阿利吉侖通過抑制炎癥和凋亡反應改善小鼠心肌缺血再灌注損傷

吳冰璇， 黃淑芬， 吳文超， 黃小鳳， 詹 紅

(中山大學附屬第一醫院急診科，廣東省廣州市 510080)

急性心肌梗死是世界范圍內導致心源性猝死和殘疾的主要原因之一，溶栓治療或經皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)是臨床廣泛使用且最有效的治療措施，能盡快恢復缺血區域血流，減少急性心肌缺血性損傷、縮小心肌梗死范圍。在心肌缺血再灌注過程中可能因多種原因導致心肌再灌注損傷而進一步加劇缺血心肌細胞的死亡，誘發其他致死性損傷[1]。

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)在調節心血管功能方面起著至關重要的作用，由腎臟分泌的腎素能夠催化血管緊張素原轉化為血管緊張素Ⅰ，是RAAS系統的主要限速步驟[2-3]。阿利吉侖，作為一種新型的非肽類口服腎素抑制劑，能夠直接抑制血漿腎素活性及其對血管緊張素原的酶促作用，從源頭上阻斷RAAS系統。阿利吉侖能夠抑制炎癥，防止動脈粥樣硬化病變的形成，并且能夠改善心肌梗死后的心室重構[4]，且能通過抑制氧化應激級聯反應改善高血壓大鼠的心肌缺血再灌注損傷[5]。本課題組前期研究發現，阿利吉侖可通過抑制線粒體介導的凋亡通路而改善損傷[6]。本文探討小鼠心肌缺血再灌注損傷模型中，阿利吉侖是否通過調控相關凋亡因子及抑制缺血再灌注后的炎癥反應，減輕小鼠心肌缺血再灌注損傷，促進其心功能恢復。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

阿利吉侖購買于APExBio公司；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、ELISA試劑盒購自依科賽生物科技有限公司；PCR引物購自廣州剪刀手公司；cDNA反轉錄試劑盒和qPCR試劑盒購于EZBioscience公司；BCA蛋白定量試劑盒購自賽默飛世爾科技有限公司；B淋巴細胞2蛋白(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)一抗購于Cell Signaling Technology公司。主要儀器包括：高通量組織研磨儀(TissueLyser II，QIAGEN GmbH，德國)、酶標儀(Sunrise，TECAN，奧地利)、小動物呼吸機(HX-101E，成都泰盟公司)。

1.2 實驗動物及分組

24只8～10周齡雄性SPF級C57BL/6J小鼠，體質量23～28 g，購于江蘇集萃藥康生物有限公司，許可證編號為SCXK(蘇)2018-0008。將小鼠隨機分為假手術組、模型組、低劑量組、高劑量組，每組6只。假手術組和模型組予等量0.9%生理鹽水灌胃處理，低劑量組和高劑量組分別給予小鼠阿利吉侖25、50 μg/g灌胃處理，每日1次，連續給藥7天。

1.3 心肌缺血再灌注損傷模型的建立

連續給藥7天后，予模型組、低劑量組和高劑量組小鼠手術造模。經小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液(50 μg/g)，氣管切開插管后連接呼吸機，設置參數：頻率120次/min，呼吸比5∶4；潮氣量1 mL。胸骨左旁斜行切口，于第4肋間暴露小鼠心臟；定位左心耳下方約2 mm處用7-0絲線結扎左前降支，缺血30 min后松開結扎線，恢復再灌注后以6-0絲線關閉胸腔。小鼠恢復自主呼吸后拔管，6-0絲線縫合氣管，4-0絲線縫合皮膚，置于電熱毯保溫待蘇醒。假手術組僅做開胸處理，不予結扎左前降支。24 h后采集左心室心肌組織樣本做后續檢測。

1.4 小鼠超聲心動圖

小鼠心肌缺血30 min，再灌注24 h后通過超聲心動圖系統(Visual Sonics Vevo 2100,VisualSonics,加拿大)評估心功能。小鼠吸入異氟醚麻醉(0.5%～1.0%)，使用MX400D探頭通過二維M模式在左心室長軸切面下追蹤其平均連續5個心動周期，通過Vevo成像測量舒張期末左心室內徑和收縮期末左心室內徑，計算得到收縮期末左心室前壁厚度(left ventricular anterior wall end-systolic dimension，LVAWs)、收縮期末左心室后壁厚度(left ventricular posterior wall end-systolic dimension，LVPWs)、舒張期末左心室前壁厚度(LVAW-diastolic dimension，LVAWd)、舒張期末左心室后壁厚度(LVPW-diastolic dimension，LVPWd)、每搏輸出量、左心室射血分數、左心室短軸縮短率。

1.5 ELISA檢測IL-6及TNF-α

使用高通量組織研磨儀制備10%左心室心肌組織勻漿，將樣品和標準品加入孔中(100 μL/孔)并封板，室溫下孵育90 min后洗板；加入生物素化抗體孵育60 min，洗板后加入酶結合物避光孵育30 min；再次洗板并加入顯色底物，避光孵育15 min終止反應，使用酶標儀檢測OD450值，計算得出樣品的炎癥因子濃度。

1.6 qRT-PCR檢測

使用TRIZOL法提取左心室部位心肌組織總RNA：加入1 mL TRIZOL研磨至不見組織碎塊。加入200 μL氯仿，震蕩15 s后離心，4 ℃，10 000 g，15 min。將最上層水相轉移至干凈的EP管中，加入500 μL異丙醇，離心后的RNA沉淀經75%乙醇洗滌并干燥后，加入無RNA酶水重懸。按照cDNA反轉錄試劑盒說明書，42 ℃反應15 min，95 ℃反應15 s。使用實時熒光定量PCR系統(CFX96 Touch，BioRad，美國)擴增目的基因cDNA，擴增引物序列為：Bax上游引物5′-TGCGTCCACCAAGAAGC-3′，Bax下游引物5′-CCACCCGGAAGA AGACC-3′；Bcl-2上游引物5′-ACAAGTGCCTGCTTTATGG-3′，Bcl-2下游引物5′-CTGCTCTGTTCCAAACCC-3′；GAPDH上游引物5′-GGATGCTGCCCTTACCC-3′，GAPDH下游引物5′-GTTCACACCGACCTTCACC-3′。擴增程序設置為解鏈95 ℃反應10 s，退火60 ℃反應30 s，循環40次；以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt方法計算基因的相對定量表達量。

1.7 Western blot檢測蛋白表達

使用RIPA裂解液提取心肌組織中的總蛋白后使用BCA法進行定量，蛋白質上樣于10%預制的SDS-PAGE凝膠中進行電泳及轉膜。5%BSA溶液室溫封閉1 h，4 ℃孵育一抗10～14 h，洗膜后室溫下孵育二抗1 h，使用化學發光儀(ChemiDoc XRS+，BioRad，美國)曝光得到蛋白條帶，使用Image J系統分析條帶灰度。

1.8 統計學方法

2 結 果

2.1 成功建立小鼠心肌缺血再灌注損傷模型

模型建立過程中，結扎左前降支后肉眼可見左心室及心尖部心肌變白、心動變緩，體溫下降，四肢及尾部循環末梢呈蒼白略透明狀；恢復再灌注后可見心肌及循環末梢血供重新充盈，心率增快且體溫回升。小鼠術后自主呼吸恢復良好，活動受限但生命體征平穩，小鼠心肌缺血再灌注損傷模型成功建立。

2.2 各組超聲心動圖參數比較

與假手術組比較，其他組小鼠的每搏輸出量、心輸出量、LVAWs、LVPWs、LVPWd均顯著降低(P<0.05)；與假手術組比較，模型組的左心室射血分數和左心室短軸縮短率顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，低、高劑量組小鼠左心室射血分數和左心室短軸縮短率明顯升高(P<0.05)，且隨著劑量的增加而呈濃度依賴性升高(P<0.05；表1)。

表1 各組小鼠心肌缺血再灌注24 h后超聲心動圖參數比較(n=6)

2.3 阿利吉侖降低小鼠心肌缺血再灌注后炎癥因子水平

ELISA檢測結果顯示，與假手術組比較，其他3組小鼠心肌組織的TNF-α和IL-6水平顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，低劑量組、高劑量組TNF-α和IL-6水平明顯降低(P<0.05)。與低劑量組比較，高劑量組TNF-α明顯降低(P<0.05；表2)。

表2 阿利吉侖對小鼠心肌缺血再灌注后炎癥因子的影響(n=3) 單位：ng/g

2.4 阿利吉侖抑制小鼠心肌缺血再灌注后凋亡水平

與假手術組比較，模型組的抑凋亡基因Bcl-2的表達量顯著降低(P<0.05)，而促凋亡基因Bax的表達量明顯增加(P<0.05)。使用阿利吉侖處理后，Bcl-2的表達量有所上升(P<0.05)，Bax則明顯下降(P<0.05；圖1)。蛋白免疫印跡實驗與實時熒光定量PCR的結果一致(圖2)。

圖1 阿利吉侖對小鼠心肌缺血再灌注后心肌組織Bcl-2、Bax mRNA表達的影響(n=6)

圖2 阿利吉侖對小鼠心肌缺血再灌注后心肌組織Bcl-2、Bax蛋白表達的影響(n=6)

3 討 論

近年來研究表明，預防性使用具有心臟保護功能的藥物能夠極大程度地避免心肌缺血再灌注損傷，盡可能地縮小梗死面積、保留心肌活性及維持心臟功能[7-8]。阿利吉侖作為新一代腎素直接抑制劑，具有生物利用度高、腎素專一性高、半衰期長的優點。它與心臟、神經和腎臟保護作用有關，且其抗炎和抗動脈粥樣硬化作用獨立于其降血壓活性[9]。Chen等[10]研究證明，阿利吉侖能降低心肌梗死標記物水平、縮小梗死面積、顯著改善心臟功能。這與本研究阿利吉侖能提高心肌缺血再灌注后左心室射血分數和左心室短軸縮短率的結果相一致，驗證了阿利吉侖對缺血性心肌的保護功能。

本研究經過文獻調研[10-12]之后設定了25 μg/g和50 μg/g兩個給藥劑量，結果顯示高劑量組較低劑量組能進一步改善心臟收縮功能，降低炎性因子TNF-α分泌水平。而在一項為期4周的臨床隨機雙盲研究中[13]，對236名輕度至中度高血壓患者進行了不同劑量(37.5、75、150、300 mg/天)的阿利吉侖與氯沙坦(100 mg/天)的比較。結果顯示，阿利吉侖導致了明顯的劑量依賴性血漿腎素活性降低以及日間動態收縮壓下降，而100 mg氯沙坦對日間收縮壓的影響與75、150和300 mg阿利吉侖無顯著差異。結果提示阿利吉侖存在一個最佳的劑量范圍，過高的劑量并不一定會帶來更佳的藥物效果，在不同病理生理過程中的藥理機制與更精確的劑量范圍還需進一步的基礎研究與臨床試驗來確定。

心肌缺血再灌注損傷的病理生理機制錯綜復雜，主要包括氧化應激、細胞內鈣離子超載、線粒體能量代謝障礙和細胞凋亡等相互作用的分子機制網絡[14]。缺血再灌注過程中細胞內氫離子和鈣離子的積累以及線粒體膜電位的破壞會導致自由基或活性氧類的形成。活性氧的積累除了激活氧化應激反應外，還直接損傷細胞的DNA、蛋白質和脂質。這種非特異性損傷引發了細胞因子介導的級聯反應，導致各類炎性因子的產生[15]。IL-6減少一氧化氮的生成，加重血管內皮的損害[16]，且高水平的可溶性IL-6受體可以預測STEMI患者未來的心血管事件和死亡率[17]。過度的TNF-α表達則會引起心肌收縮功能障礙、心肌細胞肥大、纖維化和死亡。本研究結果提示阿利吉侖可能是通過抑制炎性反應相關通路減少促炎細胞因子和趨化因子的分泌以維持心肌細胞的活性。

細胞凋亡是細胞程序化死亡的主要模式，在組織內穩態的發展和維持中發揮著重要作用[18]。細胞凋亡可受TNF-α、IL-6等細胞因子的調控，Bcl-2家族促凋亡蛋白(Bax)和抗凋亡蛋白(Bcl-2)之間的平衡決定了細胞在受到一定刺激或損傷后存活或發生凋亡的可能性。本研究結果顯示，阿利吉侖能夠明顯上調小鼠心肌缺血再灌注后Bcl-2的水平，相應地下調Bax的表達，為阿利吉侖對心臟保護的作用機制提供了凋亡相關的研究靶點及更進一步的理論支持。

本研究尚存在一定的缺陷和不足。如實驗中未能設置藥物梯度質量濃度來探究最佳質量濃度，且只檢測了心肌缺血再灌注24 h后急性期的左心室心肌組織樣本，更長遠預后的影響有待進一步研究。

實驗結果證實了阿利吉侖在心肌缺血再灌注損傷中的保護作用，從減輕炎癥反應、抑制凋亡通路兩個方向進一步深入探討分子機制建立了良好的基礎，也為提高心肌活性，改善心臟功能，進而減少缺血性心臟疾病患者不良事件的發生提供了可能的研究靶點。