芽孢桿菌苧麻脫膠動態過程分析

吳亞 劉一 舒潼 王慧慧 李攀登 楊英 余龍江

（華中科技大學生命科學與技術學院，武漢 430074）

苧麻纖維具有單根纖維長、韌性強、導熱性好、吸濕散熱快、防霉、抗菌、抗紫外線等優點，被譽為“天然纖維之王”，廣泛應用于紡織、家居、汽車等行業。我國苧麻纖維產量占世界的95%，所以，苧麻又被稱為“中國草”［1］，是我國特有的天然紡織原料。苧麻韌皮部被稱為原麻，干燥后的原麻中含有多種化學成分，其主要成分是纖維素，約占70%。剩下的30%的非纖維素成分在紡織工業中被稱為膠質。這些膠質主要包括果膠、半纖維素、水溶物、木質素、脂蠟脂、灰分。在苧麻紡織工業中，苧麻脫膠過程稱為“脫膠”［2-3］。目前市面上常用的脫膠方法有化學脫膠、生物脫膠、微生物脫膠［4-5］。

化學脫膠是指利用苧麻韌皮中纖維素和膠質對酸、堿和氧化劑的穩定性差異進行脫膠，國內外普遍采用此類方法。由于化學脫膠工藝過程中需要滿足的條件比較復雜，纖維素與半纖維素物質對化學反應試劑及高溫的穩定性沒有嚴格界線。因而苧麻化學脫膠工藝存在工藝多、耗時長、能耗高、勞動強度大、污染嚴重等缺點，無法滿足綠色環保的要求［6-7］。而且，苧麻原纖維的酸處理對苧麻纖維的損傷很大，導致苧麻精干麻質量下降，不能作為高檔紡織品生產的原料，嚴重影響了苧麻精干麻的價格。

酶脫膠是利用脫膠菌產生的一系列脫膠酶進行脫膠，使原麻上的半纖維素、果膠等物質脫離下來，從而達到脫膠的目的［8］。常用的脫膠酶包括半纖維素酶、果膠酶和木質素酶三大酶系。Zhang等［9］將果膠酶、半纖維素酶等酶混合作用于苧麻纖維脫膠，脫膠后的纖維舒適度、纖維強度、白度和殘膠率都有了顯著改善，有利于后續的工業紡織。Basu等［10］利用從短小芽孢桿菌中克隆得到的果膠裂解酶處理苧麻，使纖維的膠質減少了25%。果膠在原麻膠質中起到與其他成分膠連的作用，因而對于果膠的去除十分重要。酶法脫膠反應條件較溫和，對苧麻纖維損傷較小，但由于酶制劑研發成本較高，目前未能取得大規模應用。

微生物脫膠是利用能產生多種酶的菌株擴大培養后接種到苧麻上，利用降解后的單糖作為營養物質進行生存繁殖。微生物脫膠最關鍵的是脫膠菌的篩選，一株好的菌株可達到非常好的脫膠效果［11］。Saikia等［12］分別利用枯草芽孢桿菌和霉菌進行苧麻脫膠處理，經細菌和真菌處理4 d后，纖維殘余膠量分別下降到10.4%和9.7%。Wang等［13］利用高產果膠酶的蠟樣芽胞桿菌PO5聯合高產木聚糖酶的假單胞菌X12在開放環境處理苧麻韌皮60 h，最終脫膠率達79.6%。本團隊樊培和張非等［14-15］通過分析苧麻韌皮纖維膠質成分及其與脫膠酶的相互作用，建立了脫膠優勢菌株的篩選策略，獲得系列優勢脫膠菌株如HG-25、HG-28、HG-49，并建立了苧麻精干麻生物清潔生產技術，在微生物混合脫膠、發酵工藝優化、廢水循環利用等方面都取得了不錯的成績，工業化應用已形成一定規模。微生物脫膠工藝取得了越來越多的突破進展，是目前研究的重點，但是仍存在脫膠時間較長，不同批次菌株脫膠效果不均勻，殘膠率較高等問題，本實驗室保藏的芽孢桿菌LY11含有豐富的果膠、甘露聚糖酶系，能高效利用苧麻韌皮膠質增殖，其生物量達到5.63 g/L，生物脫膠過程中，LY11產果膠酶活與甘露聚糖酶活較高，且不產纖維素酶，可作為優良的苧麻脫膠菌株。因而需要對其脫膠過程動態變化進行深入研究，闡明脫膠過程機理，挖掘影響微生物脫膠關鍵因素，優化相應的控制方法，最終實現微生物高效穩定脫膠。

本實驗旨在通過分析苧麻生物脫膠過程中脫膠微生物、脫膠酶活、苧麻化學成分變化，揭示生物脫膠過程特征，確定脫膠關鍵酶系，揭示生物脫膠過程機理，為實現微生物脫膠技術大規模應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 菌株為華中科技大學資源生物學與生物技術研究所選育并保藏的芽孢桿菌LY11，苧麻原麻產自湖北省咸寧市，由湖北精華紡織集團有限公司提供。

1.1.2 主要培養基 LB固體培養基：1%蛋白胨，0.5%酵母粉，1%氯化鈉，1.2%瓊脂粉，pH自然，高壓蒸汽滅菌20 min。菌種的短期保藏用斜面培養基，菌種的純化用平板培養基。

LB液體培養基：1%蛋白胨，0.5%酵母粉，1%氯化鈉，高壓蒸汽滅菌20 min。LB液體培養基用于菌種的活化。

1.1.3 試劑和儀器 酵母粉，氯化鈉，蛋白胨，瓊脂粉，濃鹽酸，冰醋酸，3，5-二硝基水楊酸，磷酸二氫鉀，羧甲基纖維素鈉，魔芋精粉，葡萄糖，果膠，無水亞硫酸鈉，四水酒石酸鉀鈉，苯酚，木糖，甘露糖，D-半乳糖醛酸，木聚糖，氫氧化鈉，草酸銨，醋酸，次氯酸鈉。Nova NanoSEM450場發射掃描電子顯微鏡，臺式高速離心機H1650W，FE20實驗室pH計，電熱鼓風干燥箱 101A3ET，紫外分光光度計UV1600PC，低速離心機TDL5A。

1.2 方法

1.2.1 菌種制備 將保存在-80℃冰箱中的菌株轉入一組新鮮固體培養基中，37℃培養12 h，然后轉入另一組新鮮固體培養基中，37℃培養12 h，使菌株充分活化。然后，將菌株接種于液體培養基中，在37℃、180 r/min培養OD600值至0.5左右，約6 h。

1.2.2 苧麻微生物脫膠方法 取原麻5 g左右，將麻樣于105℃烘箱烘至恒重后稱重。浴比為1∶10，接種量10%（針對脫膠體系），轉速180 r/min，溫度37℃脫膠16 h，期間每2 h取樣測定pH、酶活、生物量。苧麻化學成分定量分析方法：苧麻含膠率、脫膠率、殘膠率及各成分含量（脂蠟質、半纖維素、果膠、木質素、灰分）根據中華人民共和國國家標準GB/T 5889-86苧麻化學成分定量分析方法進行測定。

1.2.3 生物脫膠過程脫膠液菌體及還原糖變化的動態分析 菌體個數測定，每2 h取0.1 mL脫膠菌液用無菌生理鹽水稀釋適當濃度，于血球計數板進行計數，雜菌根據菌落形態并結合鏡檢進行測定。還原糖變化分析，利用分光光度計測定其吸光度，以葡萄糖標準曲線為標準表征其還原糖含量。

1.2.4 酶活測定 采用二硝基水楊酸（DNS）法測定其果膠酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶和纖維素酶活力。果膠酶活力測定原理：在果膠酶作用下，果膠可被降解為還原性糖，DNS在堿性條件下可與半乳糖醛酸發生反應，且產物在沸水浴條件下顯色。產物顏色的深淺與生成的還原糖的量成正比，從而通過反應液顏色表征脫膠液中果膠酶的活力。

果膠酶活測定：取0.9 mL果膠溶液于試管中，加入0.1 mL脫膠上清液，37℃反應10 min，然后加入1.5 mL DNS溶液混合均勻于沸水浴條件下5 min，冰水冷卻10 min后測定吸光值 OD540。酶活性定義：在特定條件（37℃、pH7.0）下，每分鐘內轉化生成1 μmol半乳糖醛酸所需酶量為一個酶活性單位U。甘露聚糖酶、木聚糖酶和纖維素酶活力測定時底物分別為甘露聚糖、木聚糖和羧甲基纖維素鈉，產物分別為甘露糖、木糖和葡萄糖。

1.2.5 苧麻原麻形態分析 通過對不同處理時期的苧麻進行取樣，對苧麻硬條、硬塊、夾生、斑疵、碎麻、手感軟硬程度的分析進行表觀判斷。通過掃描電鏡觀察麻纖維的表面形貌。具體操作步驟如下：將苧麻樣品送華中科技大學國家光電實驗室。將樣品切至0.5 cm左右，貼于銅板上，噴金30 s，在Nova nanosem450場發射掃描電鏡下觀察。

2 結果

2.1 苧麻生物脫膠過程中菌體個數及還原糖的動態分析

由圖1可知，菌株LY11在苧麻生物脫膠過程的延滯期較短，4-6 h內其生物量迅速增加，還原糖含量也迅速增加，這說明在脫膠過程中，LY11分泌的水解酶使膠質大量降解，產生的單糖為其生長提供營養成分從而使其大量繁殖。6-8 h還原糖含量基本不變，8-10 h出現下降，說明此時菌體處于生長期，對糖利用率提高。接種脫膠12 h時，脫膠菌個數最多，達到21.458×109CFU/mL，12 h后菌體處于衰亡期，還原糖含量由于菌體利用率降低而上升。接種后，雜菌的生長速度相對較慢，直至衰老期，說明菌株LY11比其他菌株有一定的生長優勢，雜菌在脫膠過程中不會對其造成太大的影響。

圖1 苧麻生物脫膠過程脫膠液還原糖含量和菌體量變化Fig. 1 Variations in reducing sugar content and bacterial mass in the degumming solution from the biological degumming process of ramie fiber

2.2 苧麻生物脫膠過程中膠質成分的動態分析

2.2.1 苧麻原麻膠質成分分析 對原麻進行了成分測定，其包含了多種結構復雜的化學成分，如表1所示。纖維素含量占到73.75%。其余物質在麻紡工業中稱其為膠質，這些膠質主要包括果膠4.27%、半纖維素（木聚糖、甘露聚糖）13.87%、木質素0.95%、水溶物5.58%、脂蠟質1.58%。由此可知，對于苧麻膠質的去除，主要是對于半纖維素和果膠的去除，因此這幾種相對應的水解酶對于苧麻脫膠是十分重要的。

表1 苧麻原麻化學成分Table 1 Chemical composition of raw ramie fiber

2.2.2 苧麻生物脫膠過程中膠質成分動態分析 由圖2可知，經過16 h生物脫膠后，苧麻原麻殘膠量由初始的26.25%降至11.48%，脫膠率達56.27%。2-8 h是脫膠的高峰期，10 h后，脫膠率呈緩慢上升趨勢。

圖2 苧麻生物脫膠過程脫膠率和殘膠量變化Fig. 2 Variation of degumming rate and residual gum amount during the biological degumming process of ramie fiber

由圖3可知，在脫膠初期，水溶性物質的去除率較高，在脫膠前6 h，水溶性物質的去除率約為60%。脫膠16 h后，果膠去除率高達93.9%，果膠的大量去除，保證了后續半纖維素的協同降解。菌株LY11對半纖維素的去除率為39.6%，脫膠后脂蠟質的去除率為45.3%，其主要化學成分為高級脂肪酸和高級醇形成的酯類，木質素含量在整個脫膠過程中幾乎沒有變化，因而菌株LY11幾乎不能降解木質素。

圖3 苧麻生物脫膠過程各膠質成分去除率變化Fig. 3 Variations in the removal rate of various colloid components in the biological degumming process of ramie fiber

2.3 苧麻生物脫膠過程中脫膠酶活性的動態分析

由圖4可知，在LY11生物脫膠過程中，一直檢測不到纖維素酶酶活，這對于苧麻脫膠十分有利，避免了其有利成分（纖維素）的損失。果膠酶與甘露聚糖酶活性在0-8 h內先升高，8-16 h緩慢降低，二者均在脫膠8 h時酶活最高，通過圖2從脫膠率和殘膠量的變化趨勢可以看出，菌株LY11的脫膠效率與果膠酶、甘露聚糖酶的酶活變化趨勢基本一致。果膠酶達到116.4 U/mL，反應16 h后酶活為77.73 U/mL，其較高酶活保證了黏連膠質的順利去除，使其去除率達到了93.9%。甘露聚糖酶酶活也較高，最高酶活達到96.72 U/mL。同時在脫膠過程中檢測到木聚糖酶活性，但其酶活力很低。

圖4 苧麻生物脫膠過程菌株LY11酶活變化Fig. 4 Variations of enzyme activity of strain LY11 in the biological degumming process of ramie fiber

2.4 苧麻生物脫膠過程中苧麻形態動態分析

為直觀感受菌株LY11苧麻脫膠效果，對0-16 h脫膠苧麻的手感柔軟程度、外觀色澤、硬塊、硬條、斑疵、夾生、碎麻等指標進行評定。如圖5所示，苧麻原麻呈黃褐色，手柄硬脆，其中硬塊條較多，纖維相互纏繞，苧麻皮、殼等雜質較多。菌株LY11的苧麻外觀和手感隨脫膠時間呈顯著差異。如表2所示，在脫膠初期，苧麻纖維的手感仍然是硬而直的，外觀與原麻相似。脫膠8 h后，開始出現絲狀纖維，整個纖維開始變軟。脫膠8-16 h后，析出大量有光澤的白色纖維，手感柔軟，無硬塊、硬條、斑點疵點和斷麻。苧麻精干麻呈純白色，光澤絲狀，非常柔軟，觸感溫和，毛刺少，可作為優良的紡織原料。

表2 苧麻生物脫膠過程不同時段苧麻外觀評定Table 2 Appearance evaluation of ramie at different periods during the biological degumming process of ramie fiber

圖5 苧麻生物脫膠過程不同時段苧麻外觀Fig. 5 Appearance of ramie at different periods during the biological degumming process of ramie fiber

由圖6的掃描電鏡觀察結果可知，菌株LY11生物脫膠4 h后，苧麻纖維表面的膠質有所減少，纖維之間的黏連程度降低。脫膠8 h后，苧麻纖維表面的膠質成分明顯減少，纖維有分散的趨勢。脫膠12 h后，部分相鄰纖維開始分離，纖維表面變得光滑。脫膠結束時，大部分非纖維素成分被去除，苧麻纖維表面光滑，僅有少量膠質殘留，苧麻單纖維基本分離。可見，菌株LY11對苧麻原麻脫膠16 h后，大部分果膠、半纖維素等膠質成分被去除，苧麻單纖維分離度好，表面光滑。結果表明，脫膠菌株能有效、均勻地滲透到苧麻纖維內部，完成脫膠。

圖6 苧麻生物脫膠過程不同時段苧麻掃描電鏡觀察Fig. 6 Scanning electron microscope observation of ramie at different periods during the biological degumming process of ramie fiber

3 討論

通過對脫膠過程中菌體數量、酶活以及還原糖變化分析可知，在脫膠初期0-4 h內，苧麻中大量的水溶性糖溶解，導致脫膠液中還原糖含量迅速增加。此時，菌株仍還不能大量使用還原糖，果膠酶、甘露聚糖酶活性也不斷增強，從而使還原糖含量上升。進入對數生長期6-10 h后，細菌大量繁殖，迅速消耗還原糖，還原糖含量呈現下降趨勢，果膠酶、甘露聚糖酶酶活達到較高水平，說明菌株LY11分泌的果膠酶、甘露聚糖酶能夠有效降解膠質，產生大量還原糖，還原糖作為營養物質供菌體生長繁殖和代謝，從而還原糖含量降低。而在脫膠后期10-12 h，菌體雖然還在生長，但速度緩慢，已經處于穩定期，此時對還原糖的消耗降低，然而酶促反應仍在進行，從而使得還原糖含量升高。12-14 h，細菌處于衰老期，且半纖維素酶酶活降低，可能是由于其酶穩定性較差，使菌體對還原糖利用率下降，還原糖含量逐漸增加。本研究也進一步豐富了孫慶祥研究團隊［16］提出的菌產酶、酶脫膠、膠養菌的理論。

對比苧麻原麻生物脫膠過程各膠質成分去除率可知，在脫膠16 h后，果膠去除率高達93.9%，結合果膠種類多樣性，說明菌株LY11分泌的果膠酶系足夠豐富；然而，半纖維素的脫除率在脫膠結束后僅為39.6%，仍殘留60.4%的半纖維素，表明菌體所含半纖維素酶系有待進一步豐富，同時，苧麻原麻所含木聚糖、甘露聚糖側鏈會被乙酰基、半乳糖、葡萄糖醛酸所取代［17］，因而LY11中木聚糖酶、甘露聚糖酶系可能對其原位降解效果較差。脫膠后脂蠟質的去除率為45.3%，其主要化學成分為高級脂肪酸和高級醇形成的酯類，芽孢桿菌LY11基因組不存在降解脂蠟質的基因，可能是由于該菌株降解了苧麻中的其他膠質成分后，脂蠟質從苧麻中脫落，從而使其脫除。在本次實驗中甘露聚糖酶始終保持較高酶活，而木聚糖酶活較低，最高酶活＜5 U/mL。本課題組前期對高效脫膠菌株HG-49進行了全基因組測序，發現其缺少半纖維素酶系［18］，后構建了木聚糖酶組成型分泌表達載體p213，并轉入脫膠菌HG-49，使其木聚糖酶活性得到顯著提高，后進行脫膠實驗，使苧麻脫膠率提高了3.9%［19］，證實木聚糖酶在苧麻半纖維素降解中起到相當重要的作用。當前有研究指出在苧麻半纖維素中甘露聚糖含量高于木聚糖含量［20］，因而推測菌株LY11脫膠過程中半纖維素膠質的降解可能主要是由于甘露聚糖酶的作用，使其40%左右的半纖維素被降解。先前研究認為果膠酶和木聚糖酶在降解苧麻膠質時具有關鍵作用，而忽略了甘露聚糖酶。本課題組王亞偉［21］從數據庫中挖掘到甘露聚糖酶ManB，后將異源表達的不同濃度的 ManB蛋白酶與HG-49菌株聯合使用對苧麻韌皮進行原位脫膠處理，發現添加400 IU/mL ManB時苧麻韌皮脫膠率從82.2%提高到85.6%。該研究也表明甘露聚糖酶在降解半纖維素過程中同樣發揮非常重要的作用，進一步豐富了對苧麻關鍵脫膠酶體系的認識。

芽孢桿菌LY11雖對果膠具有優異的去除能力，但去除半纖維素的能力有待進一步加強，相關半纖維素酶系有待豐富。有研究表明，部分木聚糖酶對純底物，例如玉米芯木聚糖進行降解時，雖表現出較高活性，但其在植物組織背景下進行原位降解木聚糖時，效率卻大大降低。因此，在選擇半纖維素酶系相關種類酶時，需注意選擇具有高效原位降解能力的酶。可利用當前已知具有高效原位脫膠能力的半纖維素酶的菌株，與芽孢桿菌LY11進行復合脫膠，也可從此類菌種克隆相關基因，構建重組工程菌。另一方面，研究在植物組織背景下原位處理時半纖維素酶活性降低的機制，將為提高苧麻微生物脫膠效率提供更加豐富的理論指導。同時，本菌株分泌的甘露聚糖酶和果膠酶進行原位脫膠時，能夠有效的降解果膠和甘露聚糖等膠質成分，表明本菌株中相關的果膠酶、甘露聚糖酶基因可作為苧麻脫膠關鍵基因來源，用于構建重組工程菌，為苧麻膠質的降解提供強力支持。

4 結論

本文通過分析菌株LY11生物脫膠過程中菌體數量變化、酶活變化、單糖含量變化、膠質去除率等數據，發現微生物脫膠遵循“菌產酶、酶脫膠、膠養菌”理論，兼具高活性的果膠酶和半纖維素酶是實現微生物徹底脫膠的核心要素，維持其酶促動力學穩定性是提高脫膠效率的關鍵因素。