LED紅光照射對牙齦成纖維細胞抗炎反應的影響

劉旭文，陳澤慶，黃詩捷，盧志成，劉木清

(1.復旦大學光源與照明工程系，上海 200433；2.復旦大學先進照明技術教育部工程研究中心，上海 200433； 3.復旦大學工程與應用技術研究院，上海 200433)

引言

發光二極管 (Light Emitting Diode，LED)具備高效、穩定、環保等優點，廣泛應用于照明、顯示等領域。其安全高效、波長范圍廣、光譜純、光譜半波帶寬窄的優勢，也使其在醫學領域的應用日漸廣泛，已涵蓋皮膚醫學、生物節律、口腔醫學、生物醫學診斷及醫學照明等應用場景[1-3]。

牙周病是指發生于牙齦、牙周膜等牙周支持組織的慢性炎癥性疾病，牙周病病因復雜，但致病關鍵是菌斑微生物及其產物長期作用于牙周支持組織，誘發機體的免疫應答反應，引起牙周病的優勢菌包括牙齦卟啉單胞菌、福賽斯坦納菌、伴放線菌嗜血菌等[4]。人牙齦成纖維細胞(human gingival fibroblasts，HGFs)在細菌病原的刺激下會分泌前列腺素(prostaglandin E2，PGE2)、IL-6、IL-8等炎性介質來參與機體炎癥免疫反應，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是牙齦卟啉單胞菌的主要成分，因此作為體外模擬牙周炎實驗的高效誘導因子被廣泛采用[5]。

牙周病治療的關鍵在于去除定植于牙根面上的菌斑及細菌產物，清除病變的牙周組織，阻止疾病的進展，促進牙周組織的再生。牙周病治療的第一步是通過機械方法去除牙石、菌斑等刺激源，治療方法包括齦上潔治術和齦下刮治根面平整術，但口腔內部存在器械難以達到的部位，刮治難以徹底。常需通過口服或局部應用抗生素來實現對牙菌斑的控制，易引發不良反應和耐藥性[6]。

Dungel等[7]研究發現632 nm的LED紅光照射具有促進細胞增殖、減輕炎癥及促進傷口愈合的作用。Komerik等[8]研究發現625 nm的LED紅光照射可減少炎癥反應并誘導牙周組織中的細胞增殖機制。Almeida-Lopes等[9]對牙齦成纖維細胞的增殖進行研究，發現相同能量密度、不同輸出功率下，紅光比其他可見光能誘導更高的細胞增殖。Li等[10]發現630 nm的LED光照可以減輕免疫細胞的炎癥反應。Ohsugi等[11]發現光照能夠抑制與骨細胞、成纖維細胞、人類牙周韌帶細胞和內皮細胞炎癥相關的基因表達，每種目標細胞的合適照射功率都不同。本文主要研究在光照劑量為18 J/cm2的情況下，不同光強度的630 nm紅光照射對牙齦成纖維細胞的抗炎反應的影響，并對實驗結果進行分析。

1 實驗設計與方法

1.1 LED光照系統

光照系統由觸控屏、信號控制器、LED驅動器和LED光源組成，觸控屏與用戶交互光照參數和開關指令，信號控制器反饋光源狀態，處理用戶指令，并控制LED驅動器驅動LED光源。光照系統使用信號控制器能調節控制電壓和PWM信號以控制LED驅動器輸出的工作頻率、占空比和峰值電流，進而實現光照強度的調節。信號控制器的電壓調節范圍為0～2.5 V，調節精度0.01 V，對應LED峰值電流值0～2 A；PWM信號頻率范圍0～20 K，調節精度0.01 kHz，占空比調節范圍0～100%，調節精度1%，對應LED光源工作頻率和占空比。為了達到細胞光照實驗所需的均勻度，使用了DIALux軟件對LED光源進行了光學仿真，確定了能達到足夠均勻度的LED陣列圖案，光照系統可以在其工作范圍內(距離光源25 cm，直徑20 cm的矩形平面)提供90%的均勻度。本次實驗采用的光照系統如圖1(a)所示，LED光源的峰值波長為630 nm，光源光功率分布圖如圖1(b)所示。

圖1 LED光照系統Fig.1 LED lighting system

1.2 實驗設計

實驗分組：本實驗根據光照強度不同和細胞是否加脂多糖刺激分為6個小組，分別為：1)對照組，細胞不受脂多糖刺激，也不受紅光照射；2)脂多糖(LPS)組，細胞受脂多糖刺激，但不受紅光照射；3)2 mW/cm2組，細胞受脂多糖刺激，同時受光劑量為18 J/cm2、光強為2 mW/cm2的紅光照射；4)5 mW/cm2組，細胞受脂多糖刺激，同時受光劑量為18 J/cm2、光強為5 mW/cm2的紅光照射；5)10 mW/cm2組，細胞受脂多糖刺激，同時受光劑量為18 J/cm2、光強為10 mW/cm2的紅光照射；6)20 mW/cm2組，細胞受脂多糖刺激，同時受光劑量為18 J/cm2、光強為20 mW/cm2的紅光照射。

實驗流程：1)將鋪好細胞的96孔板放置在37 ℃、5% CO2、90%相對濕度的細胞培養箱中培養；2)24 h后，吸除孔中舊培養基，往脂多糖組、4個光照組分別加入150 μL含有濃度為16 μg/mL脂多糖(Invivogen，美國)的新鮮培養基，往空白對照組加入150 μL不含有脂多糖的新鮮培養基，然后放入細胞培養箱；3)調好光照培養箱的光照強度，將需要光照的96孔板放入光照培養箱進行光照，光照完后立刻放回細胞培養箱；4)24 h后，開始檢測細胞活性、活性氧、線粒體膜電位、上清液中PGE2的濃度。

1.3 細胞培養

細胞復蘇：取在-80 ℃冰箱中凍存的牙齦成纖維細胞，于37 ℃水浴中迅速解凍，然后用移液槍將細胞轉移至離心管中，放入離心機(L2-6K，可成)以1 000 R/min的轉速離心5 min，移除上清液，用含10%胎牛血清(Gibco，美國)和1%雙抗(HyClone，美國)的MEM(1X)培養基(Gibco，meiguo1)進行重懸，然后培養在25 cm2的細胞培養瓶中，并放入5% CO2、37 ℃、90%相對濕度的細胞培養箱(啟前QQ-80A-II，中國)中培養。

細胞傳代：待在熒光顯微鏡(Olympus BX53，日本)下觀察到貼壁細胞融合至80%左右開始進行細胞傳代，去除舊的細胞培養基，用PBS緩沖液(Solarbio，中國)沖洗兩遍，然后用2 mL胰蛋白酶(Gibco，美國)對細胞進行消化至脫落，然后加入4 mL培養基終止消化，放入離心機以1 000 R/min的轉速離心5 min，棄去上清液，加入1 mL培養基進行吹打重懸，然后按1∶3的比例將細胞鋪至新的培養瓶中進行培養。

細胞鋪板：等新培養瓶中的細胞融合至80%左右，去除舊的細胞培養基，用PBS緩沖液沖洗兩遍，再用2 mL胰蛋白酶對細胞進行消化至脫落，然后加入4 mL培養基終止消化，放入離心機以1 000 R/min的轉速離心5 min，棄去上清液，加入1 mL培養基進行吹打重懸，然后按照30 μL細胞重懸液與1 mL細胞培養基的比例進行細胞稀釋，再用排槍往96孔板中接種150 μL的稀釋好的細胞重懸液，使每個孔中的細胞密度適中、分布均勻，然后將鋪好細胞的96孔板放入細胞培育箱中，準備下一步光照實驗。

表1 實驗條件和分組

1.4 CCK-8檢測細胞活性

從37 ℃細胞培養箱中取出細胞培養板，使用排槍將舊培養基移除，然后每個孔中加入110 μL現配的含CCK-8(Dojindo，日本)的培養基(CCK-8與培養基的比例為1∶10)，然后放入細胞培養箱中培養2 h，最后用酶標儀(Thermo Scientific，美國)測定各個孔在450 nm處的吸光度，即可得出該孔的細胞活性。

1.5 細胞內ROS檢測

使用DCFH-DA探針(南京建成，中國)檢測細胞內活性氧，將DCFH-DA探針按照1∶2000的比例加入無血清培養液中，然后往96孔板的每個孔中加入100 μL稀釋好的DCFH-DA，將96孔板放入37 ℃的細胞培養箱避光孵育45 min后，吸除上清液，并用無血清培養液清洗兩次，并放置于發射波長為500 nm的熒光顯微鏡下觀察，拍好圖片，使用ImagJ軟件進行分析。

1.6 線粒體膜電位檢測

使用帶有JC-1熒光探針(碧云天，中國)的試劑盒檢測細胞內的線粒體膜電位，吸除96孔板的小孔中的舊培養基，往每個孔中加入100 μL的JC-1染色工作液，并放入37 ℃的細胞培養箱孵育20 min，孵育結束后，吸出上清液，用JC-1染色緩沖液洗滌2次，并放置于發射波長為500 nm和580 nm的熒光顯微鏡下觀察。

1.7 PGE2檢測

酶聯免疫吸附法檢測細胞上清液中前列腺素E2的濃度，使用酶聯免疫試劑盒(R&D System，美國)進行檢測，用PGE2抗原包被在酶標板上，使牙齦成纖維細胞上清液中的PGE2與包被的PGE2競爭生物素標記的抗PGE2單抗上的結合位點，使游離的成分被洗去；然后加入辣根過氧化物酶標記的親和素，生物素與親和素特異性結合而形成免疫復合物，使游離的成分被洗去，然后加入底物溶液，底物溶液在辣根過氧化物酶的催化下會變成藍色，加入終止溶液后變成黃色，用酶標儀在發射波長為450 nm處測OD值，通過繪制標準曲線計算出牙齦成纖維細胞上清液中的PGE2濃度。

1.8 統計學分析

所有實驗均需重復三次，實驗數據使用SPSS進行方差分析(ANOVA),若P<0.05，則表示有顯著性差異。

2 實驗結果與討論

2.1 脂多糖對細胞活性的影響

脂多糖(LPS)是牙齦卟啉單胞菌外膜的主要成分，在本實驗中被用來刺激牙齦成纖維細胞，使細胞產生炎癥反應。Sismey-Durrant等在含0.1、1.0和10.0 μg/mL牙齦卟啉單胞菌脂多糖的無血清培養基中培養牙齦成纖維細胞，發現LPS濃度越高，細胞產生的PGE2水平越高[12]。荊冉等發現1 μg/mL的脂多糖對人周膜成纖維細胞活性的抑制效果不明顯 (P>0.05)，但10 μg/mL的脂多糖可以顯著的抑制細胞活性(P<0.05)[13]。為防止LPS濃度過高會對細胞活性產生影響，對細胞造成損傷，所以先探究不同濃度的脂多糖對牙齦成纖維細胞活性的影響。先配好含有濃度分別為0、4、8、16、32、64、128 μg/mL脂多糖的培養基，然后將培養基分別加入到含有牙齦成纖維細胞的96孔板中，再把96孔板放入細胞培養箱培養24 h，最后使用CCK-8試劑盒檢測在含有不同濃度脂多糖的培養基中培養24 h后的細胞活性。從圖2中我們可以看出，當培養基中的脂多糖濃度小于16 μg/mL時，脂多糖對牙齦成纖維細胞的活性影響較小，4、8、16 μg/mL組的牙齦成纖維細胞活性與對照組(0 μg/mL)的細胞活性沒有顯著性差異；當培養基中脂多糖濃度在32 μg/mL以上時，脂多糖對牙齦成纖維細胞活性的影響較大，32、64、128 μg/mL組的牙齦成纖維細胞活性與對照組(0 μg/mL)的細胞活性之間有顯著性差異。所以，我們選擇16 μg/mL的脂多糖濃度進行下一步實驗。

圖2 不同濃度脂多糖對牙齦成纖維細胞活性的影響(P<0.05)Fig.2 Effects of different concentrations of lipopolysaccharide on the activity of gingival fibroblasts

2.2 不同強度光照對細胞分泌PGE2的影響

PGE2是人體細胞中重要的炎癥介質，在牙周病患者的唾液中的含量明顯高于正常人[14]。PGE2主要是由受到細菌分泌的脂多糖刺激后的牙齦成纖維細胞產生，前列腺素E2濃度增加會引起牙齦炎和牙槽骨吸收[15，16]。在本實驗中，使用濃度為16 μg/mL的牙齦卟啉單胞菌脂多糖刺激牙齦成纖維細胞，使細胞產生炎癥反應，然后對產生炎癥的細胞進行光照處理，光照劑量均為18 J/cm2,根據光強度的不同，將實驗組分為2 mW/cm2、5 mW/cm2、10 mW/cm2、20 mW/cm2，并設有control組(細胞不受脂多糖刺激，也進行光照)和LPS組(細胞只受脂多糖刺激，不進行光照)進行對照，根據圖3結果，我們可以發現脂多糖刺激下的牙齦成纖維細胞產生了更多的PGE2，說明脂多糖使細胞產生了明顯的炎癥反應；4個光照組相比于LPS組，PGE2的濃度顯著下降，說明18 J/cm2的紅光照射可以抑制炎癥細胞分泌PGE2，即可以促進牙齦成纖維細胞產生抗炎反應；5 mW/cm2組的PGE2濃度顯著低于2 mW/cm2、10 mW/cm2、20 mW/cm2組，說明在光照劑量相同情況下，強度為5 mW/cm2的光對牙齦成纖維細胞炎癥的治療效果最好。

圖3 不同光照強度對細胞分泌PGE2的影響 (*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)Fig.3 The effect of different light intensity on PGE2 secretion by cells

2.3 不同強度光照對細胞活性的影響

吳艷、Zaccara IM、Soares DM等發現一定能量的LED紅光照射可以使牙周膜干細胞、人牙髓干細胞、人牙周韌帶干細胞增殖[17-19]。前面，我們發現630 nm紅光照射可以抑制炎癥細胞內PGE2的產生，使受LPS刺激后的牙齦成纖維細胞的炎癥減輕，為了研究這是否與紅光可以促進細胞增殖相關。接下來我們探究不同實驗條件對牙齦成纖維細胞活性的影響。首先將牙齦成纖維細胞均勻的鋪在96孔板內，然后將細胞分成6組，按相應的實驗條件處理細胞，將所有處理后的細胞放入細胞培養箱，24 h后使用CCK-8試劑盒檢測每組細胞的活性。如圖4所示，6個組的細胞活性之間沒有顯著性差異，說明在本實驗中光照條件和脂多糖處理均對牙齦成纖維細胞的活性沒有明顯影響，也證明了紅光照射抑制細胞炎癥與改變細胞活性無關。

圖4 不同實驗條件下的細胞活性Fig.4 The cell viability under different experimental conditions

2.4 不同強度光照對細胞ROS水平的影響

Orihuela-Campos等[20]、Tsutsumi等[21]、李坤陽等[22]發現白藜蘆醇、L-抗壞血酸2-磷酸鎂鹽、姜黃素等作用于人牙齦成纖維細胞，能夠有效抑制ROS產生，從而抑制細胞炎癥反應，但很少有人研究LED紅光對炎癥細胞內ROS水平的影響。因此，我們探究在相同光劑量18 J/cm2，不同光照條件下，細胞內ROS產生的情況。實驗結果如圖5所示，圖5(a)為熒光顯微鏡下細胞內活性氧的熒光圖，圖5(b)為使用ImagJ軟件對熒光圖進行分析的結果，可以發現16 μg/mL的脂多糖刺激牙齦成纖維細胞后，細胞內的ROS水平上升，這與李瑩等[23]、吳忠敏等[24]的研究結果一致。我們還可以發現LED紅光照射可以抑制炎癥細胞內活性氧的產生，LPS組細胞內活性氧水平顯著高于2 mW/cm2、5 mW/cm2、10 mW/cm2、20 mW/cm2組細胞內活性氧水平，且當光強為5 mW/cm2時，紅光照射對炎癥細胞內活性氧產生的抑制效果最佳，這與LED紅光抑制炎癥細胞內PGE2的產生的結果相對應，也說明LED紅光抑制細胞炎癥有可能是通過抑制ROS產生傳導的，這與Lim等[25]所研究的結果與推論一致。

圖5 不同實驗條件下細胞內ROS水平(*P<0.05, **P<0.01)Fig.5 IntracelluLar ROS levels under different experimental conditions

2.5 不同強度光照對細胞MMP的影響

線粒體是ROS生產的主要場所，特別是受損傷的線粒體會釋放出大量的ROS，高水平的ROS會損壞線粒體膜，導致線粒體膜電位下降[26]。正常線粒體膜電位是維持線粒體功能的前提，線粒體膜電位下降，會使線粒體功能障礙，這是細胞凋亡的早期標記性事件[27，28]。ROS是正常細胞代謝的產物，而過量的ROS會產生細胞毒性，使牙齦成纖維細胞的線粒體膜電位下降，誘導細胞凋亡[29]。在本實驗中，脂多糖刺激牙齦成纖維細胞，使牙齦成纖維細胞內的ROS水平上升，LED紅光照射使炎癥細胞內ROS水平下降。為了探究炎癥細胞的線粒體膜電位是否受到影響從而導致細胞凋亡，我們對牙齦成纖維細胞的線粒體膜電位進行檢測。檢測結果如圖6(a)所示，當線粒體膜電位高時，JC-1主要以紅色熒光聚合物形式存在；當線粒體膜電位低時，JC-1主要以綠色的熒光單體形式存在。圖6(b)是使用ImagJ軟件對線粒體膜電位熒光率進行統計學分析的結果，可以發現受脂多糖和光照刺激的細胞線粒體膜電位相對于空白對照組沒有下降，線粒體功能正常，沒有出現細胞凋亡的早期標志。這也可以說明使用LED紅光照射可以抑制牙齦成纖維細胞炎癥，且不會導致牙齦成纖維細胞的線粒體膜電位下降，也不會導致細胞凋亡。

圖6 不同實驗條件下細胞線粒體膜電位Fig.6 Cell MMP under different experimental conditions

3 結論

我們通過實驗證明了630 nm LED紅光照射可以抑制牙齦成纖維細胞的炎癥反應，實驗數據表明，波長為630 nm、光劑量為18 J/cm2、不同光強度(2 mW/cm2、5 mW/cm2、10 mW/cm2、20 mW/cm2)的紅光LED照射均可以降低受脂多糖刺激而產生炎癥反應的牙齦成纖維細胞上清液中PGE2的濃度；且在相同光照劑量條件下(18 J/cm2)，5 mW/cm2的紅光照射對牙齦成纖維細胞的炎癥抑制效果最佳。此外我們還發現紅光照射抑制牙齦成纖維細胞炎癥與降低細胞內ROS水平有關，與影響細胞活性無關；且LED紅光照射治療細胞炎癥的方法不會對細胞的線粒體膜電位造成影響，也不會引發細胞凋亡。本文僅針對LED紅光對體外培養的牙齦成纖維細胞抗炎反應的研究得出初步結論，至于LED紅光是否可以在體外抑制口腔炎癥，還需進一步的研究。