細顆粒物PM2.5對大鼠IL-10、IL-22 表達的影響及百令膠囊的干預作用

張寧，田碩，林樺，李萍，牛姝，蘇力，平芬

空氣污染是當今人類面臨的問題，也是引起呼吸系統疾病的主要原因之一，其主要原因是現代工業的發展和汽車尾氣的過量排放[1]。空氣中顆粒物(particulate matter，PM)分為超細(≤0.1 μm)、細(≤2.5 μm)、粗(≤10 μm)及顆粒[2]。由于PM分散均勻，在空氣中停留很長一段時間，因此其可滲透到呼吸系統的最深處，此外，由于PM2.5表面積大，它可以與金屬、重金屬、多環芳烴、類金屬、元素碳、病毒、細菌、真菌孢子、內毒素、水溶性離子鹽等結合，長期和短期暴露在PM2.5中與一系列負面健康后果有關，包括呼吸系統疾病、生殖系統疾病、心血管疾病、血液系統疾病、生存期的減少，全世界死亡總人數約7.6%(4 200萬)與PM2.5接觸有關[3-5]。

發酵蟲草菌粉是百令膠囊的主要生物成分，其具有多種藥理作用，已被用于呼吸系統疾病的治療，如咳嗽、氣喘、慢性支氣管炎肺氣腫、肺間質纖維化等[6]。同時也證明其能抑制炎性反應，防止許多器官的缺血性損傷[7]。現通過觀察PM 2.5 及百令膠囊對大鼠血清白介素 10(interleukin，IL-10)、IL-22含量及mRNA水平的影響，進一步證實百令膠囊對大鼠肺損傷的抗炎作用，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 40只清潔級Wistar雄性大鼠，180～200 g，購自河北醫科大學實驗動物中心(動物質量合格證：1912162)，研究前1周適應動物房間條件，動物在室溫23～25℃和相對濕度25%～30%下保持12 h的光/暗循環。實驗過程中根據實驗動物管理和保護有關規定進行操作。

1.2 PM2.5懸液配制 2019 年5—8月期間用大流量采樣器采用玻璃纖維濾膜(河北省故城縣環境檢測器材廠生產)采集大氣PM2.5細顆粒物。細顆粒物濾膜剪切成 1 cm×2 cm長方形小條，置于去離子水中，使用超聲波清洗器(型號:JL-120DT，昆山超聲儀器有限公司生產)洗脫，3 000 r/min離心20 min，4℃冷凍真空干燥，收集粉末留待備用。臨用前，稱取一定重量的PM2.5，用生理鹽水配制成相應濃度的 PM2.5混懸液，超聲震蕩混勻，4℃保存。

1.3 實驗動物分組及給藥方法 2019年9—10月于河北省人民醫院動物研究中心進行實驗，40只大鼠隨機數字表法分為5組，分籠飼養。分別標記為空白對照組、PM 2.5染毒組及PM2.5+低、中、高劑量百令膠囊給藥組(百令膠囊購自河北省人民醫院)。PM2.5染毒大鼠通過氣管滴注濃度為10 mg/kg PM2.5混懸液進行造模，每3天1次，共染毒 10 次；PM2.5+百令膠囊給藥組：給予百令膠囊灌胃(滴注細顆粒物期間同時給予藥物)28 d，灌胃劑量分別為 0.25、0.5、1.0 g/kg。

1.4 標本采集 末次染毒24 h后，予大鼠腹腔內注射10%水合氯醛(0.30 ml/kg)麻醉，腹主動脈采血，全血以3 000 r/min離心10 min，提取血清，-80℃冰箱保存。處死大鼠后取肺臟，4%多聚甲醛固定右肺下葉組織，石蠟包埋，切片(片厚3～4 μm)，進行HE染色，光鏡下觀察肺組織炎性病理改變。左下肺組織凍存備用。

1.5 ELISA法檢測大鼠血清IL-10、IL-22蛋白 采用酶聯免疫法(ELISA)檢測血清IL-10和IL-22蛋白含量，嚴格按照試劑盒說明書操作(試劑盒購自美國 BG 公司)。

1.6 實時熒光定量PCR(QRT-PCR)法檢測大鼠肺組織IL-10、IL-22 mRNA表達 采用TRNzol總RNA提取試劑(北京天根科技公司生產)進行樣本RNA提取，PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa,北京天根科技公司生產)進行cDNA反轉錄，再進行PCR擴增。以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內參，IL-10上游引物序列：5’-CTTTAAGGGTTACTTGGGTTGC-3’；下游引物：5’-CCACTGCCTTGCTTTTATTC-3’，擴增產物全長200 bp；IL-22上游引物序列：5’-TACTATGGGAGGGTGATG-3’；下游引物：5’-GTTTGGTTTCTATGTGGC-3’，擴增產物全長156bp。每個樣本檢測3個復孔，數據采用2-△△ CT法進行分析。

2 結 果

2.1 各組大鼠肺組織病理變化比較 光鏡下，空白對照組大鼠肺組織未見明顯炎性反應；PM2.5染毒組可見大量慢性炎性細胞浸潤，肺泡間隔明顯增寬，寬窄不一，肺間質內血管擴張，肺泡腔內無明顯滲出物；高劑量百令膠囊干預組較PM2.5染毒組炎性細胞浸潤情況明顯減輕，低劑量及中劑量百令膠囊干預組病理表現介于PM2.5染毒組及高劑量百令膠囊干預組之間，見圖1。

2.2 各組大鼠血清 IL-10、IL-22水平比較 PM2.5染毒組大鼠血清IL-10水平明顯低于空白對照組(t=27.758，P=0.000)，IL-22水平明顯高于空白對照組(t=28.190，P=0.000)。與PM2.5染毒組比較，百令膠囊各干預組隨劑量的增加，血清IL-10水平逐漸升高(F=224.867，P=0.000)，而血清IL-22水平則逐漸下降(F=149.115，P=0.000)，見表 1。Pearson相關分析表明，血清IL-10 和IL-22水平呈負相關(r=-0.960，P<0.01)。

表1 各組大鼠血清IL-10、IL-22水平比較

2.3 各組大鼠肺組織IL-10、IL-22 mRNA表達比較 RT-PCR 結果顯示；PM2.5染毒組大鼠肺組織IL-10 mRNA表達明顯低于空白對照組(t=61.342，P=0.000)，IL-22水平明顯高于空白對照組(t=-55.298，P=0.000)。與PM2.5染毒組比較，百令膠囊干預組隨劑量增高，肺組織IL-10 mRNA表達升高(F=1 131.931，P=0.000)，IL-22 mRNA水平則呈下降趨勢(F=604.257，P=0.000)，見表2、圖2。

注：A.空白對照組;B.PM2.5染毒組;C.低劑量百令膠囊干預組;D.中劑量百令膠囊干預組;E.高劑量百令膠囊干預組圖1 各組大鼠肺組織病理表現(HE染色，×200)

表2 各組大鼠肺組織IL-10、IL-22 mRNA表達水平比較

注：與空白對照組比較，aP<0.01；與PM2.5染毒組比較，bP<0.05；與低劑量百令膠囊干預組比較，cP<0.05；與中劑量百令膠囊干預組比較，dP<0.05圖2 各組大鼠肺組織IL-10、IL-22 mRNA表達比較

3 討 論

顆粒物是大氣污染物的主要組成部分，它可導致急性或慢性呼吸系統疾病，如急性支氣管炎、支氣管哮喘、肺癌等，也可以引發慢性呼吸系統疾病加重，但其對人類呼吸系統的毒性影響及確切機制并不明確[8]。顆粒可能通過提高氣道反應性、促進氧化應激、引起炎性反應、降低宿主免疫防御機制，從而導致肺部疾病的發生或惡化[9-10]。

百令膠囊是由發酵冬蟲夏草菌粉組成的人工制劑，與天然蟲草主要成分一致。百令膠囊還富含氨基酸、核苷酸、蟲草酸、蟲草多糖等物質，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多重作用[11-12]。目前通過體外試驗證明，冬蟲夏草是一種免疫調節活性成分，可增加抗炎因子的表達[13-14]。

肺部炎性反應是導致肺部疾病(包括肺損傷)發病的中心效應[15]，包括T細胞、單核細胞/巨噬細胞、淋巴細胞和粒細胞等多種免疫細胞，以及它們釋放的細胞因子如IL-6、IL-1β和TNF-α、IL-10等參與炎性反應和組織損傷[16]。

IL-10細胞因子家族包括IL-10、IL-19、IL-20、IL-22、IL-24和IL-26，被認為是2α螺旋細胞因子。其中IL-10是最重要的抑制細胞因子，可以抑制炎性反應、限制過度免疫反應[17]。IL-10是NF-κB的一種強有力的抑制劑，其抗炎活性主要是通過這種方式介導的，另外，STAT 1/SOCS-3信號通路的激活是IL-10的另一抗炎機制[18]。本研究結果提示，PM2.5染毒組IL-10水平明顯低于空白對照組，百令膠囊干預組IL-10水平明顯高于PM2.5染毒組，提示百令膠囊可能通過上調IL-10減輕PM2.5導致的炎性反應。

IL-22是新近報道的IL-10細胞因子家族中的一員，IL-22與IL-10結構相似，兩者共用IL-10R2鏈，CD4+T輔助細胞、γδT細胞、自然殺傷(NK)T細胞和第3組固有淋巴樣細胞(ILC 3)通常是IL-22的主要細胞來源[19]。IL-22的表達具有異質性，Starkey等[20]發現輕度至中度COPD患者氣道上皮細胞中IL-22和IL-22RmRNA的表達增加，而在重度COPD患者中無明顯變化。IL-22在哮喘中具有雙重作用，它能在臨床前模型中促進哮喘的發生，但能減輕抗原抗體免疫反應和惡化時的炎性反應[21]。IL-22的雙向作用，取決于細胞因子環境或者疾病的病理狀態，主要通過STAT3信號途徑發揮生物學作用[22]，本研究發現，IL-22在PM2.5染毒組中明顯升高，中、高劑量百令膠囊干預組IL-22 水平明顯低于MP2.5染毒組，提示百令膠囊可能通過下調IL-22來拮抗PM2.5導致的肺損傷。

本研究結果表明，PM2.5可導致肺部炎性反應，而IL-10及IL-22分別是PM2.5介導炎性反應的重要抗炎介質及炎性介質，兩者具有相反的生物學活性，百令膠囊可能通過促進IL-10的分泌，以及抑制IL-22的生成，對肺部起到保護作用，但是其中機制，尚需未來進一步的深入研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

張寧：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；田碩、牛姝：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改;林樺、李萍：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核;蘇力：進行統計學分析;平芬：課題設計，論文撰寫