免疫塞內卡病毒滅活疫苗后豚鼠、家兔與豬的血清中和抗體相關性研究

齊志濤，方建國，王娥娥，郝蘇云，高艷華，路 榮，趙麗霞， 范秀麗，張燕紅，杜宇榮，宋慶慶，陳九連

(金宇保靈生物藥品有限公司，呼和浩特 010100)

塞內卡病毒(Senecavirus A，SVA)是近年來新發的一種豬傳染病，豬感染后發病癥狀與口蹄疫相似，典型癥狀為鼻盤、蹄冠出現腫脹、水皰或破潰[1]，在臨床上與口蹄疫難以區分。SVA在我國不同區域廣泛分布，隨著SVA在豬群當中的不斷傳播，其毒力在逐漸減弱，造成豬群發生亞臨床感染[2]，嚴重威脅我國養豬業的發展及市場交易。目前我國尚無商品化疫苗用以預防該病的發生與傳播，相關產品還處于研發階段。在疫苗研發過程中，產品免疫效力的檢驗是至關重要、不可或缺的環節，SVA滅活疫苗的效力檢驗主要依靠本動物進行。近年來，受非洲豬瘟的影響，豬的買賣和運輸受限，造成實驗豬的采購比較困難，導致SVA滅活疫苗的研發工作受阻。因此，為保障疫苗研發工作的順利進行，同時也積極響應3R原則[3]，本研究選用豚鼠和家兔這兩種數量多、價格低、運輸便捷的動物，開展豚鼠、家兔與豬免疫SVA滅活疫苗后的血清中和抗體相關性研究，以期在節約成本、提高效率、保障動物福利的同時，為獸用疫苗效力檢驗工作中實驗動物替代方法的應用提供支持。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 SVA滅活疫苗(懸浮培養，批號為2019001)、用于做中和試驗的SVA病毒液CH/ZZ/2016株、PK-15細胞(豬腎細胞)，由金宇保靈生物藥品有限公司獸用疫苗國家工程實驗室保存。體重300～500 g的豚鼠和1.5～2.0 kg的家兔各50 只，購自呼和浩特某養殖場；60 日齡以上架子豬15 頭，購自呼和浩特市和林格爾縣某養豬場。

1.2 豚鼠免疫及SVA中和抗體檢測 將50只豚鼠隨機分為5組，分別以0.25 mL、0.5 mL、1.0 mL和2.0 mL的免疫劑量對其中4組豚鼠采用腿部肌肉注射方式免疫，1組作為對照，以相同方式注射2.0 mL生理鹽水。分別于免疫后第7 天、第14 天、第21 天和第28 天連同對照組豚鼠一并采血，分離血清，以《中華人民共和國獸藥典》中的中和試驗法[4]測定SVA中和抗體，數據呈現形式采用log2N表示。

1.3 家兔免疫及SVA中和抗體檢測 將50只家兔隨機分為5組，分別以0.25 mL、0.5 mL、1.0 mL和2.0 mL的免疫劑量對其中4組家兔采用腿部肌肉注射方式免疫，1組作為對照，以相同方式注射2.0 mL生理鹽水。分別于免疫后第7 天、第14 天、第21 天和第28 天連同對照組家兔一并采血，以中和試驗法[4]測定SVA中和抗體，數據呈現形式采用log2N表示。

1.4 豬免疫及SVA中和抗體檢測 選取15頭豬，將其中10頭以最佳免疫方法，即頸部肌肉注射方式免疫2.0 mL SVA滅活疫苗，另外5頭作為對照，以相同方式注射2.0 mL生理鹽水。分別于免疫后第7 天、第14 天、第21 天和第28 天連同對照組豬一并采血，分離血清，以中和試驗法[4]測定SVA中和抗體，數據呈現形式采用log2N表示。

1.5 豚鼠SVA中和抗體與豬SVA中和抗體相關性分析 分別計算每組豚鼠及豬免疫后第7 天、第14 天、第21 天和第28 天的平均中和抗體滴度，利用Microsoft Excel軟件對所得結果進行整理，初步分析豚鼠、家兔與豬血清中SVA中和抗體之間的線性關系，并進一步采用IBM SPSS Statistics 19軟件對線性關系的顯著性進行分析。

1.6 家兔SVA中和抗體與豬SVA中和抗體相關性分析 分別計算每組家兔及豬免疫后第7 天、第14 天、第21 天和第28 天的平均中和抗體滴度，利用Microsoft Excel軟件對所得結果進行整理，初步分析豚鼠、家兔與豬血清中SVA中和抗體之間的線性關系，并進一步采用IBM SPSS Statistics 19軟件對線性關系的顯著性進行分析。

2 結果與分析

2.1 豚鼠免疫后SVA中和抗體檢測結果 對照組豚鼠SVA中和抗體滴度為0，豚鼠免疫后SVA中和抗體滴度呈升高趨勢，高劑量免疫組豚鼠SVA中和抗體滴度高于低劑量免疫組；2.0 mL免疫組豚鼠SVA中和抗體上升速度較其他組快，且SVA中和抗體滴度最高，免疫后第28 d豚鼠SVA平均中和抗體滴度可達210.5，其次為1.0 mL免疫組，免疫后第28 d SVA平均中和抗體滴度達210.3；0.5 mL免疫組在免疫后第28 d平均中和抗體滴度為28.3；0.25 mL免疫組平均抗體滴度最低，免疫后第28 d SVA平均中和抗體滴度為26.3；對照組SVA中和抗體滴度為0(圖1)。結果表明，豚鼠免疫SVA滅活疫苗后，可產生SVA中和抗體，且隨著免疫劑量的增加和時間的延續，SVA中和抗體滴度逐漸升高。

2.2 家兔免疫后SVA中和抗體檢測結果 家兔免疫后SVA中和抗體變化情況與豚鼠免疫后相似，各組家兔在免疫后SVA中和抗體滴度均呈升高趨勢，高劑量免疫組家兔SVA中和抗體滴度高于低劑量免疫組；2.0 mL免疫組家兔SVA中和抗體滴度高于其他組，在免疫后第28 d家兔SVA平均中和抗體滴度達210.0，其次為1.0 mL免疫組，免疫后第28 d平均中和抗體滴度達27.5；0.5 mL免疫組在免疫后第28 d平均中和抗體滴度為27.16；0.25 mL免疫組SVA平均中和抗體滴度最低，免疫后第28 d為25.0(圖2)。結果表明，家兔在免疫SVA滅活疫苗后，也可產生SVA中和抗體，且隨著免疫劑量的增加和時間的延續，SVA中和抗體滴度逐漸升高。

圖1 各組豚鼠SVA中和抗體檢測結果Fig 1 Test results of SVA neutralizing antibodies of guinea pigs

圖2 各組家兔SVA中和抗體檢測結果Fig 2 Test results of SVA neutralizing antibody of rabbits

2.3 豬免疫后SVA中和抗體檢測結果 隨著時間的推移，免疫豬SVA中和抗體滴度逐漸上升，免疫后第28 d SVA平均中和抗體滴度可達28.0，對照組中和抗體為0(圖3)。結果表明，豬免疫SVA滅活疫苗后可產生SVA中和抗體，且隨著免疫時間的延續，SVA中和抗體滴度逐漸升高。

圖3 豬免疫后SVA中和抗體檢測結果Fig 2 Test results of SVA neutralizing antibody of pigs

2.4 豚鼠SVA中和抗體與豬SVA中和抗體相關性分析結果 以豬SVA平均中和抗體值為縱坐標，分別以豚鼠0.25 mL免疫組、0.5 mL免疫組、1.0 mL免疫組及2.0 mL免疫組SVA平均中和抗體值為橫坐標做散點圖，繪制豬SVA中和抗體與各免疫組豚鼠SVA中和抗體的回歸曲線，對二者是否存在關系進行初步判斷。圖4結果顯示，各組豚鼠在免疫后SVA中和抗體在一定程度上與免疫豬SVA中和抗體呈正相關，其中豚鼠1.0 mL免疫組SVA中和抗體與免疫豬SVA中和抗體極顯著相關(R2= 0.9942，P<0.01)；豚鼠0.5 mL免疫組SVA中和抗體與豬SVA中和抗體顯著相關(R2= 0.9833，P<0.05)；豚鼠2.0 mL免疫組SVA中和抗體與豬SVA中和抗體顯著相關(R2= 0.9818，P<0.05)；豚鼠0.25 mL免疫組SVA中和抗體與豬SVA中和抗體相關性不顯著(R2= 0.961，P>0.05)。結果表明，豚鼠SVA中和抗體與豬SVA中和抗體存在線性相關關系，當豚鼠免疫劑量為1.0 mL時，可通過線性回歸方程(y= 0.8131x-0.0971)評估該疫苗在豬體的SVA血清中和抗體水平及消長規律。

圖4 豚鼠與豬SVA中和抗體回歸曲線Fig 4 Regression curve SVA neutralizing antibody between guinea pigs and pigs

利用IBM SPSS Statistics 19軟件對各組豚鼠與豬SVA中和抗體相關性的差異顯著性，結果見表1。各組豚鼠免疫后SVA中和抗體效價均與豬的中和抗體效價存在一定相關關系，其中，豚鼠1.0 mL免疫組SVA中和抗體效價與豬的SVA中和抗體效價相關性最顯著，相關性為0.990(P<0.01)，屬于極顯著相關；豚鼠2.0 mL免疫組SVA中和抗體效價與豬的SVA中和抗體效價相關性為0.988(P<0.05)，屬于顯著相關；豚鼠0.5 mL免疫組SVA中和抗體效價與豬的SVA中和抗體效價相關性為0.973(P<0.05)，也屬于顯著相關；豚鼠0.25 mL免疫組SVA中和抗體效價與豬的SVA中和抗體效價相關性為0.913(P>0.05)，無統計學意義。結果表明，豚鼠1.0 mL免疫組SVA中和抗體與豬SVA中和抗體相關性最顯著，且這種相關性具有統計學意義。

表1 豚鼠與豬SVA中和抗體相關性分析Tab 1 Correlation analysis of SVA neutralizing antibody between guinea pigs and pigs

2.5 家兔SVA中和抗體與豬SVA中和抗體相關性分析結果 以豬SVA平均中和抗體值為縱坐標，分別以家兔0.25 mL免疫組、0.5 mL免疫組、1.0 mL免疫組及2.0 mL免疫組SVA平均中和抗體值為橫坐標做散點圖，繪制豬SVA中和抗體與各免疫組家兔SVA中和抗體的回歸曲線，對二者是否存在關系進行初步判斷，結果見圖5。各組家兔在免疫后SVA中和抗體在一定程度上與免疫豬SVA中和抗體呈正相關，其中家兔1.0 mL免疫組SVA中和抗體與免疫豬SVA中和抗體極顯著相關(R2=0.9942，P<0.01)；家兔2.0 mL免疫組SVA中和抗體與豬SVA中和抗體極顯著相關(R2=0.9885，P<0.01)；家兔0.5 mL免疫組、0.25 mL免疫組SVA中和抗體與豬SVA中和抗體相關性不顯著(P>0.05)。結果表明，家兔SVA中和抗體與豬SVA中和抗體存在線性相關關系，當豚鼠免疫劑量為1.0 mL時，可通過線性回歸方程(y= 0.813x+0.0971)評估該疫苗在豬體的SVA中和抗體水平及消長規律。

圖5 家兔與豬SVA中和抗體回歸曲線Fig 5 Regression curve SVA neutralizing antibody between rabbits and pigs

利用IBM SPSS Statistics 19軟件對各組家兔與豬SVA中和抗體相關性緊密程度進行分析，結果見表2。各組家兔免疫后SVA中和抗體效價均與豬的中和抗體效價存在一定相關關系，其中，家兔1.0 mL免疫組SVA中和抗體效價與豬的SVA中和抗體效價相關性最顯著，相關性為0.998(P<0.01)，屬于極顯著相關；家兔2.0 mL免疫組SVA中和抗體效價與豬的SVA中和抗體效價相關性為0.988(P<0.05)，也屬于極顯著相關；家兔0.5 mL免疫組SVA中和抗體效價與豬的SVA中和抗體效價相關性為0.859(P>0.05)，無統計學意義，相關性不顯著；家兔0.25 mL免疫組SVA中和抗體效價與豬的SVA中和抗體效價相關性為0.920(P>0.05)，無統計學意義，相關性不顯著。結果表明，家兔1.0 mL免疫組SVA中和抗體與豬SVA中和抗體相關性最顯著，且這種相關性具有統計學意義。

3 討論與結論

應用動物試驗替代方法對獸用疫苗檢驗逐漸發展為許多研究人員的共識，一些學者認為，動物試驗替代方法是疫苗檢驗工作的必然發展趨勢[5]。理論上講，若替代動物對疫苗抗原的血清學反應存在明確的量效關系，該動物即可成為疫苗效力檢驗的替代動物[6]。疫苗的效力檢驗不一定必須進行本動物攻毒實驗，替代方法建立的關鍵在于建立與傳統檢驗方法的平行關系，并且這種平行關系是穩定的，不會隨著產品批次的變化而發生改變，進而實現等效替代，建立質量標準[6]。

表2 家兔與豬SVA中和抗體相關性分析Tab 2 Correlation analysis of SVA neutralizing antibody between rabbits and pigs

豚鼠和家兔是常用的試驗動物，具有價格低、數量多、運輸便捷等優勢。歐洲獸藥典列出多種用豚鼠或家兔替代方法[7]，我國關于獸用疫苗效力檢驗和安全檢驗的替代方法也在不斷進步，部分疫苗效力檢驗和安全檢驗中的本體動物逐漸被豚鼠、兔等實驗動物替代[4]。比如，在豬瘟兔化弱毒疫苗的效力檢驗中，通過兔體定型熱來代替豬體試驗；在豬圓環病毒2型滅活苗檢驗中，通過免疫鼠、兔替代本體動物，從而解決試驗動物篩選難的問題[8]。

本研究以豚鼠和家兔為試驗動物，以血清學試驗評價SVA滅活疫苗免疫效力，發現豚鼠和家兔接種SVA滅活疫苗后，均可產生SVA中和抗體，并且抗體滴度隨著免疫劑量的增加而升高，說明豚鼠與家兔可對該疫苗產生血清學反應，并且血清學反應存在明顯量效關系，證明了用豚鼠或家兔替代豬檢驗SVA滅活疫苗效力的可行性。在進一步的統計學分析后發現，豚鼠和家兔在免疫1.0 mL SVA滅活疫苗后，產生的SVA中和抗體與豬產生的SVA中和抗體具有顯著的線性關系，并且可獲得回歸方程。從而推測，可通過免疫豚鼠或家兔間接反應SVA滅活疫苗在豬體的中和抗體水平，但具體質量標準的建立還需要進一步研究。