右美托咪定預處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷時HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路的影響

張曉曉，李樹華，楊華，胡越成

(1.天津市公安醫院麻醉科，天津 300040；2.天津市胸科醫院心內科，天津 300051)

隨著心臟冠狀動脈介入技術和外科旁路移植技術的發展，完全閉塞的冠狀動脈再血運重建率不斷提升，但在積極挽救瀕死心肌的同時，也不可避免地發生冠狀動脈再通后心肌的缺血再灌注損傷(ischemic-reperfusion injury，IRI)[1]。大量的蛋白和因子通過不同途徑參與IRI的發生過程，其中以白細胞介素(interleukin，IL)系列因子和氧化自由基研究最多。但研究多集中于IRI發生損傷的下游機制，對其上游機制研究較少，而且結論觀點也不一致。近年來研究發現,高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)、天然免疫系統中的Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)和細胞內重要的轉錄因子核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信號通路在IRI發生過程中發揮重要作用[2-4]。目前研究發現，右美托咪定(dexmedetomidine，Dex)在心、肝、腦和腎等臟器的IRI中發揮保護作用[5]。但Dex發揮抗IRI保護作用的機制尚不明確。本研究主要探討Dex預處理對大鼠心肌IRI時HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路的影響。

1 資料與方法

1.1動物與分組 選取SPF級SD雄性大鼠36只，體重250～300 g，周齡為8～10周，于2018年6月購自天津醫科大學動物中心，使用許可證號：SYXK(津)2016-0012。36只SD雄性大鼠依據隨機數字法分為假手術組、IRI組和Dex預處理組，每組12只。所有動物進行標準飼養，實驗前12 h禁食禁水。

1.2材料與試劑 動物人工呼吸機(DHX-150，成都儀器廠)，低溫離心機(KH20R-Ⅱ，湖南凱達科學儀器有限公司)，Precisa電子分析天平(LS220ASCS，上海精密科學儀器有限公司)，凝膠成像系統(DNR LumiBIS，以色列DNR公司)，蛋白轉印系統(Trans-Blot Turbo，美國Bio-Rad公司)，PROTEAN等電聚焦系統(i12，美國Bio-Rad公司)。Dex(江蘇恒瑞醫藥股份有限公司生產，批號：181230BP)，戊巴比妥鈉(中國醫藥集團上?；瘜W試劑公司生產)。谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒均購自中國南京建成生物功能研究所。IL-6、IL-8、IL-12和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、HMGB1、TLR4和NF-κB試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3模型制備

1.3.1麻醉與分組用藥 所有大鼠按50 mg/kg腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉并固定，分離股靜脈并置管。Dex預處理組：靜脈予Dex 5μg/kg負荷劑量，然后以5 μg/(kg·h)持續滴注1 h。假手術組和IRI組按同樣方法給予同體積0.9%氯化鈉溶液。全身麻醉后，直視下行氣管插管，并連接小動物呼吸機，聯通供氧系統，調節氧濃度為21%，通氣頻率設為80～100次/min，吸呼比為1∶1，潮氣量為1～2 mL/100 g，術中維持呼氣末二氧化碳分壓為35～45 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。

1.3.2心肌IRI模型制備 選定大鼠左側第3～4肋間，于此處開胸，取大鼠開胸器撐開肋骨，暴露心臟，于心臟左心室前壁處，肺動脈圓錐及左心房間，在左冠狀動脈前降支起始部下2 mm處，下方穿絲線，穩定2 min，結扎絲線阻斷前降支血流，心電圖顯示ST段抬高或T波高聳，心肌顏色由淡紅色變為青紫色，搏動減弱，心電圖ST段抬高≥0.25 mV，為缺血成功的標志。結扎30 min后，切斷結扎線，維持灌注 3 h，心電監護顯示抬高ST段回落50%以上，心肌顏色轉由青轉紅，為再灌注成功的標志[2]。IRI組和Dex預處理組均造模成功，假手術組僅穿線但不結扎，其余步驟均相同。

1.4標本采集 經大鼠股靜脈取血5 mL，處死大鼠后取心臟組織，沿動脈根部剪去大血管，以0.9%氯化鈉溶液沖洗后吸干多余液體，去除右心室游離壁及心房，僅保留左心室心肌組織，稱重。以左心室前壁為中心，取一半左心室心肌組織，置于含4%甲醛試管中固定，再行石蠟包埋，擬行免疫組織化學檢測；將另一半左心室心肌組織，置于液氮中凍存，最后置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.4.1血清IL-6、IL-8、IL-12和TNF-α水平測定 按照各試劑盒操作要求，采用酶聯免疫雙抗體夾心生物技術，根據檢測說明書，通過標準品濃度及對應的OD值，計算標準曲線的直線回歸方程，再根據各樣本的OD結果，在回歸方程上計算出對應的樣本濃度。

1.4.2心肌組織GSH-Px、SOD、MPO和MDA活性測定 取凍存的心肌組織，準確稱取組織重量，以相應的試劑為勻漿介質，制成5%的組織勻漿，分別采用2-硝基苯甲酸直接顯色法測定GSH-Px，黃嘌呤氧化酶法測定SOD，鄰聯茴香胺比色法測定MPO，硫代巴比妥酸法測定MDA的含量，按各試劑盒說明測得各樣本的OD值，再根據相關說明書指導計算公式計算結果。

1.4.3心肌組織HMGB1、TLR4和NF-κB蛋白表達檢測 采用Western blot法檢測心肌組織HMGB1、TLR4和NF-κB蛋白表達。稱取5 mg心肌組織，剪碎后配成勻漿，提取蛋白，采用經典二辛可酸法測定蛋白濃度，制膠后灌膠點樣，電流槽內行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，待不同蛋白條帶分離后，將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜，封閉，洗膜。按照對應分子量切割后，分別置于1∶1 000、1∶300及1∶300 稀釋的兔抗大鼠蛋白HMGB1、TLR4和NF-κB的一抗溶液中，置于4 ℃，雜交過夜，用洗膜液漂洗后加入1∶3 000稀釋的二抗，雜交1 h，用增強化學發光法顯色，凝膠成像系統掃描分析結果，以蛋白灰度比值反映目的蛋白表達水平。

2 結 果

2.1三組大鼠體重和左心室質量比較 三組大鼠體重和左心室質量比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 三組大鼠體重和左心室質量的比較

2.2三組大鼠血清炎癥因子水平比較 各組大鼠血清IL-6、IL-8、IL-12和TNF-α水平比較差異有統計學意義(P<0.01)，與假手術組比較，IRI組和Dex預處理組血清IL-6、IL-8、IL-12和TNF-α水平均顯著升高(P<0.01)；與IRI組比較，Dex預處理組血清IL-6、IL-8、IL-12和TNF-α水平均顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 三組大鼠血清炎癥因子水平比較

2.3三組大鼠心肌GSH-Px、SOD、MPO及MDA含量比較 各組大鼠心肌GSH-Px、SOD、MPO及MDA含量比較差異有統計學意義(P<0.01)，與假手術組比較，IRI組和Dex預處理組心肌GSH-Px和SOD含量顯著下降(P<0.01)，MPO和MDA含量升高(P<0.01)；與IRI組比較，Dex預處理組心肌GSH-Px和SOD含量升高(P<0.05)，MPO和MDA含量下降(P<0.05)。見表3。

表3 三組大鼠心肌GSH-Px、SOD、MPO及MDA含量比較

2.4三組大鼠心肌HMGB1、TLR4和NF-κB蛋白表達水平比較 各組大鼠心肌HMGB1、TLR4和NF-κB 蛋白表達水平比較差異有統計學意義(P<0.01)，與假手術組比較，IRI組和Dex預處理組心肌HMGB1、TLR4和NF-κB蛋白表達水平明顯升高(P<0.01)；與IRI組比較，Dex預處理組心肌HMGB1、TLR4和NF-κB蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)。見表4。

表4 三組大鼠心肌HMGB1、TLR4和NF-κB蛋白表達水平比較

3 討 論

心肌IRI指缺血的心肌恢復血運再灌注后損傷反而加重的現象，在急性心肌缺血后恢復血流時更容易發生。心肌IRI的發生機制復雜，盡管有不同的上游機制，但最直接的下游機制是炎癥介質和氧自由基過表達，同時存在抗氧化酶系的分泌不足，共同作用導致過度的心肌炎癥損傷反應[6-7]。本實驗證實，與假手術組相比，IRI組大鼠的血清炎癥因子(如IL和TNF-α)水平明顯升高，代表心肌氧自由基水平的MPO和MDA含量顯著升高，而發揮抗氧化功能的GSH-Px和SOD水平顯著降低。但這僅是IRI發生的表觀現象，發生心肌再灌注損傷的上游機制尚不明確。

目前對于IRI發生的上游機制研究主要集中在細胞凋亡、細胞自噬和某些相關信號通路的激活開放方面。研究發現，TLR4在IRI過程中發揮重要作用，其活化后可促進心肌損傷，而HMGB1為TLR4內源性配體，該途徑一旦被激活，配體信號即可通過髓樣分化因子88依賴和髓樣分化因子88非依賴途徑發生轉導，進一步活化NF-κB[8]，促進缺血缺氧區域的炎癥反應，激活下游細胞因子(TNF-α、IL-6等)表達發揮損傷效應[9-10]，同時促進氧自由基高表達，最終導致心肌纖維化、心肌細胞凋亡、心功能受損以及心肌梗死面積增大等不良影響[11]。本實驗結果顯示，與假手術組相比，IRI組大鼠心肌HMGB1、TLR4和NF-κB蛋白表達水平明顯升高，這也反映了發生IRI時HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路被迅速激活，進而激活下游炎癥因子和氧自由基的釋放。目前對自身免疫性疾病的研究發現，該信號通路是調控細胞產生炎癥因子和免疫分子的重要通路[12]。本研究在心臟IRI方面同時發現該通路活化后可以激活炎癥和免疫反應，推測該通路是IRI產生和加重的上游機制之一。

Dex作為新型的高選擇α2受體激動藥，在心、腦、肝及腎等臟器的IRI中均具有保護作用。研究顯示，Dex可降低心肌細胞損傷，減少心肌細胞凋亡，逆轉心室重構[13-16]，并減少心肌缺血無復流的面積[17]，但具有作用機制并未完全闡明。Riquelme等[18]認為Dex通過對內皮細胞的保護作用，尤其是內皮型一氧化氮合酶/一氧化氮途徑，發揮抗心肌細胞炎癥和氧化功能。而He等[19]認為Dex不依賴內皮途徑發揮對IRI的保護作用。另有研究認為，Dex通過激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B和糖原合成酶激酶3β信號通路發揮心臟保護作用，并認為該通路可能是其上游通路之一[20-21]。本研究結果顯示，與IRI組相比，Dex預處理組血清炎癥因子(IL、TNF-α)顯著降低，這與Chen等[22]在外科旁路移植術中的研究結果一致，表明Dex能夠減少IRI后炎癥反應，降低氧化應激反應，發揮心肌細胞的保護作用。同時本研究證實，IRI組大鼠心肌細胞生物膜缺血再灌注后易受氧自由基(如MPO及MDA)的攻擊，而Dex能增加抗氧自由基物質，提高機體清除自由基能力，降低組織炎癥損傷水平，證明了Dex對心肌的保護作用。本研究結果顯示，與IRI組相比，Dex預處理組大鼠心肌HMGB1、TLR4和NF-κB蛋白表達水平顯著降低，反映了該藥能抑制IRI時HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路的激活，從上游調控發揮心肌保護作用。

綜上所述，心肌IRI時HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路被激活，Dex通過抑制該信號通路，進一步影響下游靶分子的表達和免疫分子、炎癥因子水平，降低炎癥反應和氧化應激，從而發揮心肌IRI保護作用。但本研究僅局限于對該信號通路影響的探討，IRI的上游機制是多方面的，仍需要深入研究心肌缺血再灌注的機制及Dex在其中發揮的作用。