CYP2C9、VKORC1基因多態性在PTE患者華法林抗凝治療中的應用分析

宮小薇，袁雅冬，貢瑩，田甜甜，康世威

(河北醫科大學第二醫院呼吸與危重癥醫學二科，石家莊 050000)

靜脈血栓栓塞癥包括深靜脈血栓形成和肺血栓栓塞癥(pulmonary thromboembolism，PTE)，年發病率為(100～200)/10萬，是第三大常見心血管疾病[1]。急性PTE是靜脈血栓栓塞癥最嚴重的一種類型。有研究顯示，肺栓塞的總發生率為5%～14%(高齡人群可達25%)，病死率達30%[2]，40歲以上人群年齡每增加10歲PTE的發生風險增加近1倍[3]。華法林在血栓性疾病深靜脈血栓形成、PTE等抗凝治療中發揮重要作用，但臨床研究發現，華法林的個體治療劑量差異較大，如需達到同等的抗凝效果，不同患者所需的華法林劑量不同，劑量最大者可為劑量最小者的20倍[4]。臨床治療中需反復監測國際標準化比值(international normalized ratio，INR)來確定華法林用量[5]，但治療效果和出血風險難以把控，且患者的依從性差，如何有效實施華法林個體化治療成為臨床研究的重點。

隨著現代生物醫學技術的不斷發展，部分學者發現，華法林代謝酶細胞色素P450氧化酶2C9(cytochrome P450 proteins 2C9，CYP2C9)和華法林作用靶點維生素K環氧化物還原酶復合體亞單位1(vitamin K epoxide reductase complex 1，VKORC1)基因多態性可影響其藥動學、藥效學，能夠解釋約45%的華法林劑量個體差異[6-7]。根據CYP2C9、VKORC1基因多態性指導華法林的應用，對制訂個性化治療方案具有重要意義，目前臨床上關于CYP2C9、VKORC1基因多態性的研究多集中于華法林應用劑量方面，指導華法林應用的研究較少。基于此，本研究主要探討CYP2C9、VKORC1基因多態性在PTE患者華法林抗凝治療中的應用效果，以期為臨床上華法林的合理有效應用提供理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2020年6月河北醫科大學第二醫院收治的163例PTE患者作為研究對象。納入標準：①符合急性PTE的診斷標準[8],確診為PTE患者；②年齡≥18周歲；③需要華法林抗凝治療超過3個月；④患者均簽署知情同意書。排除標準：①既往有華法林應用史；②伴有活動性出血；③合并有血液系統或凝血功能異常性疾病；④合并有嚴重感染；⑤合并有惡性腫瘤；⑥正在服用可影響華法林藥效學或藥動學藥物以及類似抗凝藥物的其他藥物；⑦依從性差，無法配合完成全程治療及試驗。根據華法林用藥方式不同分為研究組(82例)和對照組(81例)。研究組男37例、女45例，年齡30～80歲，平均(55.1±13.7)歲；合并癥：合并高血壓47例、糖尿病6例、冠心病25例。對照組男34例、女47例，年齡28～82歲，平均(55.4±14.1)歲；合并癥：合并高血壓51例、糖尿病7例、冠心病22例。兩組患者性別、年齡等基線資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2方法

1.2.1主要儀器和試劑 SW-CJ-1FD型超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋(上海勝衛電子科技有限公司)；HFsafe-900TE型生物安全柜(上海力新儀器有限公司)；旋渦混合器(美國Thermo Fisher公司)；微量臺式離心機(美國BECKMAN公司)；NES-32型核酸提取儀(杭州艾康生物技術有限公司)；定性聚合酶鏈反應儀(美國ABI2720公司)；BE-2.0型生物芯片識讀儀、BR-526-24型全自動雜交儀(上海百傲科技股份有限公司)；微量移液槍(北京大龍興創實驗儀器有限公司)；限制性內切酶(美國Thermo Fisher公司)；磁珠法全血基因組DNA提取試劑盒、芯片法CYP2C9和VKORC1基因多態性檢測試劑盒、化學純無水乙醇和異丙醇(無錫百泰克生物技術有限公司)；引物由蘇州泓迅生物科技股份有限公司設計及合成。

1.2.2基因檢測 采集研究組患者外周靜脈血4 mL，乙二胺四乙酸抗凝管保存，嚴格按照DNA提取試劑盒說明書提取DNA，并進行聚合酶鏈反應擴增，0.5 μL上下游引物+0.25 μL棲熱水生菌DNA聚合酶+5 μL 緩沖液+0.5 μL脫氧核糖核苷三磷酸+0.5 μL DNA+雙蒸水補足至20 μL，95 ℃ 5 min、95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min共35個循環后，72 ℃ 7 min，4 ℃ 10 min，3%瓊脂糖電泳鑒定。繼而進行酶切反應，2 μL緩沖液+0.6 μL 5 U限制性內切酶AciⅠ+8 μL聚合酶鏈反應產物+9 μL雙蒸水，37 ℃水浴16 h，3%瓊脂電泳分析基因類型。最終得到CYP2C9的基因型分別為*1/*1(*2CC/*3AA)野生型、*1/*3(*2CC/*3AC)突變型和*3/*3(*2CC/*3CC)突變型，VKORC1基因型分別為AA野生型、GA突變型和GG突變型。

1.2.3劑量設計 根據2015版《藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術指南(試行)》[9]中我國人群推薦華法林的用藥劑量計算公式，以CYP2C9和VKORC1不同基因分型計算華法林(芬蘭Orion Corporation生產，批號：1615356)應用劑量。

研究組患者在第1～3天以基因計算的劑量為初始劑量進行治療，對照組在治療第1～3天以3 mg/d為初始劑量進行治療，治療第4天開始，兩組均根據INR檢測結果調整使用劑量。

1.3觀察指標 比較兩組患者華法林起始劑量、維持劑量、INR首次達標時華法林總劑量、日平均華法林劑量，INR達標(INR值定為2～3)時間、INR檢測次數、住院時間、總醫療費用，以及不良反應發生情況。

2 結 果

2.1研究組患者基因型分布情況 研究組82例患者中CYP2C9基因型為*1/*1(*2CC/*3AA)野生型74例、*1/*3(*2CC/*3AC)突變型7例、*3/*3(*2CC/*3CC)突變型1例，VKORC1基因型為AA野生型67例、GA突變型12例、GG突變型3例。

2.2兩組患者華法林應用情況比較 研究組患者華法林起始劑量、維持劑量、INR首次達標時華法林總劑量和日平均華法林劑量均明顯低于對照組(P<0.01)，見表1。

表1 兩組PTE患者華法林應用情況比較

2.3兩組患者治療情況比較 研究組患者INR達標時間、住院時間明顯短于對照組(P<0.01)，INR檢測次數、總醫療費用明顯少于對照組(P<0.01)，見表2。

表2 兩組PTE患者治療情況比較

2.4兩組不良反應發生情況比較 研究組牙齦出血、鼻衄、皮下瘀斑、顱內出血、尿血、便血及總不良反應發生率比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 兩組PTE患者不良反應發生情況比較 [例(%)]

3 討 論

2014年歐洲心臟學會肺栓塞指南報道，通過對6個歐洲國家45 400余萬總人口流行病學調查發現，約34%的患者死于突發致命性PTE，59%的患者死于生前未診斷出的PTE，僅有7%的患者在死前明確診斷出PTE，部分存活者還可伴發血栓形成后綜合征，并且具有較高的慢性血栓栓塞性肺動脈高壓風險，給衛生保健系統帶來了巨大負擔[10]。而靜脈血栓栓塞癥不良預后多與首次達標時間延長、抗凝強度不夠、抗凝強度不穩定、療程不足等因素相關[11]。因此，制訂華法林的個體化治療方案、維持治療穩定性是保證治療效果、改善患者預后的關鍵。

華法林在急性肺栓塞、PTE等血栓性疾病的抗凝治療中具有重要作用，但要達到穩定的抗凝效果，抗凝強度指標INR必須維持在2.0～3.0，而因個體差異等因素影響，INR能夠維持在有效范圍內的時間只占總體治療時間的40%～60%，明顯增加了患者出血或再栓塞的風險[12-13]。精準醫學是醫學科技發展的前沿方向，加強精準醫學研究對推動重大疾病防控技術的發展至關重要[14]。CYP2C9作為華法林的S異構體代謝酶，其*2與*3位點基因變異可導致CYP2C9酶活性降低，致使華法林S異構體代謝減弱，華法林血藥濃度增加，出現過度抗凝，增加出血風險[15-16]。有研究顯示，CYP2C9的*2與*3位點基因變異可分別使華法林S異構體代謝降低30%～40%和80%～90%[17-18]，故此類人群達到相同的抗凝強度，所需華法林劑量明顯減少。VKORC1作為維生素K依賴性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ活化限速酶，是血液凝固、血栓形成的關鍵酶，而華法林作為一種維生素K拮抗劑，可通過競爭VKORC1的結合位點抑制VKORC1的作用而發揮抗凝作用[19]。有研究證實，VKORC1-1639 A/G位點基因多態性與華法林劑量個體差異密切相關，若該位點等位基因A突變為等位基因G，可促使VKORC1蛋白合成及其酶的活性明顯增加[20-21]，此類人群應用華法林抗凝，若想達到相同的抗凝強度，所需華法林劑量明顯增加，即VKORC1-1639 G等位基因攜帶人群所需的華法林劑量較VKORC1-1639 A等位基因攜帶人群明顯增加，INR首次達標時間也明顯延長。本研究結果顯示，研究組患者華法林起始劑量、維持劑量、INR首次達標時華法林總劑量和日平均華法林劑量均明顯低于對照組，INR達標時間及住院時間明顯短于對照組，INR檢測次數及總醫療費用明顯少于對照組(P<0.01)，華法林用量精確，療效顯著。許建文等[22]研究結果顯示，CYP2C9、VKORC1基因多態性可影響華法林的谷濃度及維持劑量，本研究結果與該結果類似。可見，通過CYP2C9、VKORC1基因多態性指導華法林的應用，對精確華法林用量，提高治療效果具有重要意義。但本研究中兩組總不良反應發生率比較差異無統計學意義(P>0.05)，可能與本研究樣本量較小有關，有待進一步多中心大樣本研究驗證。另外，華法林的藥物不良反應主要發生在給藥初期(初始給藥90 d內)，準確預測華法林初始給藥劑量、減少劑量波動是華法林個體化治療急需解決的關鍵問題。

綜上所述，與常規以3 mg/d為初始劑量的治療方法相比，以CYP2C9、VKORC1基因多態性為指導的華法林治療可顯著減少華法林用量，縮短INR達標時間和住院時間，對提高患者健康水平、減少無效和過度醫療、強化精準醫療具有重要意義。