黃連素對IL-1β誘導炎性退變軟骨細胞增殖的影響及其分子機制

黃文，馬石庭，姚軍

1 賀州市人民醫院骨關節與運動醫學科，廣西賀州542800；2 廣西醫科大學第一附屬醫院骨關節外科

骨關節炎（OA）是一種好發于膝關節，以關節疼痛和功能障礙為主要特點的退行性關節炎，可致關節嚴重畸形［1］。研究顯示，全球OA 患者已經超過3.6 億，其中80% 的患者存在運動局限性，25% 存在肢體殘疾［2］。OA 的主要病理基礎是軟骨細胞損傷、凋亡，導致細胞外基質合成分泌減少［3-4］。目前研究認為，炎癥因子蓄積在OA 的發生、發展中具有重要作用，是導致軟骨細胞病變的主要原因［5］。黃連素是從毛茛科植物黃連根莖中提取出的一種生物堿，臨床顯示具有清熱解毒的作用［6］。近些年研究顯示，黃連素具有較強的抗炎作用［7-8］。但黃連素對OA 是否有治療作用，目前尚缺乏相關研究。2019年12 月—2020 年12 月，本研究觀察了黃連素對白細胞介素1β（IL-1β）誘導軟骨細胞炎性退變的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：1 周齡C57 小鼠8 只，雌雄不限，由廣西醫科大學實驗動物中心提供。主要試劑：細胞染色相關試劑（DMSO、MTT、FDA 染料）均購自美國Sigma 公司，細胞培養相關試劑（黃連素、DMEM 高糖培養基、0.25% 胰蛋白酶、胎牛血清、膠原酶Ⅱ、青—鏈霉素混合液、PBS 溶液）均購自北京Solarbio 公司，RT-PCR 相關試劑（細胞RNA快速提取試劑盒、反轉錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒）均購自美國Thermo Scientific 公司，Western blotting 相關試劑（細胞總蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒、一抗、二抗）均購自北京中杉金橋科技有限公司。主要儀器：超凈細胞操作臺購自蘇州蘇潔凈化設備公司，CO2培養箱、MultiSkan 酶標儀、ABI 7500 型定量PCR 儀均購自美國Applied Biosystems 公司，熒光倒置顯微鏡購自日本Olympus 公司。

1.2 小鼠膝關節軟骨原代細胞提取、培養及鑒定

1.2.1 軟骨原代細胞提取、培養 將8 只C57 小鼠處死后置入75%乙醇內浸洗5 min，在超凈操作臺內解剖取出小鼠膝關節處軟骨組織，剪成1 mm×1 mm×1 mm 大小的組織塊。 將組織塊放入含0.25% 胰蛋白酶的無菌離心管中，37 ℃條件下消化1 h；800 r/min 離心2 min 后去上清液，加入2 mg/μLⅡ型膠原酶，繼續消化2 h。反復吹打后收集消化液，800 r/min 離心2 min 后去上清液，用PBS 溶液重懸細胞。將細胞接種于含DMEM 培養基（內含10%FBS、1% 青—鏈霉素）的培養皿，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，24 h后更換培養基，之后每3 d換液1次。細胞融合至80% 時以1∶2 比例傳代，取第3 代細胞進行以下實驗。

1.2.2 軟骨細胞鑒定 將生長狀況良好的第3 代軟骨細胞接種于細胞爬片培養，2 d 后取出爬片，普通光學顯微鏡下觀察細胞基本形態，結果顯示細胞形態多樣，呈類圓形、多角形、星形等。將爬片置入4% 多聚甲醛中，4 ℃條件下固定30 min，取出爬片，反復用PBS 清洗，每次3～5 min；清洗完畢后將爬片置入甲苯胺藍染色液中，充分覆蓋樣品，室溫避光孵育30 min；顯色至預期深淺后去除染色液，用蒸餾水洗滌1～2 次，光學顯微鏡下觀察，結果可見細胞質呈藍色，細胞質豐富、細胞核清晰，多核。見OSID 碼圖1。

1.3 黃連素作用濃度篩選 采用MTT 法。選取生長狀況良好的第3 代軟骨細胞配成單細胞懸液，以5×103/孔接種于96 孔板培養，培養1 d 后，更換含不同濃度黃連素（0～102.4 g/L）+IL-1β（10 ng/mL）的培養基進行培養。 培養1 d 后，將終濃度為5 mg/mL 的MTT 加入96 孔板內，37 ℃孵育箱中孵育4 h 后終止培養。小心吸除孔內培養基，向孔中加入150 μL 二甲基亞砜，震蕩10 min 后使用酶聯免疫檢測儀測定各孔在490 nm 處的吸光度值，以吸光度值表示軟骨細胞活性。結果顯示，＞0～0.8 g/L 的黃連素對炎性退變的軟骨細胞具有低細胞毒性，6.25×10－3～0.05 g/L 的黃連素可濃度依賴性提高炎性退變的軟骨細胞活性（P均＜0.05），1.6～102.4 g/L 的黃連素對炎性退變的軟骨細胞活性有抑制作用（P均＜0.05）。選擇濃度為6.25×10－3g/L、0.05 g/L 黃連素分別作為低、高劑量進行下一步研究。見圖1。

圖1 炎性退變的軟骨細胞經不同濃度黃連素作用后的細胞活性（MTT法）

1.4 細胞分組處理 將軟骨細胞隨機分為空白組（不采取任何干預）、模型組（僅加入10 ng/mL IL-1β干預）、黃連素低劑量組（10 ng/mL IL-1β +6.25×10-3g/L黃連素干預）、黃連素高劑量組（10 ng/mL IL-1β+0.05 g/L黃連素干預），分組處理后繼續培養2 d。

1.5 細胞增殖活性檢測 采用FDA 熒光染色。各組培養2 d后取出細胞爬片，用PBS將爬片輕柔清洗干凈，置入FDA（100 mg/L）染色液中，暗盒內染色5 min，在倒置熒光顯微鏡下攝片分析活細胞數。綠色斑點為活細胞，相同接種底數，綠色斑點越多表示活細胞數越多，即增殖活性越強。

1.6 軟骨細胞分泌功能檢測 采用番紅O 染色。各組培養2 d后取出細胞爬片，用PBS將爬片輕柔清洗干凈，置入40 g/L多聚甲醛中固定30 min，固定結束再次清洗爬片，去除甲醛。按照番紅O 染色操作手冊，將軟骨細胞染色至預期深淺后，在倒置光學顯微鏡下攝片分析番紅O 染色面積。番紅O 可將軟骨細胞分泌的外基質染為紅色，顏色越深、染色面積越大表示軟骨細胞分泌功能越強。

1.7 軟骨細胞特異性相關基因［蛋白聚糖（Acan）、Ⅱ型膠原1（Col2a1）］及炎癥相關基因［基質金屬蛋白酶13（MMP-13）、環氧合酶2（COX-2）］表達檢測 采用Real-time PCR 法。各組培養2 d后，按照細胞RNA 快速提取試劑盒完成總RNA 提取，反轉錄合成cDNA。Acan 引物序列：上游引物5'-GGCAACAACTCACCCAGCACTG-3'、下 游 引 物5'-AGGAGGCACGGGACGTAGTTC-3'，Col2a1 引 物序列：上游引物5'-CCAAGTGGCCAGGTTCAACG-3'、下 游 引 物5'-GGGATGAGGAATGCGCCCTA-3'，MMP-13 引物序列：上游引物5'-CCGGGAGAACAATCCGTGCC-3'、下游引物5'-AAAGCACTCGCCATCCCCAA-3'，COX-2 引 物 序 列：上 游 引 物5'-CAGGTGCAAAGCCCAGCGAC-3'、下 游 引 物5'-TGGGGCTCCAAGTCCATTGTT-3'，內參β-actin 引物序列：上游引物5'-CATGAGCCGAAGCTAACCC-3'、下游引物5'-CTCCTATGACTTCTGCGTCTGG-3'。PCR 反應條件：50 ℃預變性2 min，95 ℃預變性10 min、95 ℃變性15 s、60 ℃退火1 min，40 個循環。采用2－ΔΔCt法計算軟骨細胞目的基因相對表達量。

1.8 轉化生長因子β（TGF-β）/Smad2/3 信號通路相關蛋白表達檢測 采用Western blotting 法。各組培養2 d 后，按照細胞總蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒進行定量。參照試劑盒說明書進行電泳、轉膜、封閉，加入TGF-β1、Smad2、Smad3、β-actin 一抗（稀釋比例均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜；加入二抗（稀釋比例均為1∶5 000），室溫孵育1 h。曝光、顯影后采用Image Lab 圖像處理軟件對目的條帶進行分析，以β-actin 為內參，計算各組TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白相對表達量。

1.9 統計學方法 采用Graphpad 6.0 統計軟件。計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組軟骨細胞增殖活性比較 模型組、空白組、黃連素低劑量組、黃連素高劑量組活細胞數分別為（212.50 ± 17.68）、（375.00 ± 35.35）、（530.00 ±42.43）、（650.00 ± 70.71）個，組間兩兩比較P均＜0.05。見OSID碼圖2。

2.2 各組軟骨細胞分泌功能比較 模型組、空白組、黃連素低劑量組、黃連素高劑量組染色面積分別為24.50% ± 4.95%、44.50% ± 6.36%、65.00% ±7.07%、77.5% ± 3.53%，組間兩兩比較P均＜0.05。見OSID碼圖3。

2.3 各組軟骨細胞Acan、Col2a1、MMP-13 及COX-2 mRNA 表達比較 模型組、空白組、黃連素低劑量組、黃連素高劑量組軟骨細胞Acan、Col2a1 mRNA表達依次升高，MMP-13、COX-2 mRNA 表達依次降低，組間兩兩比較P均＜0.05。見表1。

表1 各組軟骨細胞Acan、Col2a1、MMP-13及COX-2 mRNA表達比較（± s）

表1 各組軟骨細胞Acan、Col2a1、MMP-13及COX-2 mRNA表達比較（± s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與黃連素低劑量組比較，△P＜0.05。

組別空白組模型組黃連素低劑量組黃連素高劑量組Acan 1.00 ± 0.14 0.58 ± 0.08*1.28 ± 0.11*#1.57 ± 0.10*#△Col2a1 1.00 ± 0.07 0.49 ± 0.13*1.36 ± 0.08*#1.61 ± 0.08*#△MMP-13 1.00 ± 0.11 1.75 ± 0.07*1.08 ± 0.04*#0.67 ± 0.09*#△COX-2 1.00 ± 0.15 1.80 ± 0.11*0.88 ± 0.09*#0.57 ± 0.06*#△

2.4 各組軟骨細胞TGF-β/Smad2/3 信號通路蛋白表達比較 模型組、空白組、黃連素低劑量組、黃連素高劑量組軟骨細胞TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白相對表達量均依次升高，組間兩兩比較P均＜0.05。見表2、OSID碼圖4。

表2 各組軟骨細胞TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達比較（± s）

表2 各組軟骨細胞TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達比較（± s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與黃連素低劑量組比較，△P＜0.05。

組別空白組模型組黃連素低劑量組黃連素高劑量組TGF-β1 0.55 ± 0.07 0.25 ± 0.04*0.78 ± 0.05*#1.04 ± 0.12*#△Smad2 0.43 ± 0.11 0.20 ± 0.07*0.65 ± 0.08*#0.77 ± 0.04*#△Smad3 0.38 ± 0.09 0.17 ± 0.57*0.48 ± 0.85*#0.62 ± 0.09*#△

3 討論

在OA 的發展過程中有各種細胞因子的產生，并參與干擾軟骨細胞分解代謝和合成代謝過程。關節內部不僅有炎癥因子（IL-1β、TNF-α、IL-6、MMP-13、IL-17、COX-2）誘導的分解代謝過程，同時還存在抗炎因子（IL-4、IL-10、IL-13）誘導的合成代謝過程［9］。盡管炎癥和抗炎因子在OA 發病過程中的細胞間和細胞內信號通路尚不明確，但既往研究已證實早期OA已經具有不同程度的炎癥反應［10］。

研究表明，具有抗炎作用的中藥提取物可以減輕細胞炎癥，改善軟骨細胞功能，促進軟骨合成及修復。臺灣學者發現龜鹿二仙膠具有強效抗炎作用，可以明顯改善小鼠OA 病情［11］；李淑潔等［12］研究發現，牛膝提取物可能通過PI3K/AKT 信號通路抑制軟骨細胞凋亡，從而減輕碘乙酸鈉對軟骨細胞的損傷。此外，淫羊藿素、枸杞多糖、牛膝總皂苷也有相似作用［13-15］。 本研究結果顯示，黃連素在6.25×10-3～0.05 g/L 時可呈濃度依賴性提高炎性退變軟骨細胞的活性，并促進細胞增殖；此外，黃連素可逆轉IL-1β 引起的軟骨細胞炎癥因子MMP-13、COX-2 mRNA 高表達，促進軟骨合成因子Acan、Col2a1 表達，番紅O 染色進一步表明黃連素可促進發生炎性退變的軟骨細胞合成細胞外基質；這表明黃連素對軟骨細胞及軟骨修復均具有積極作用。

TGF-β1是TGF-β 超家族成員，Smad1、Smad2 是Smad 蛋白家族的重要成員，TGF-β/Smad2/3 信號通路參與調控許多細胞（如軟骨細胞、成纖維細胞、上皮細胞等）的增殖、分化［16-17］。Smad 蛋白可以將TGF-β 信號由細胞外傳導至細胞核，從而調節靶基因轉錄水平，干預細胞功能狀態。既往已有許多研究表明，TGF-β/Smad2/3 激活可促進軟骨細胞增殖、合成Ⅱ型膠原蛋白和聚集相關的蛋白多糖，在軟骨合成及修復中具有重要作用；其機制主要是TGFβ/Smad2/3 信號通路激活可上調轉錄因子Sox9，從而增加Ⅱ型膠原分泌，減少蛋白多糖消耗，最終促進軟骨細胞外基質合成，起到修復軟骨的作用［18-20］。本研究結果顯示，炎性退變的軟骨細胞TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白表達量均有不同程度的下調，這可能是因為細胞在炎性因子干擾下的自我修復功能受損所致；而黃連素可以促進發生炎性退變的軟骨細胞合成TGF-β1、Smad2、Smad3 蛋白，從而正向調控軟骨細胞的增殖。

綜上所述，黃連素可促進IL-1β誘導炎性退變軟骨細胞的增殖及活性，其機制可能與抑制炎癥反應及激活TGF-β/Smad2/3信號通路有關。黃連素可促進軟骨修復，減輕OA病變，是治療OA的潛在藥物。