餐廚垃圾厭氧發酵產甲烷及微生物群落研究

寧祉愷，劉帥，黃元宸，劉德啟 (.蘇州大學材料與化學化工學部及蘇州納米科技協同創新中心，江蘇 蘇州 252；2. 蘇州工業園區清源華衍水務有限公司，江蘇 蘇州 2500；.蘇州大學紡織與服裝工程學院，江蘇 蘇州 252；4.華衍環境產業發展(蘇州)有限公司，江蘇 蘇州 252)

0 引言

隨著我國社會經濟的快速發展，餐廚垃圾產生量與日俱增，因其中富含碳水化合物、油脂、蛋白質及水分，又具有顯著的易腐發臭特點。因此，餐廚垃圾已成為目前一種新的環境污染源并引起廣泛的社會關注。其中厭氧發酵處理亦成為其資源化、無害化與減量化的主要途徑。近年來，通過添加組分對厭氧反應器發酵體系C/N比及微生物群落結構的調控受到重視并成為研究的熱點。研究人員以餐廚垃圾和秸稈按比例混合后為連續高溫共發酵基質，開展了55 d長期試驗，通過控制水力停留時間(HRT)及有機負荷(OLR)探討反應器的運行穩定性及微生物群落組成。實驗發現，當HRT降至0.5 d時，會導致反應器中微生物流失，即使pH值穩定在7.0左右，未出現VFA累積，反應器幾乎停止產氣，揮發性固體去除率也僅為5.77%。高通量測試結果表明，此時體系內梭菌目(Clostridiales)等能與產甲烷菌共生的水解酸化細菌的比例增加近1倍，但嗜乙酸產甲烷菌降至0.6%。顯然，厭氧反應器中的微生物群落結構與環境條件緊密關聯，由于不同菌群的世代更替周期存在顯著差異，因此厭氧生物反應器操作條件的變化會引起微生物種群的演替，進而導致微生物群落結構的自適應性重整。

本文以從蘇州某區學校、餐飲、企業、醫院、快餐等集中收集的餐廚垃圾為處理對象，利用公司附屬污水廠的厭氧污泥為協同發酵體，探討厭氧污泥添加量對餐廚垃圾高溫厭氧發酵產氣速率、產氣量及組分變化的影響；利用16S rDNA擴增子測序技術探討反應器運行68 d后穩定產甲烷的微生物群落結構，并與接種污泥微生物群落結構為對照，識別其建群種與優勢種微生物。旨在利用厭氧消化技術實現園區餐廚垃圾的資源最大化、過程清潔化的可行性，以期為該區餐廚垃圾的厭氧發酵工藝設計、運行過程風險管控與應急處置提供理論基礎。

1 實驗部分

1.1 實驗材料、裝置與實驗方法

實驗用餐廚垃圾樣品采自公司從園區集中收集的餐廚垃圾，剔除其中雜質如塑料袋、方便筷等，用粉碎機勻漿，過10目篩子后裝入自封袋放入冰箱中在-20 ℃下保存備用。接種泥為公司污水處理廠的典型厭氧污泥，收集后置于4 ℃下保存備用[1]。

實驗裝置主要由恒溫攪拌發酵裝置及集氣裝置構成，用橡膠管連接。實驗前檢測氣密性，并按實驗計劃裝入實驗材料，實驗運行68 d。

實驗按餐廚垃圾與接種污泥的不同比例(折干基)采用5∶0、4∶1、3∶2、2∶3、1∶4及0∶5 單獨及協同發酵連續實驗；6個反應器的固體含量均為8%，每天定時向反應器中加入7.5 g基質。協同消化實驗的接種泥量均為150 mL，HRT為20 d，OLR揮發性固體(VS)為4 kg/(m3·d)。每天定時記錄產氣量并檢測收集氣體組分；定期取樣監測反應器中發酵液的相關理化指標。

1.2 反應液測定指標及分析方法

總固體含量(TS)及VS測定方法參見GB/T 14415—2007及GB/T 5009.4—1985；脂質采用索氏提取法，參見GB/T 14772—2008；揮發性脂肪酸(VFAs)采用滴定法，參見Q/YZJ 10-03-02—2000；蛋白質含量采用凱氏定氮法測定；COD采用重鉻酸鹽法，參照GB 11914—1989；C、H、N元素含量測定采用Perkin Elmer 2400II元素分析儀。

1.3 反應器氣相組分及測定方法

6個反應器產生氣體的組分分析，采用 POLI MP400S (mPower Electronics Inc.)及Multi RAE 2 (RAE Systems, USA)對收集瓶中氣體進行組分分析[2]。

1.4 高通量測序及分析

高通量測序：將收集的待測樣品送往蘇州金唯智生物科技有限公司，采用Illumina MiSeq 測序平臺進行16S rDNA擴增子測序。利用金唯智自主研發的引物體系有效擴增出16S rDNA的多個可變區，能夠準確鑒定出包含古生菌在內的多個物種。

多樣性分析：利用Usearch軟件平臺(http://drive5.com/uparse/，V7.0)，將測得的序列按照彼此間97%的相似性進行劃分得到OTU；選擇97%相似度OTU進行多樣性指數計算，采用覆蓋度(Coverage)反映微生物物種的覆蓋率；采用香農(Shannon)指數等反映物種的多樣性；采用Chao1指數反映群落的豐富度[3]。

2 結果與討論

2.1 溫度對餐廚垃圾單獨發酵產氣量的影響

先進行餐廚垃圾單獨靜態發酵，設置5個溫度范圍，分別為15、25、35、45及55 ℃，探討園區餐廚垃圾發酵潛力及適合的發酵溫度。溫度為15、25、35、45、55 ℃時，反應器的平均產氣速率分別為10、145、325、380及560 mL/(g·d)。顯然，反應器厭氧發酵溫度為55 ℃時的平均產氣速率最高，因此，將55 ℃設置為后續實驗的發酵溫度[4]。

同時，進一步分析了55 ℃靜態發酵反應器中發酵液COD與產氣量隨時間變化規律，結果如圖1所示。圖1(a)中餐廚垃圾單獨發酵在實驗開始時過濾液的COD為58 000 mg/L，逐漸上升到第6天時的70 000 mg/L，表明這段時間反應器中的餐廚垃圾勻漿顆粒在微生物酶催化下發生了水解，產生小分子有機酸導致反應體系 pH 值的下降。其中pH從第18天的5.7，迅速上升到第24天時的7.5，其后發酵液的pH維持在7.0～8.1之間。由此推測反應體系中嗜酸微生物種群的增加可能會加速產甲烷的速率。第36天后COD呈逐日下降趨勢，第66天實驗結束時COD為20 000 mg/L，去除率達到63.2%。如此同時，反應器在整個反應期間出現4個產氣峰值平臺，這基本對應發酵體系COD出現顯著變化的時間。因此，反應物及其產物的關聯性初步反映了微生物生化反應過程，相鄰平臺期持續的時間則可能預示維持該反應的微生物群落結構的建群時間，表明相關微生物群落中優勢種的形成、更替與基因繼承[5]。

此外，圖1(b)中厭氧污泥單獨高溫發酵雖然出現了COD濃度的波動，但前6天的變化規律則與餐廚垃圾單獨發酵相反，產氣積累量低且隨時間未出現圖1(a)中餐廚發酵的4個產氣平臺期。表明厭氧污泥的單獨高溫發酵只是原微生物群落無基質高溫淘汰與選擇及再馴化、培養的結果，最后僅是新建微生物群落的內源呼吸與代謝。

2.2 餐廚垃圾單獨高溫發酵的產氣組分分析

實驗同時測定了餐廚垃圾單獨高溫(55 ℃)發酵產生氣體的組分濃度(表1)，結果表明反應器第一及二產氣平臺期氣體主組分以CO2、CH4、H2及H2S為主；第三產氣平臺期氣體主組分以CH4、CO2、H2S及H2為主；第四產氣平臺期氣體主組分以CH4、CO2、H2S為主，甲烷產量為最高，占50%～58%左右，H2則越來越少；整個反應過程均伴隨少量組分CO、NH3(g)及NO(g)等。這些氣相生成物是反應器微生物生化反應及微生物利用基質代謝的結果，因此，各階段生成的氣體主組分則如實的記錄了主反應過程，以及與其相關的微生物群落結構及共生關系。第一、二產氣平臺期CO2及CH4氣體占比最高，并處于相對較低的pH階段，說明以產酸為主的微生物代謝餐廚垃圾中淀粉和纖維素等大分子碳水化合物生成小分子單糖、繼而轉化為有機酸等的主要路徑，并伴隨產H2的過程；這也符合發酵產氫的最優條件。

表1 園區餐廚垃圾在不同發酵階段氣相組分的平均濃度 單位：mg/m3

整個發酵過程產生的氣相含氮副產物(NH3(g)及NOx(g))表明互營單胞菌的存在，因其是極端氨濃度下生物基質厭氧消化中的關鍵微生物，主要消耗揮發性脂肪酸產生甲烷。此外，第一階段H2最大產生值與產氫菌密切相關，隨后階段發生的CH4與H2漲消現象預示嗜酸產甲烷菌與嗜氫產甲烷菌在相關階段扮演角色(即產甲烷菌的優勢種)的變化，但可能存在兩種產甲烷菌群的共生或更替關系；最后階段存在痕量的H2，意味二者共生的可能性更高。由此進一步推測園區餐廚垃圾單獨高溫發酵過程的微生物群落演替，除相關微生物群落中優勢種的形成、更替與基因繼承外，還包括互惠或單向利用等共生關系。

2.3 厭氧污泥協同餐廚垃圾高溫發酵對發酵液COD降解及產氣的影響

實驗對比了厭氧污泥的添加量對餐廚垃圾協同高溫發酵體系COD降解及其產氣積累過程的影響，結果如圖2所示。圖2(a)可以發現，隨著厭氧污泥的添加及其量的增加，發酵液COD最高值均比餐廚垃圾單獨發酵時的最大值(70 000 mg/L)低，且添加量越多，COD最高值越小；此外，從前6天的變化趨勢上看，添加量為1∶4時，趨于餐廚垃圾單獨發酵規律；為2∶3時，趨于厭氧污泥單獨發酵規律；當達到3∶2及4∶1時，厭氧污泥占比相對較高，由餐廚垃圾中的有機物水解所提供的有機碳僅能夠滿足或不能夠滿足此時系統微生物群落的攝食需求。因為微生物的比增長速率和限制性基質濃度具有Monod生長動力學規律，當基質充分時，細菌的增長速率與基質濃度無關；基質不充分時，細菌的增長速率則遵循一級基質代謝規律，此時有機物濃度的多少成為微生物群落生長速率的限制性因素。因此，在給定的OLR，穩定期發酵體系的微生物生長期為減速生長期，微生物群落的數量趨于最高值；否則，在外界提供的OLR不能夠滿足群落需求時，則發展成為內源呼吸期，微生物總量則趨于下降，如厭氧污泥占比為4∶1的協同發酵系統。

不同比例下的產氣積累量也進一步支持了上述的觀點，如圖2(b)所示。從圖中可以看出，隨著厭氧污泥的添加及其量的增加，協同發酵體系的產氣積累量最大值介于厭氧污泥與餐廚垃圾單獨高溫發酵產氣積累量之間；其中厭氧污泥添加比例為1∶4時及2∶3時，產氣總量分別為17 540 mL及17 440 mL，為協同發酵體系的相對最高值。因此，結合運行處理能力及處理效率，將協同發酵體系的厭氧污泥添加比例控制在1∶4～2∶3最為合適；不僅能夠獲得最佳的產氣效率，而且在此比例下微生物群落處于對數生長期，對餐廚垃圾中的有機物代謝速率也達到最高，這一點可以從圖2(c)中發酵體系COD的降解率上得到充分的說明。

圖2 厭氧污泥協同餐廚垃圾高溫發酵對發酵液COD降解及產氣的影響

此外，當協同發酵體系的厭氧污泥添加比例控制在0至2∶3時，均會出現4個較為明顯的產氣峰值平臺期；并且隨著厭氧污泥添加量增加，產甲烷穩定期到來的時間逐漸縮短。這些結果也進一步表明采用高溫協同厭氧發酵處理園區餐廚垃圾時，厭氧污泥作為種菌污泥參與餐廚垃圾高溫發酵處理具有可行性，不僅具有較好的處理效果，而且還具有較高的環境與經濟效益。同時，一旦因各種因素導致協同發酵系統運行失控，處理效率及產氣量的大幅度下降，則可按照厭氧污泥比例從4∶1、逐步過渡到3∶2的添加量，可使失衡的發酵系統在20 d內迅速恢復到穩定的產甲烷平衡階段，與餐廚垃圾單獨高溫發酵的恢復期相比，可縮短30 d以上。

2.4 厭氧污泥協同餐廚垃圾高溫發酵穩定期的微生物多樣性分析

厭氧污泥及協同發酵穩定期生物樣品經高通量測序的結果如表2所示。2份樣品測序分別獲得17 631 000及15 500 000 Bases(bp)，過濾后的有效序列平均長度分別為456.48 bp及452.27 bp,Reads分別為70 524 及62 000。2樣品測得的OUT數分別為1 640個及1 109個，前者OTU平均數目比后者OUT數多531個。厭氧污泥樣品的Coverage值為99.6%，協同發酵穩定期生物樣品的達到100%，說明測序結果如實表達了樣品所代表的微生物群落的客觀現狀。

表2 厭氧污泥及協同穩定發酵期生物多樣性分析

其中，厭氧污泥的Shannon值及Simpson值分別為8.614及0.992, Chao1值為1 649.563；分別高于協同發酵穩定期生物樣品的相關值(6.702、0.962及1 109.143)。通常，生物多樣性指數Shannon值越大說明群落的多樣性越高，Chao1值越大說明群落的豐富度越高；因此，厭氧污泥樣品的微生物多樣性和豐富度相對更高，這意味著發酵的高溫淘汰了厭氧污泥微生物群落中的不適種，選擇了協同發酵體系中的耐高溫種群。

2份生物樣本在不同分類水平下的物種種類數目如表3所示。從表中可以看出，協同發酵穩定期污泥生物樣本在門、綱、目及科水平上的物種數量分別僅為菌種樣本的物種數的69.7%、52.2%、34.6%及39.6%。這進一步說明反應器的發酵環境條件，尤其是高溫的脅迫效應，驅動了協同發酵種群污泥中的微生物群落的分化、選擇與適應[6]。

表3 2份生物樣本在不同分類水平下的物種種類數目對比

同時，用R語言統計了2份生物樣本的種水平(Species)微生物種類數，結果表明厭氧污泥及協同穩定發酵期污泥樣品中的微生物種類分別為1 558種及1 027種，其中的共有種類僅為82種，分別占其各自物種數量的5.3%及8.0%。這一結果充分的說明了經過前3個產氣累積峰值平臺期的高溫、高OLR、低pH、有毒代謝副產物環境因子的選擇壓力，在第4個產氣累積峰值平臺期到來時僅繼承保留了厭氧污泥中的5.3%的微生物種類，新建微生物種類為945種，占比高達94.7%[7]。

對上述2份生物樣本中上千種微生物物種，按照Top 30的物種，用R語言統計并作不同物種的相對豐度圖(圖3)。其中，擬桿菌門(Bacteroidetes)是2份生物樣品中均具有的最豐富的微生物，分別大約占28%及31%，是微生物群落的關鍵建群物種；同時此類微生物在餐廚垃圾協同高溫發酵過程中得到延續與發展。但厭氧污泥中的變形菌門(Proteobacteria)及酸桿菌門(Acidobacteria)的大多數微生物在其協同高溫發酵過程中遭到淘汰，隨后被厚壁菌門(Firmicutes)及熱袍菌門(Thermotogae)的微生物所替代。因為Firmicutes門及Thermotogae門具備適生的生物結構及生理特性資本，并能在高溫、高OLR等脅迫因子的環境條件下對餐廚垃圾降解起主要生化作用，參與對多種復雜有機質(如：淀粉、蛋白質及油脂等)的降解，為人類餐廚垃圾資源化及無害化處置作貢獻[8]。

圖3 2份生物樣品在門水平上的主要微生物種群及其相對豐度

3 結語

本文系統的開展了厭氧污泥協同餐廚垃圾高溫厭氧發酵的資源化實驗研究。通過對反應器產量采集、發酵液理化指標及生物樣品的高通量測序分析，以厭氧污泥及餐廚垃圾單獨高溫發酵為對照，探討了厭氧污泥協同餐廚垃圾高溫厭氧長達66天發酵過程的產氣累積量與氣相組分、COD降解隨時間的變化規律，發現在停留時間、有機負荷率完全一致的情況下，餐廚垃圾的占比與甲烷產生效率、產量之間為正相關的關系；餐廚垃圾在混合基質中所占的比例對于有機降解率具有決定性作用，占比越大，有機降解率就越高。另外對接種污泥及發酵后的混合污泥進行了高通量測序檢驗，發現了餐廚垃圾協同高溫發酵系統的微生物群落的主要建群微生物擬桿菌門(Bacteroidetes)及種群演替規律。研究結果可為屬地餐廚垃圾資源化利用及無害化處理工藝設計、處理系統穩定、高效運行及風險管理與應急處置提供科學依據。