表面引發ATRP制備血液相容性材料研究方法

張暢(國家知識產權局專利局專利審查協作廣東中心，廣東 廣州 510000)

1 概述

目前常用的材料表面改性方法主要有表面涂覆、等離子體化和表面接枝。前兩者雖然方法簡單，但是改性后材料性能不穩定，因此表面接枝是當今人們比較常用的改善材料血液相容性的一種方法。但一般的表面接枝方法得到的接枝表面結構不統一，接枝密度和接枝鏈長都不能很好地控制，隨著ATRP[1]技術的發展，人們逐漸開始采用表面引發ATRP(SI-ATRP)的方法在材料表面可控的接枝上具有生物活性的單體。目前接枝到材料表面的生物活性分子主要有以下四種：聚乙二醇類、磷酰膽堿類、內鹽類、肝素類。在材料表面接枝的第一步就是要在其表面引入合適的引發基團，但是合成材料中，一般都不具有可以用于ATRP引發的基團。因此進行表面引發ATRP之前要先在材料表面引入引發劑。

雖然氨基在材料表面很少見，但也有，比如殼聚糖，但是材料表面一般存在有羥基基團。像纖維素膜[2]、紙和NH2-玻璃片[3]等都是存在羥基基團的基底，它們可以直接與2-溴異丁酰溴和三乙胺反應而使表面帶上溴酯或溴氨等引發基團。但是對于那些表面沒有羥基基團的材料，就需要先引入羥基基團。如，尼龍膜就可以被甲醛活化而在表面帶上羥基，又如，利用紫外輻照可以在聚丙烯的表面引入用于SI-ATRP的活性基團：用于紫外引發劑的二苯甲酮-2-溴異丁酰鹽是由4-羥基二苯甲酮和2-溴異丁酰溴制備，將其涂覆到PP的表面，然后再波長為365 nm紫外光照射下處理(如圖1所示)[4]。

2 常用研究方法

2.1 水接觸角測量

提高材料的親水性，可以降低其與血液之間的界面粘附功，界面粘附功越低，材料表面吸附的蛋白質及血小板越容易發生解吸附。因此，提高材料親水性能有效改善材料血液相容性。親水性通常是用材料表面的水接觸角及材料平衡態吸水性來進行評價。水接觸角通常用于材料表面親水性的評價，其測量方法一般分為測角法、測高法和測重法，其中測角法應用最廣。測角法根據測試方式的不同可以分為鼓泡模式和平滴模式，根據測試過程液滴的滴定模式可以分為靜態接觸角和動態接觸角(包括前進角和后退角)。對于鼓泡模式來說親水性越強，接觸角越大：而對于平滴模式來說接觸角越小，親水性越強。

Feng等[5]將MPC用表面引發ATRP和引發劑自組裝的方法接枝到硅片的表面，制備了接枝密度為0.06～0.39 chains/nm2和鏈長為5～200個單體單元的接枝樣品。并測定了不同接枝密度和接枝鏈長接觸角的變化(如圖2所示)

圖2 不同接枝鏈長和接枝密度的表面接枝MPC樣品的前進角

2.2 蛋白質吸附研究

通常情況下，生物材料與血液接觸后水分和無機鹽最先到達材料表面，緊接著是體液、血液中的蛋白質分子，最后是血小板、細胞等到達材料表面。血小板、血細胞通過蛋白質層粘附到生物材料的表面，因此材料血液相容性與材料對蛋白質吸附性能密切相關，材料表面吸附蛋白質的種類、吸附速度、吸附類型、吸附量以及空間構象都直接影響材料的血液相容性。

蛋白質的吸附尤其是血漿蛋白在高分子材料表面的吸附對于凝血和溶血的發生有著至關重要的作用。吸附在材料上的蛋白質可以催化或削弱血液與材料的作用，最終影響材料的血液相容性。因此，全面定量地理解蛋白質從復雜的溶液中如何到達、吸附在生物材料表面是未來生物材料設計的關鍵課題。

白蛋白(albumin)作為一種血液相容性輔助單體得到廣泛的研究和應用。白蛋白是血漿中含量最多的蛋白質，研究表明，白蛋白可以運輸血液中的許多小分子，是維持血液滲透壓最重要的物質，且不會引起體液和細胞體的免疫反應。牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)是最常被用來研究的一種白蛋白，形狀為橢球形，尺寸大小為14 nm×4 nm×4 nm。它是具有水溶性天然高分子，有著合成材料所無法比擬的優勢且可用于改善材料血液相容性。通常將血清白蛋白(鈍化材料吸附的蛋白)，纖維蛋白原(活化材料吸附的蛋白)和溶菌酶(在生理環境下顯正電性的蛋白)的吸附行為作為材料抗蛋白吸附性能的評價。材料表面蛋白質吸附的數量、組成和構象可以通過圓二色譜法(CD)、差示掃描法(DSC)、酶聯免疫法(ELISA)、石英微天平(QCM)、放射元素熒光分析法、BCA蛋白質定量分析法進行測試。

JIN等[6]通過原子轉移自由基聚合(ATRP)方法將甲基丙烯酸甲氧基聚乙二醇(poly(OEGMA))接枝到聚氨酯的表面，通過單體濃度，接枝引發時間來調控接枝分子刷鏈長和接枝密度，并通過蛋白質吸附實驗(纖維蛋白原、溶菌酶和乳白蛋白)對其抗蛋白吸附性能進行測試，結果發現改性后的材料抗蛋白質吸附能力增強。隨著接枝分子鏈增加，抗蛋白質吸附能力逐漸增加(在100個單體接枝單元內)，同時實驗也考查了混合蛋白溶液體系下的抗蛋白質吸附能力。研究證明在二元蛋白質混合體系下，改性材料同樣具有優異抗蛋白吸附性能。盡管聚乙二醇類材料具有優良的抗蛋白質吸附性能和良好的血液相容性，卻存在抗氧化能力差(特別是在過渡金屬存在下)、容易降解等缺點，不利于其作為生物相容性材料長期使用。

2.3 血小板粘附、激活研究

蛋白質在生物材料表面吸附、沉積后可被血液中的血小板識別，引起血小板的粘附、鋪展和激活等反應。其中血液中纖維蛋白原、玻連蛋白、免疫球蛋白、von Willebrand因子等都對血小板的粘附激活有重要影響。其中纖維蛋白原對血小板的粘附影響最大，而玻連蛋白、免疫球蛋白、von Willebrand因子主要對血小板起促進激活的作用。血小板粘附后受激活會釋放出二磷酸腺苷(ADP)、血栓素A2和血清素等物質，這些物質進一步地活化血小板并促進凝血酶釋放出來。不溶性的纖維蛋白質多聚體可連同血小板、血細胞、白細胞一起發生聚集，最終形成血栓。血小板在材料表面粘附、激活狀態的不同能反映出材料血液相容性的差異。因此通過測試材料表面吸附血小板數量及其結構狀態也是評價材料血液相容性的一種有效方法。

Xu等[7]用表面引發ATRP的方法將PEGMA先接枝到硅片的表面，從而在硅片的表面得到一層密實的PEGMA覆蓋層。然后利用ATRP反應后PEGMA末端帶的端基-Cl與肝素反應將肝素接枝上去，這樣得到的肝素接枝量可以達到很高(約14 μg/cm2)，如圖3所示。接枝后的表面對蛋白質吸附和血小板粘附有顯著的抑制作用，同時呈現出很好的抗凝血性能(血液再鈣化時間約150 min)。他們認為，接枝后的肝素之所以得以保持其良好的生物活性，是由于PEGMA擁有好的生物相容性，且它作為間隔臂為肝素在親水環境下提供了高的構象自由度。

圖3 Si-g-PEGMA-g-Heparin的制備過程

2.4 細胞相容性研究

通過測試材料表面對細胞粘附的抵抗情況以及細胞粘附后形態的變化等也是評價材料血液相容性的一種有效手段。

Singh等[8]通過SI-ATRP和硫醇分子自組裝的方法在金的表面制備了納米厚度的PEGMA聚合物刷子。分別研究了材料表面接枝密度和接枝鏈長對細胞粘附的影響，發現接枝了刷子狀聚合物(接枝密度大)的表面更能抗細胞粘附。

3 結語

血漿蛋白、血小板以及細胞在高分子材料表面的吸附對于材料誘發凝血都有著非常重要的作用，研究蛋白質、血小板以及細胞與材料表界面之間的相互作用機制對于制備出高性能血液相容性材料具有指導意義，通過以上研究可以有效評價改性材料與血液直接接觸后是否引發血小板聚集、凝血及血栓形成和溶血現象等問題。