小分子化合物對間充質干細胞復制性衰老的逆轉作用

黎彥，冀帥飛，付小兵，項江兵，陳華婷，劉藝瓊，周來顯，孫曉艷，吳旭

南方醫科大學南方醫院胸外科，廣州 510515

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具有強大自我更新能力和多向分化潛能的成體干細胞[1]。MSCs具有其他成體干細胞無法比擬的優勢，包括來源廣泛、取材容易[2]、分離操作簡單、免疫原性低、倫理爭議少等，因此以其為基礎的干細胞療法近年來受到廣泛關注，為治療各種難治性疾病帶來了新的契機[3-5]。能夠獲得足夠“數量”和“質量”的干細胞，是MSCs作為干細胞藥物應用于臨床規模化治療的前提條件。但大量基礎及臨床研究發現，經過體外擴增培養后，MSCs的生物學屬性(如植入性、分化潛能、免疫調節活性及歸巢能力等)發生了顯著改變，增加了制備批次間和療效的不確定性，特別是隨著體外傳代次數的遞增，胞內積累的DNA復制壓力和染色體縮合缺陷可引發染色體高頻畸變[6]，增加了MSCs產品臨床輸注的潛在風險[7]。因此，在體外培養體系中延緩或逆轉MSCs的衰老進程，并維持MSCs的原始生物學特性，將有助于進一步開發和完善MSCs的制備工藝，改善MSCs的臨床治療效果。基于小分子化合物的誘導重編程是近年來再生醫學的研究熱點[8]，特別是小分子化合物因靶點清晰、便于定量、作用相對可控，被廣泛應用于對體細胞的命運調控及功能干預方面的研究[9]。鑒于小分子化合物在體細胞重編程過程中的優勢，本課題組提出通過靶向干性相關的信號通路篩選獲得異性的小分子化合物組合，以作用于老化的MSCs，逆轉其衰老進程，使其在體外重新獲得可與年輕MSCs相媲美的生物學特性。本研究探索小分子全化學培養體系在延緩MSCs衰老進程、維持MSCs固有屬性中的作用，以期為優化MSCs的生產工藝、保證臨床級干細胞制備過程中MSCs的質量及其臨床應用效果提供理論參考。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 丙戊酸、Repsox購自美國Sigma公司；抗熒光淬滅封片劑(含DAPI)購自美國SouthernBiotech公司；Ki-67、OCT4、Nanog、P16、P21鼠單克隆抗體及Alex Fluor-594標記的二抗購自美國Abcam公司；DyLightTM488-鬼筆環肽(phalloidin)購自美國CST公司；β-半乳糖苷酶(SAβ-gal)染色試劑盒、山羊血清、4%多聚甲醛、Triton X-100、牛血清白蛋白(BSA)、細胞凋亡誘導劑購自北京索萊寶科技有限公司；cDNA第一鏈合成預混試劑、SuperReal熒光定量預混試劑購自北京天根生化科技有限公司；OCT4、Nanog、P16、P21引物購自上海生工生物工程股份有限公司；細胞凋亡試劑盒購自美國BD公司。激光共聚焦顯微鏡、光學顯微鏡購自美國Leica公司；流式細胞儀購自美國BD公司；實時熒光定量PCR儀購自美國Thermo Fisher公司。

1.2復制性衰老細胞模型的建立及小分子處理人臍帶MSCs由本實驗室保存。年輕MSCs在含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的低糖DMEM/F12培養基中培養，連續傳至20代(P20)，建立復制性衰老細胞模型(P20-MSCs)。將細胞密度為50%～60%的衰老MSCs隨機分為小分子處理組(SP20-MSC)與衰老模型組(P20-MSC)。小分子處理組于含丙戊酸(500 μmol/L)、Repsox(10 μmol/L)、10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的低糖DMEM/F12全化學培養體系中培養，衰老模型組繼續于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的低糖DMEM/F12培養體系中培養，每2～3 d更換1次全新培養基，培養7 d后進行后續實驗。取第5代臍帶MSCs(P5-MSC)作為對照組。

1.3細胞形態學觀察 取各組細胞各一皿，于光學顯微鏡下隨機挑選5個視野觀察細胞形態并拍照。

1.4SA-β-gal染色檢測細胞衰老程度 取各組細胞分別鋪于6孔板中，待細胞融合至80%時，用細胞固定液固定15 min，按照SA-β-GAL染色試劑盒說明書配制染色液，每孔加入2 ml染色液，置于37 ℃、無CO2環境中孵育過夜，光學顯微鏡下觀察細胞染色情況。各組隨機選取5個視野，計算陽性細胞率，取平均值。

1.5流式細胞術檢測細胞凋亡情況 各組取1×106個細胞重懸于1 ml PBS中，加入50 μmol/L細胞凋亡誘導劑作用20 min，300×g離心5 min，取細胞沉淀重懸于100 μl流式上樣緩沖液(含0.5% BSA的PBS)中，調整細胞密度為1×105個/ml，加入5 μl Annexin V-FITC室溫孵育10 min，再加入5 μl PI室溫孵育5 min，補充上樣緩沖液至400 μl，30 min內上機檢測細胞凋亡情況。

1.6免疫熒光染色觀察細胞中Ki-67、OCT4、Nanog、P21、P16蛋白的表達情況 取小分子處理組與衰老模型組細胞，分別鋪于共聚焦皿中，待細胞融合至80%時，用4%多聚甲醛溶液固定30 min，加入0.2% Triton X-100室溫通透20 min，加入5%山羊血清封閉30 min，加入一抗Ki-67(1:200)、OCT4(1:200)、Nanog(1:200)、P21(1:200)、P16(1:200)，4 ℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育1 h，加入phalloidin孵育20 min，DAPI染核，封片，熒光顯微鏡下拍照觀察，計算陽性細胞百分比。

1.7實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測OCT4、Nanog、P21、P16 mRNA的表達水平 取小分子處理組與衰老模型組細胞，提取總RNA，根據天根cDNA第一鏈合成試劑盒說明書步驟反轉錄成cDNA，以其為模板行RT-qPCR檢測。反應條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環后進行熔鏈分析。反應結束后取Ct值，以β-actin為內參，采用2–ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，實驗重復3次。引物序列如表1所示。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences of RT-qPCR

1.8劃痕實驗檢測細胞遷移能力 將各組細胞鋪在6孔板中，小分子處理組于添加小分子的DMEM/F12完全培養基中培養，對照組和衰老模型組于DMEM/F12完全培養基中培養。待細胞融合至100%時，用10 μg/ml絲裂霉素C處理1 h，然后用1000 μl槍頭在6孔板中垂直劃痕；PBS洗滌1次，清除劃痕周圍細胞團塊，加入2 ml相應培養基，置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養，24 h后觀察劃痕愈合情況，計算劃痕愈合百分比。

1.9Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力 將各組細胞用胰蛋白酶消化后，重懸于無血清培養基中；用細胞計數器計數，取10 000個細胞接種于Transwell上室中，補充無血清培養基至250 μl；下室中加入含15%胎牛血清的完全培養基，置于細胞孵箱中培養；6 h后取出上室，用2 ml PBS洗滌2次；浸入4%多聚甲醛溶液中固定30 min；PBS洗滌2次，加入0.1%結晶紫染色10 min；PBS洗滌3～5次，直至無紫色液體，顯微鏡下觀察上室透膜細胞染色情況，計數侵襲細胞數。

1.10克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力 將各組細胞用胰蛋白酶消化后，重懸于培養基中；用細胞計數器計數，取5000個細胞，混勻于2 ml DMEM/F12培養基(含20%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素)中，均勻鋪于100 mm皿中，置于37.5 ℃、5% CO2孵箱中培養2周，期間按時補充培養基，培養結束后，棄掉培養基，加入1 ml 4%多聚甲醛溶液固定30 min；PBS洗滌2次，加入0.1%結晶紫染色10 min；PBS洗滌3～5次，直至無紫色液體，顯微鏡下觀察細胞染色情況，計數細胞集落數。

1.11統計學處理 采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1小分子化合物對MSCs形態的影響 光學顯微鏡下觀察顯示，對照組細胞呈梭形或不規則三角形；衰老模型組細胞體積增大、邊界模糊，細胞形態由梭形或不規則三角形逐漸變為扁平狀，胞質呈現凸起增多現象；小分子處理組細胞凸起減少，形態為梭形及不規則三角形，少數呈橢圓狀(圖1)。

圖1 顯微鏡下觀察小分子化合物對MSCs形態的影響Fig.1 Effects of small molecule compounds on the morphology of MSCs

2.2小分子化合物對MSCs衰老的影響 SA-β-gal染色結果顯示，對照組、衰老模型組及小分子處理組細胞SA-β-gal染色陽性率依次為2.23%±1.00%、84.80%±1.50%、45.00%±1.23%。與對照組比較，衰老模型組及小分子處理組細胞SA-β-gal染色陽性率增高，差異有統計學意義(P＜0.001)；與衰老模型組比較，小分子處理組細胞SA-β-gal染色陽性率降低，差異有統計學意義(P＜0.001)(圖2)。

圖2 小分子化合物對MSCs衰老的影響(SA-β-gal染色)Fig.2 Effects of small molecule compounds on the senescence of MSCs (β-galactosidase staining)

2.3小分子化合物對MSCs凋亡的影響 流式細胞術檢測結果顯示，對照組、衰老模型組及小分子處理組細胞凋亡率依次為5.96%±0.80%、31.40%±0.80%、21.60%±1.20%。與對照組比較，衰老模型組及小分子處理組細胞凋亡率增高，差異有統計學意義(P＜0.05)；與衰老模型組比較，小分子處理組細胞凋亡率降低，差異有統計學意義(P＜0.05)(圖3)。

圖3 流式細胞術檢測小分子化合物對MSCs凋亡的影響Fig.3 Effects of small molecule compounds on the apoptosis of MSCs (Flow cytometry)

2.4小分子化合物對MSCs增殖的影響 免疫熒光染色結果顯示，小分子處理組Ki-67陽性細胞百分比高于衰老模型組，差異有統計學意義(89.00%±1.50%vs. 25.00%±2.00%，P＜0.001，圖4)。

圖4 小分子化合物對MSCs增殖的影響(免疫熒光染色)Fig.4 Effects of small molecule compounds on the proliferation of MSCs (Immunofluorescence staining)

2.5小分子化合物對MSCs衰老相關基因mRNA和蛋白以及干性相關基因mRNA和蛋白表達的影響 RT-qPCR檢測結果顯示，小分子處理組中P16、P21 mRNA相對表達量低于衰老模型組(P16：69.00%±6.20%vs. 100.00%±12.00%，P＜0.05；P21：55.00%±7.00%vs. 100.00%±20.00%，P＜0.05)，OCT4、Nanog mRNA的相對表達量較衰老模型組分別上調3.30±0.23、5.20±0.97倍，差異有統計學意義(P＜0.001，圖5)。

圖5 小分子化合物對MSCs衰老相關基因P16、P21及干性相關基因OCT4、Nanog mRNA表達的影響(RT-qPCR)Fig.5 Effects of small molecule compounds on the mRNA expressions of cellular senescence genes P16, P21 and cell stem genes OCT4, Nanog of MSCs

免疫熒光染色結果顯示，小分子處理組中P16、P21陽性細胞百分比均低于衰老模型組(P16：64.00%±3.20%vs. 98.00%±1.50%，P＜0.05；P21：45.00%±1.10%vs. 82.00%±2.00%，P＜0.05，圖6A、B)，OCT4、Nanog陽性細胞百分比均高于衰老模型組(OCT4：88.40%±0.80%vs. 25.40%±1.20%，P＜0.001；Nanog：76.30%±1.70%vs. 10.50%±0.60%，P＜0.001，圖6C、D)。

圖6 小分子化合物對MSCs衰老相關蛋白P16、P21及干性相關蛋白OCT4、Nanog表達的影響(免疫熒光染色)Fig.6 Effects of small molecule compounds on the expressions of cellular senescence proteins P16, P21 and cell stem proteins OCT4, Nanog of MSCs (Immunofluorescence staining)

2.6小分子化合物對MSCs遷移能力的影響 劃痕實驗結果顯示，對照組、衰老模型組及小分子處理組24 h劃痕愈合百分比依次為58.10%±5.45%、30.60%±4.40%、49.30%±3.30%。與對照組比較，衰老模型組24 h劃痕愈合百分比降低，差異有統計學意義(P＜0.05)；與衰老模型組比較，小分子處理組24 h劃痕愈合百分比增高，差異有統計學意義(P＜0.01，圖7)。

圖7 劃痕實驗檢測小分子化合物對MSCs遷移能力的影響Fig.7 Effects of small molecule compounds on cell migration ability of MSCs detected by migration experiment

2.7小分子化合物對MSCs侵襲能力的影響Transwell侵襲實驗結果顯示，對照組、衰老模型組及小分子處理組侵襲細胞數分別為(140.00±17.00)個、(34.00±9.00)個、(90.00±12.00)個。與對照組比較，衰老模型組及小分子處理組侵襲細胞數減少，差異有統計學意義(P＜0.05)；與衰老模型組比較，小分子處理組侵襲細胞數增多，差異有統計學意義(P＜0.05)(圖8)。

圖8 小分子化合物對MSCs侵襲能力的影響(Transwell)Fig.8 Effects of small molecule compounds on cell invasion ability of MSCs (Transwell)

2.8小分子化合物對MSCs克隆形成能力的影響克隆形成實驗結果顯示，對照組、衰老模型組及小分子處理組細胞集落數依次為(247.00±20.00)個、(68.00±7.00)個、(144.00±10.00)個。與對照組比較，衰老模型組及小分子處理組細胞集落數減少，差異有統計學意義(P＜0.05)；與衰老模型組比較，小分子處理組細胞集落數增多，差異有統計學意義(P＜0.001)(圖9)。

圖9 小分子化合物對MSCs克隆形成能力的影響Fig.9 Effects of small molecules on the clone forming ability of MSCs

3 討 論

本研究采用一種安全、有效的方法在體外抑制并逆轉MSCs的衰老進程，維持MSCs的固有生物學特征，結果顯示，構建的含小分子丙戊酸、Repsox的全化學培養體系可下調衰老細胞中SA-β-gal的表達，降低衰老細胞中P16、P21的表達水平，促進細胞增殖，并增強衰老細胞的遷移、侵襲和克隆形成能力，同時抑制老化MSCs的程序性凋亡，提示小分子化合物作用于衰老MSCs能夠促使細胞向年輕狀態轉化。

MSCs是再生醫學基礎與臨床研究中重要的種子來源細胞之一，也是少數被準許應用于臨床治療的成體干細胞之一，其安全性已得到廣泛驗證。ClinicalTrials網站上注冊的與MSCs相關的臨床試驗已經超過1050項，已有10種基于MSCs的干細胞類藥物獲批上市，并在臨床應用于多種疾病的治療，如促進風濕性關節炎的愈合[10]、緩解重癥急性呼吸窘迫綜合征的癥狀[11]等。但不同體系與批次分離獲得的MSCs在固有表征和分化潛能方面不同，難以滿足大規模臨床治療對細胞質量的要求。因此，篩選靶向干性相關信號通路的小分子組合，建立全化學誘導體系，在提供穩定、均一、優質種子細胞的同時，逐步替代外源性基因的表達，可從根本上解決MSCs臨床應用中的安全性和效率問題。有研究發現，含有Repsox的小分子組合能啟動體細胞重編程，成功將成纖維細胞重編程為多能干細胞[12]。另有研究發現，Repsox作為一種選擇性TGF-β通路抑制劑，具有促進MSCs增殖、維持MSCs生物學特性的作用[13]。Zhou等[14]使用丙戊酸配合蛋白質轉染技術誘導出了誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，其原理可能是由于丙戊酸提升了胞內組蛋白乙酰化的水平，從而幫助染色體解離，進而提升了重編程的效果[15]。

本研究發現，在使用DMEM/F12培養基(含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素)的培養體系下，經過15～20代次的培養，80%以上的細胞SA-β-gal染色陽性，表明此時絕大部分細胞開始衰老，細胞形態也從長梭形變為攤開狀，細胞質凸起，細胞增殖能力減弱。在種植密度為50%的情況下，年輕細胞培養2～3 d即長滿培養皿，衰老細胞則需要7～10 d才可長滿；衰老細胞的遷移、侵襲能力明顯下降，且伴隨部分細胞凋亡。

在相同的培養體系下，加入丙戊酸(500 μmol/L)和Repsox (10 μmol/L)繼續培養7 d，細胞形態即出現明顯變化，從攤開狀變為橢圓形，且出現明顯的細胞集落，表明細胞的克隆能力增強，與后續克隆形成實驗的結果相吻合(圖9)。本研究檢測小分子處理組、衰老模型組細胞衰老相關及干性相關基因和蛋白的表達，結果顯示，經小分子處理后，衰老相關基因P16和P21 mRNA和蛋白的表達均明顯下調，與SA-β-gal染色結果相吻合，而干性相關基因OCT4和Nanog mRNA和蛋白的表達均明顯上調，MSCs的增殖能力、遷移能力、侵襲能力增強，細胞凋亡減弱。

綜上所述，本研究結果表明，構建的小分子全化學培養體系(含丙戊酸500 μmol/L和Repsox 10 μmol/L)能夠抑制并部分逆轉體外長期培養的MSCs的衰老進程。本研究借助小分子化合物，采用純化學手段在體外抑制并逆轉了MSCs的復制性衰老進程，避免了使用外源性基因出現的不可控風險，且小分子來源普遍，效果可靠，作用明確，是維持MSCs生物學屬性良好的添加劑，有助于維持體外培養的MSCs的各項功能，為MSCs的科學研究與臨床應用對接提供了新的思路。本研究發現小分子化合物組合對MSCs復制性衰老具有逆轉作用，且小分子Repsox及丙戊酸的作用靶點清晰，但這兩種小分子逆轉細胞衰老的作用機制尚有待深入研究，且在體外培養條件下，導致細胞衰老的因素較多，如氧化應激、高糖等，復制性衰老僅為其中一種，小分子化合物是否對其他原因導致的細胞衰老有效尚需進一步研究。