteintech 公司）。

1.2 主要儀器

N-EVAP112氮吹儀購自美國 Organomation公司；SY-2000旋轉蒸發儀購自南京昕儀生物科技有限公司；KQ-500超聲清洗儀購自杭州法特超聲波科技有限公司；6470B UHPLC-QqQ-MS/MS購自美國Agilent公司；Milii-Q純水機購自美國Millinpore公司；Nanodrop 2000型分光光度計、PCR擴增儀和熒光定量 PCR儀均購自美國 Thermo Fisher公司；DYY-6D型電泳儀購自上海華科實驗器材有限公司；SpectraMax iD5酶標儀購自美谷分子儀器（上海）有限公司；微孔板恒溫振蕩儀購自上海虔鈞科學儀器有限公司；組織脫水機購自北京世紀科信科學儀器有限公司；石蠟包埋機購自輔光精密儀器（上海）有限公司；石蠟切片機購自杭州艾普儀器設備有限公司；光學顯微鏡購自北京博恒遠科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 中國蜂膠乙醇提取物的制備 參考文獻[23]的方法，將采集到的蜂膠敲碎，稱取100 g的粗蜂膠粉末，加入 95% 乙醇1L，放在超聲儀中40℃超聲3 h，取出燒杯靜置過夜后取上清。將獲得的上清液旋轉蒸發至恒重，放入冰箱中-20℃保存待用。

1.3.2 超高效液相色譜串聯三重四級桿質譜（UHPLC-QqQ-MS/MS）分析EECP多酚類化合物 采用超高效液相色譜三重四級桿串聯質譜儀對EECP中多酚類物質進行成分分析，在負離子模式下用色譜柱proshell 120 SB-C18色譜柱（2.1 mm × 100 mm，2.7 μm）進行提取物分離。流動相由甲酸水（0.1% v / v）溶液（A）和乙腈（B）組成，流速為0.25 mL·min-1，40℃下梯度洗脫。梯度洗脫程序如下：0—1 min，5%B；1—6 min，5%—55% B；6—20 min，55%—95% B；20—27 min，95% B。進樣體積為2 μL，后運行時間為3 min。質譜條件如下：氣體溫度為300℃；氣體流速為11 L·min-1；噴霧器壓力為40 psi；毛細管電壓為3 500 v；鞘氣溫度為350℃；鞘氣流速為10 L·min-1。

使用 Mass Hunter軟件（版本 B 8.0，Agilent Technologies）進行分析并獲得LC-MS數據。試驗重復 3次，試驗結果以平均值±標準差（mean±SD）表示。

1.3.3 小鼠乳腺炎模型建立 將32只ICR母鼠隨機分為4組，每組8只，試驗分組與設計如下：

空白對照組：灌胃 7d黃蓍膠溶液（0.5%），最后一天灌胃1 h后經呼吸麻醉機異氟烷氣體，麻醉后進行仰臥保定，將其第四、五對乳區用75%的酒精進行消毒，用滅菌后的眼科剪剪去乳頭尖端 1mm，暴露出乳導管，之后用圓鈍型微量注射器吸取生理鹽水緩慢注入到乳導管中，經注射處理后，置于籠中飼養24 h后，仰臥保定；摘除眼球處死，用75%的酒精對小鼠腹部進行消毒，收集乳腺組織；部分組織置于4%的多聚甲醛，剩余組織-80℃保存待用。處死前4 h最后一次灌胃0.5%的黃蓍膠溶液（圖1）。

模型組：灌胃7 d黃蓍膠溶液（0.5%），最后一天灌胃1 h后經呼吸麻醉機異氟烷氣體，麻醉后進行仰臥保定，將其第四、五對乳區用75%的酒精進行消毒，用滅菌后的眼科剪剪去乳頭尖端 1 mm，暴露出乳導管，之后用圓鈍型微量注射器吸取LPS緩慢注入到乳導管中，經LPS（1 mg·kg-1）注射處理后，置于籠中飼養24 h后，仰臥保定；摘除眼球處死，用75%的酒精對小鼠腹部進行消毒，收集乳腺組織；部分組織置于4%的多聚甲醛，剩余組織-80℃保存待用。處死前4 h最后一次灌胃0.5%的黃蓍膠溶液。

中國蜂膠乙醇提取物試驗組：灌胃7 d 100 mg·kg-1的中國蜂膠乙醇提取物，最后一天灌胃1 h后經呼吸麻醉機異氟烷氣體，麻醉小鼠，第四、五對乳頭管灌注1mg·kg-1的LPS，24 h后處死，處死前4 h最后一次灌胃中國蜂膠乙醇提取物。

陽性對照組：灌胃 7 d 5 mg·kg-1的地塞米松（dexamethasone, DEX），最后一天灌胃1 h后后經呼吸麻醉機異氟烷氣體，麻醉小鼠，第四、五對乳頭管灌注1 mg·kg-1的LPS，24 h后處死，處死前4 h最后一次灌胃DEX。

1.3.4 乳腺病理切片的制作及觀察 將乳腺組織從小鼠體內分離，立即用4%的多聚甲醛進行固定，12 h后換相同固定液，繼續固定12 h，后石蠟包埋，切片。將制作好的石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ20 min-二甲苯Ⅱ20 min-無水乙醇Ⅰ10 min-無水乙醇Ⅱ10 min-95%酒精5 min-90%酒精5 min-80%酒精5 min-70%酒精5 min-蒸餾水洗。

蘇木精-伊紅染色：將切片放入蘇木素染液中染色20 min；用分化液分化30s；自來水浸泡15 min；用伊紅染液復染2 min；用自來水浸泡2 min。用95%乙醇脫水2次，再用100%乙醇脫水2次，每次為1 min。經脫水后的切片放入二甲苯石炭酸（3﹕1）中1 min，再放入二甲苯（Ⅰ）、二甲苯（Ⅱ）中各 1 min，用中性樹膠封固，鏡下觀察。

天狼猩紅染色液染色： 切片入飽和苦味酸天狼猩紅染色液內染色8min，后將切片入無水酒精漂洗數分鐘，用中性樹膠封固，鏡下觀察。

1.3.5 乳腺組織炎癥因子IL-1β、IL-6和IL-10的檢測 稱取小鼠乳腺組織100 mg，剪成小塊放入1.5 mL的離心管中，按照ELISA試劑盒說明書要求進行操作。

1.3.6 乳腺組織緊密連接蛋白基因mRNA表達測定

（1）RNA提取 稱取20 mg左右的乳腺組織，加600 μL的組織裂解液，用電動勻漿儀勻漿。將組織勻漿均勻接種到六孔板中，每個處理3個重復。先往組織勻漿中加入15 μg·mL-1的EECP預處理2 h，接著加LPS（1 μg·mL-1）處理12 h，收集處理好的組織。參考王蓓等[25]的方法，采用 CarryHelix RNA 提取試劑盒進行乳腺組織總RNA的提取。

（2）cDNA合成 按照 PrimeScript RT Master kit反轉錄試劑盒要求操作加樣，反應體系如表1所示。37℃反應15 min、85℃反應5 s，反轉錄的cDNA保存在-20℃。

表1 RNA反轉錄反應體系Table 1 RNA reverse transcription reaction system

（3）引物設計與合成 試驗所用引物均由上海生工生物有限公司合成，引物序列信息見表2。

表2 實時熒光定量PCR相關引物序列Table 2 The primer sequence of related genes in RT-qPCR

（4）熒光定量PCR 以cDNA為模板，按照 TB Green? Premix Ex Taq II試劑盒要求操作加樣，反應體系如表3所示。以GAPDH作為管家基因，利用相對定量（ΔΔCт）法進行基因相對表達量的計算。

表3 實時熒光定量PCR反應體系Table 3 Real-time fluorescent quantitative PCR reaction system

1.3.7 乳腺組織緊密連接蛋白免疫組織化學染色病理切片的制作參照 1.3.4，-20℃冷凍保存。取出切片室溫放置30 min，丙酮固定30 min，用PBS清洗；用3% H2O2甲醇液孵育30 min，然后，PBS清洗；用一抗工作液（Occludin：1﹕100；ZO-1﹕1﹕50）37℃孵育1 h后4℃過夜；PBS清洗，用二抗工作液（1﹕1 000）37℃ 孵育1 h；PBS清洗，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素，在37℃下孵育30 min；PBS清洗，用 DAB試劑顯色；最后，脫水，透明，中性樹膠封閉，在顯微鏡下拍照觀察。

1.4 數據處理與分析

結果以平均值±標準差（Mean±SD）表示，利用one-way ANOVA法進行數據差異顯著性分析，經統計分析軟件SPSS 21.0處理數據并作圖。P＜0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 超高效液相色譜串聯三重四級桿質譜（UHPLCQqQ-MS/MS）分析多酚類化合物方法學評價

蜂膠提取物中的功能活性成分與多酚類化合物的種類和含量相關，試驗首先基于超高效液相色譜串聯三重四級桿質譜（UHPLC-QqQ-MS/MS），對色譜條件及質譜參數進行了優化，建立了相應的液相色譜串聯質譜方法，具體試驗參數詳見1.3.2。通過添加回收率來驗證方法準確性。在 5、10、20 μg·mg-1共 3 個添加水平下，進行蜂膠提取物的添加回收試驗，結果表明：蜂膠提取物中17種多酚類化合物的添加回收率在70.2%—120.1%范圍內（表4），可實現EECP中多酚類成分的精確定量。

表 4 中國蜂膠乙醇提取物中代表性多酚類化合物的回收率和精密度Table 4 Recoveries and precisions of the 17 polyphenols in Chinese poplar propolis

2.2 UHPLC-QqQ-MS/MS法測定中國蜂膠乙醇提取物中主要多酚類成分

課題組前期采用福林酚法和硝酸鋁法測定EECP中總酚酸和總黃酮含量，測得該中國山東楊樹型蜂膠乙醇提取物中總酚酸含量為106.35 mg GAE·g-1，總黃酮含量為320.85 mg RE·g-1[17]。本研究進一步利用超高效液相色譜串聯三重四級桿質譜對EECP中主要的化學成分進行分析，結果如表5所示，EECP中的多酚類成分主要包括咖啡酸、咖啡酸苯乙酯、柯因、高良姜素、松屬素、短葉松素、3, 4-二甲氧基肉桂酸以及短葉松素三乙酸酯，其中又以高良姜素（12.88±0.57 μg·mg-1）、短葉松素 3-乙酸酯（12.93±0.59 μg·mg-1）、松屬素（8.56±0.27 μg·mg-1）和短葉松素（8.52±0.25 μg·mg-1）的含量最高。

表5 中國蜂膠乙醇提取物中主要的多酚類物質成分Table 5 Major polyphenolic constituents in EECP

2.3 中國蜂膠乙醇提取物對 LPS誘導小鼠乳腺炎乳腺組織病理變化的影響

中國蜂膠乙醇提取物對LPS誘導小鼠乳腺炎乳腺組織病理切片觀察結果如圖2、3所示，H.E染色結果表明，對照組乳腺組織腺泡結構完整，無肉眼可見的病理變化，乳腺管和腺泡中沒有觀察到嗜中性粒細胞、巨噬細胞浸潤。LPS處理組可觀察到乳腺組織腺泡結構完整性遭到破壞，且伴隨有炎性細胞的浸潤。與LPS處理組相比，中國蜂膠乙醇提取物處理組和陽性對照組能夠有效減輕 LPS刺激下的炎性癥狀，如腺泡結構、大小較為正常，炎性細胞浸潤乳腺管和腺泡的數量減少。利用天狼星紅染色可見，乳腺管等膠原纖維被染成紅色，肌纖維被染成黃色，LPS刺激導致膠原陽性細胞數量減少，即藥物處理可有效提示膠原染色陽性細胞數量。這些結果也清楚說明中國蜂膠乙醇提取物對LPS誘導的小鼠乳腺細胞炎癥病理變化具有顯著的保護作用。

2.4 中國蜂膠乙醇提取物對 LPS誘導小鼠乳腺炎組織中炎癥因子表達的影響

利用ELISA法對LPS誘導小鼠乳腺炎乳腺組織中炎癥因子的表達量進行檢測。由圖 4可知，LPS處理組乳腺組織中IL-1β, IL-6和IL-10的表達量顯著高于空白對照組（P＜0.05），而連續灌胃一周中國蜂膠乙醇提取物的小鼠乳腺組織中，其炎癥因子的表達水平顯著低于LPS處理組（P＜0.05）。此外，陽性對照組與LPS處理組相比，對炎癥因子的抑制作用優于中國蜂膠乙醇提取物處理組；單因素差異分析發現，與陽性對照組相比，EECP處理組未表現出顯著差異（P＞0.05）。以上的結果說明，中國蜂膠乙醇提取物能夠抑制LPS刺激小鼠乳腺組織中炎癥因子的釋放。

2.5 中國蜂膠乙醇提取物對乳腺組織緊密連接蛋白mRNA轉錄水平的影響

由圖5可得，與空白組相比，LPS處理組顯著降低了乳腺組織中緊密連接蛋白Occludin、Cluadin-1、ZO-1mRNA的轉錄水平（P＜0.05）。對檢測連續灌胃一周100 mg·mL-1EECP小鼠其乳腺組織中緊密連接蛋白基因Occludin、Cluadin-1、ZO-1mRNA的轉錄水平顯著高于 LPS處理組（P＜0.05）。此外，陽性對照組（DEX處理組）與LPS處理組相比，緊密連接蛋白Occludin、Cluadin-1、ZO-1mRNA的轉錄量也顯著上升（P＜0.05）。而中國蜂膠提取物試驗組（EECP處理組）與陽性對照組（DEX處理組）的緊密連接蛋白Occludin、Cluadin-1、ZO-1mRNA的轉錄量差異不顯著，且其效果與陽性藥物地塞米松（5 mg·kg-1）相類似。

2.6 中國蜂膠乙醇提取物對乳腺組織緊密連接蛋白occludin、ZO-1表達的影響

對免疫組化結果（圖6，7）分析可得，在正常的乳腺組織中Occludin和ZO-1定位于細胞膜上，且細胞之間的緊密連接結構完整。但經乳頭管灌注 1 mg·kg-1的LPS后兩種蛋白的表達量顯著下降，細胞邊界變模糊且細胞間的空隙變大。與LPS處理組相比，中國蜂膠乙醇提取物處理組跟 DEX處理組乳腺組織中兩種緊密連接蛋白的表達量增加，細胞邊界變得清晰，細胞結構也較為完整。結果表明，中國蜂膠乙醇提取物能夠有效減弱LPS降低乳腺組織中緊密連接蛋白表達的作用效果，進而達到保護乳腺組織緊密連接的作用。

3 討論

近年來，本課題組一直致力于蜂膠在預防或治療炎癥性疾病方面的研究[11,17,23-27]。植物化學成分分析研究結果表明，本研究所使用的中國蜂膠乙醇提物（EECP）中主要活性組分包括柯因、高良姜素、咖啡酸苯乙酯、槲皮素和松屬素等多酚類化合物，此結果與前期有關蜂膠化學組成的研究報道基本一致[11,28-29]。這也為后續進一步研究單一組分對奶牛乳腺炎的預防治療作用及相關藥物研制提供參考。

乳腺炎是由乳房組織感染引起的炎癥反應，造成乳腺組織感染的因素復雜多樣，主要包括有外界刺激、生活環境、病原微生物和乳腺組織遭到機械損傷，而絕大部分奶牛乳腺炎由病原微生物粘附乳腺組織引起[1,3]。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的重要組成成分，據報道，LPS刺激乳腺組織后，會造成腺泡上皮細胞脫落、形狀和大小發生改變，并伴隨有炎性細胞（中性粒細胞）的大量浸潤以及乳腺組織發生充血，前人研究發現，灌胃高劑量蒲公英甾醇可使大鼠乳腺組織中乳腺腺泡上皮細胞脫落、組織出血等狀況顯著改善[30]。在本研究中，乳腺組織病理切片結果表明，EECP同樣能夠顯著減輕LPS誘導小鼠乳腺組織所引起的腺泡結構破壞及炎性細胞浸潤等病理損傷，表明EECP具有良好的抗乳腺炎效果。

此外，細胞因子是細胞間信息交換的關鍵信使分子，參與調節免疫穩態和炎癥反應。大量研究表明，蜂膠中的多酚類化合物能夠顯著抑制LPS刺激下乳腺組織中炎癥因子的表達[31-32]。而本研究中乳腺組織上清ELISA檢測結果表明，EECP可顯著抑制炎癥因子IL-1β、IL-6和IL-10的表達。故本研究進一步證實了EECP可通過減輕乳腺組織病理損傷和降低炎癥因子的表達來達到保護小鼠免受LPS侵害的作用。

上皮和內皮屏障的完整性是體內平衡所必需的，它是由稱為緊密連接的細邊緣結構維持的。在危重癥疾病中，緊密連接可能被破壞，導致屏障功能障礙，表現為毛細血管滲漏、肺水腫和多器官衰竭等。咬合蛋白存在于上皮和內皮之間的緊密連接中，是第一個被鑒定的完整膜緊密連接蛋白[33]。眾多研究表明咬合蛋白對緊密連接功能至關重要：咬合蛋白在 Madin-Darby犬腎臟（MDCK）細胞中的過表達可增強跨上皮電阻[34]；在敲除了咬合蛋白的小鼠中，發現緊密連接自身形態未受影響，經檢測其腸上皮屏障功能正常；然而，在胃、腦、肺以及睪丸等組織中發現了異常；結果表明咬合蛋白在維持緊密連接穩定和屏障功能正常等過程中發揮重要作用[35]。通常情況下，咬合蛋白的表達量一旦降低會造成血腦屏障、血睪屏障、肺上皮屏障以及腸上皮屏障等的破壞，繼而引發多種疾病的發生[36]。ZO-1即閉鎖小帶蛋白1，也是構成緊密連接的重要結構蛋白之一。它是膜相關信號分子家族的成員，可以充當分子支架，將跨膜蛋白組織到離散的質膜結構域，如上皮細胞間連接和神經突觸[37]。其次，緊密連接蛋白Claudins是構成緊密連接復合物的主要成分，它的異常表達可導致上皮細胞、內皮細胞的結構破壞及功能受損[38]。在本研究中，EECP處理組可顯著提升緊密連接蛋白基因（Occludin、ZO-1、Cluadin-1）mRNA的轉錄水平。基于熒光定量分析的結果，采用免疫組化實驗方法對Occludin和ZO-1蛋白進行定位和定量分析，發現 EECP組能顯著增強緊密連接蛋白在細胞膜的分布和表達。課題組前期通過體外細胞試驗證明，EECP可抑制炎癥因子IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α的表達，上調乳腺上皮細胞緊密連接蛋白Occludin、ZO-1的轉錄量并增加其在細胞間的分布[17]；桑色素已被證明能顯著降低 LPS誘導的TNF-α, IL-1β, IL-6,CCL2和CXCL2mRNA 的表達，并抑制LPS降低的Claudin-3、Occludin的表達[39]，本試驗結果與之相一致。綜合以上研究結果表明，EECP能顯著減輕LPS刺激所引起的乳腺組織緊密連接的破壞，證實了EECP對血乳屏障具有良好的保護作用。

4 結論

蜂膠作為一種動植物雙源性天然物質，具有包括抗菌、抗氧化、免疫調節等多種生物活性[40]，本研究表明，中國蜂膠乙醇提取物對細菌內毒素LPS誘導的小鼠乳腺炎具有良好的作用效果，具有替代傳統抗生素應用于奶牛乳腺炎防治的潛力。灌胃中國蜂膠提取物能夠顯著緩解 LPS注射導致的小鼠乳腺組織中炎性細胞浸潤、緩解乳腺腺泡結構損傷；同LPS組相比，中國蜂膠提取物灌胃處理可有效抑制 LPS導致的小鼠乳腺組織中炎癥因子的釋放，并可提高小鼠乳腺中緊密連接蛋白的mRNA表達，緩解LPS注射所導致的乳腺上皮細胞緊密連接的破壞。基于本研究結果，未來可進一步深入探索蜂膠抗乳腺炎的作用機理，這也將全面揭示蜂膠對乳腺炎的保護作用，并為蜂膠在制備奶牛乳腺炎預防藥品和開發蜂膠飼料添加劑中的實際應用提供理論指導。