TNF-α刺激下人牙周膜干細胞對CD3+T細胞功能的影響*

劉娜 李影 王燕一 張維 劉洪臣

近些年間充質干細胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）免疫調節能力受到廣泛關注，其可以與體內微環境互相影響，分泌多種細胞因子從而發揮調控作用［1，2］。PDLSCs作為MSCs的一種同源性的干細胞，其免疫調節能力與間充質干細胞相似，關于PDLSCs的免疫調節功能越來越受到關注［3］。近期相關研究結果表明炎癥微環境下PDLSCs的免疫調節能力也會降低［4］。Wada等的研究發現人牙周膜干細胞能通過分泌可溶性因子介導免疫調節功能［5］。

T細胞能夠產生細胞免疫應答，是適應性免疫系統的主要細胞。免疫細胞在體外活化以后可以分泌IFNγ、TNFα等可溶性因子，能夠啟動MSCs的免疫抑制程序，從而導致IDO、iNOS等蛋白的大量分泌，它們的酶活性產物抑制了免疫細胞的功能及增殖［6-8］。此外，有研究表明在牙周組織的破壞及牙槽骨吸收中T細胞扮演重要的角色。Tian M等發現在慢性牙周炎患者外周血T淋巴細胞中PD-1和PDL-1呈高表達，其能夠通過負性免疫調節效應來增強炎癥反應，從而促進牙槽骨的吸收和破壞［9］。

然而，T細胞參與牙周炎發生發展及其與PDLSCs之間相互作用的機制尚不明確。本實驗將通過外源性人重組腫瘤壞死因子構建體外炎癥微環境，刺激PDLSCs，并與CD3+T細胞共培養，檢測PDLSCs對CD3+T細胞生物學功能的影響。

1.材料方法

1.1 樣本來源 從解放軍總醫院第一醫學中心口腔頜面外科門診收集健康第三磨牙。所有患者身體健康，無近期急性感染及服藥史。患者年齡在20-35歲之間，樣本量共8例。另外，從解放軍總醫院第一醫學中心輸血科獲取人外周血白膜層細胞濃縮血樣，所有捐獻者身體健康，無半年內用藥史及系統性疾病。樣本量共8例。本研究經中國人民解放軍總醫院倫理委員會批準（批準號：IACUC-2016067)，所有患者均簽署了知情同意書。

1.2 人牙周膜干細胞分離培養 將本課題組獲取的新鮮離體牙樣本，使用無菌鑷子將牙齒倒置，用提前配置的PBS（含1%青鏈霉素，北京Solarbio）小心沖洗5-7次，刮取根中1/3部分牙周膜，用眼科剪將組織小心剪碎，然后置于盛有5mL預制PBS的15mL離心管中，在室溫下使用水平離心機800r/min離心5min。使用胰酶消化法（1mL EDTA-胰蛋白酶消化液（北京Solarbio）消化2-4min后終止消化）處理組織碎塊，同樣的轉速離心5min后加入5mL含血清α-MEM培養液（含1%青鏈霉素、10%FBS，美國Gibco）重懸，置于直徑10cm的無菌培養皿中，放入孵箱連續培養7d左右，倒置顯微鏡下可見形似成纖維細胞的紡錘形細胞爬出。待細胞長至80%匯合時傳代。采用有限稀釋法進行克隆培養分離培養人牙周膜干細胞，具體方法步驟參考本課題組前期工作［10］。

本課題組從人健康離體牙樣本中分離培養出健康牙周膜干細胞標記為：H-PDLSCs（Healthy-Periodontal ligament stem cells）；本課題組將H-PDLSCs采用10ng/mL的TNFα（美國，Peprotech）提前刺激24h作為炎癥誘導條件下的牙周膜干細胞，標記為：I-PDLSCs（Inflammatory-Periodontal ligament stem cells）。

1.3 CD3+T細胞的體外分離培養 將全血白膜層10mL加等量預冷PBS稀釋，緩慢加入20mL人外周血淋巴細胞分離液（天津灝洋生物技術有限公司），離心（2000rpm，15min）。白膜層吸取物用PBS(加入5mL的RPMI1640培養液，美國Gibco）洗2次，沉淀物富含單個核細胞，進行細胞計數。調整細胞密度1×107/100μL按照說明書（德國MiltenyiBiotec GmbH）流程進行CD3+T細胞提取：按照107細胞添加10μL CD3e-biotin試劑并混勻；置于4℃避光孵育10min，加入預制冷卻的PBS清洗后離心棄上清；加入1mL預制冷卻的PBS重懸，每107細胞添加20μL anti-biotin磁珠混勻，重復上述孵育及清洗離心步驟，棄上清；重懸后使用適量預制緩沖液潤濕細胞分選柱，然后用1mL預制緩沖液加力沖洗2次；將分選柱撤離磁力架后預制緩沖液沖洗2次，可獲得CD3+T細胞。隨后進行CD3+T細胞的培養及活化：T細胞計數后分選適量的細胞置于離心管中，一部分按照實驗所需濃度加入配制的RPMI 1640刺激液4mL，調整細胞密度為8×105/100uL，另一部分加入配制的RPMI 1640培養液，分別混合均勻后置于兩個直徑6cm的培養皿中，標記，放入37℃，5%CO2孵箱內進行培養，用于下步實驗。

1.4 PDLSCs與CD3+T細胞共培養 將第三代PDLSCs消化后重懸后進行細胞計數：8×104/100μL，采用48孔板（美國，Corning），每孔液體量400μL，每孔CD3+T細胞的數量均為8×105個，PDLSCs與CD3+T細 胞 的 比 例 為1∶1、1∶10、1∶20、1∶50、1∶100［11，12］。共培養時間為48h。10ng/mL的TNFα（美國，Peprotech）提前刺激H-PDLSCs 24h作為I-PDLSCs，在刺激24h后PBS清洗3遍隨后按比例加入相應的CD3+T細胞。

1.5 實時定量PCR檢測CD3+T細胞凋亡及炎癥相關基因表達 共培養48h后，Trizol裂解細胞提取RNA，反轉錄試劑盒（Takara，日本）逆轉錄為cDNA，Sybr Green試劑盒進行qRT-PCR檢測（全式金，中國），在反應管中擴增目的基因及管家基因（華大基因，中國），反應體系為20μL。引物序列：TNFα，上游引物：5′-CACCACTTCGAAACCTGGGA-3′，下游引物：TGTAGGCCCCAGTGAGTTCT-3′；Caspase-3，上游引物：5′-CCTGGTTCATCCAGTCGCTT-3′，下游引物：5′-TCTGTTGCCACCTTTCGGTT-3′；Caspase-8，上 游 引 物：5′-CTGGTCTGAAGGCTGGTTGT-3′，下 游 引 物：5′-CAGGCTCAGGAACTTGAGGG-3′；IL-6，上游引物：5′-GCACAGCTCTGGCTTGTTCC-3′，下游引物：5′-TGAGGAGACTTGCCTGGTGA-3′GAPDH，上游引物：5′-TCTGACGACTCTGCTTCACG-3′，下游引物：5′-TTCAGGGCATGTGTGATGCT-3′；CCND-1，上游引物：5′-GATGCCAACCTCCTCAACGA-3′，下游引物：5′-ACTTCTGTTCCTCGCAGACC-3′；。反應條件：95℃變性20min，95℃30s，60℃1min，40個循環。采用實時熒光定量PCR儀（Applied Biosystems 7500，美國Life Technologies公司）監測記錄數據，重復3次。

1.6 統計學處理 采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，數據以均數±標準差表示。獨立樣本t檢驗進行兩組間比較；多組間比較時，P值進行Bonferroni校正。P＜0.05、P＜0.01為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 CD3+T細胞分離培養 顯微鏡下T細胞被PHA活化后，CD3+T細胞呈圓形懸浮生長，細胞增殖活躍，活性良好（圖1）。

圖1 CD3+T細胞鏡下觀（×200；×400）

2.2 共培養對CD3+T細胞Caspase3、Caspase8基因表達的影響 將H-PDLSCs及I-PDLSCs分別與CD3+T細胞以1∶10、1∶20、1∶50及1∶100比例共培養48h后，進行RNA的提取及逆轉錄。按照protocol進行實時定量PCR檢測，本課題組的檢測結果表明：在1∶10-1∶100范圍內，隨H/I-PDLSCs與CD3+T細胞比例的降低，H-PDLSCs組Caspase3及Caspase8 mRNA的表達水平較對照組顯著降低，且呈逐級下降趨勢（圖2A、B）。而在1∶10-1∶100范圍內，隨PDLSCs與CD3+T細胞比例的降低，I-PDLSCs組Caspase3、Caspase8表達水平降低與其對照組相比顯著降低，在1∶20、1∶50時，表達較為穩定（圖2C、D），而當I-PDLSCs與CD3+T細胞以1∶100比例共培養后Caspase3及Caspase8基因表達雖與對照組相比顯著降低但較1∶20、1∶50明顯升高（圖2A、B）。

圖2 CD3+T細胞凋亡相關基因表達

A：正常組共培養48h后Real Time PCR檢測Caspase3 mRNA的相對表達量（*P＜0.05）；B：正常組共培養48h后Real Time PCR檢測Caspase8 mRNA的相對表達量（*P＜0.05）；C：炎癥組共培養48h后Real Time PCR檢測Caspase3 mRNA的相對表達量（*P＜0.05，#P＜0.01）；D：炎癥組共培養48h后Real Time PCR檢測Caspase8 mRNA的相對表達量（*P＜0.05，#P＜0.01）。

2.3 牙周膜干細胞對CD3+T細胞IL-6、TNFα基因表達的影響 我們的研究結果顯示H-PDLSCs與CD3+T共培養比例為1∶10、1∶20、1∶50及1∶100時隨著濃度的降低其IL-6、TNFα均呈現隨濃度變化而降低的趨勢，在共培養比例為1∶20、1∶50時，表達較為穩定（圖3A、B）。隨PDLSCs與CD3+T細胞比例的降低，I-PDLSCs組IL-6、TNFα表達水平顯著降低，1：50比例時IL-6、TNFα降低程度最高，而在共培養比例為1∶100時IL-6、TNFα的基因表達水平較1∶50有所增高（圖3C、D）。

圖3 CD3+T細胞炎癥相關基因表達

A：正常組共培養48h后Real Time PCR檢測IL-6 mRNA的相對表達量（*P＜0.05）；B：正常組共培養48h后Real Time PCR檢測TNFαmRNA的相對表達量（*P＜0.05）；C：炎癥組共培養48h后Real Time PCR檢測IL-6 mRNA的相對表達量（*P＜0.05，#P＜0.01）；D：炎癥組共培養48h后Real Time PCR檢測TNFαmRNA的相對表達量（*P＜0.05，#P＜0.01）。

2.4 H-PDLSCs、I-PDLSCs對CD3+T細胞增殖抑制作用 綜合上述研究結果，在牙周膜干細胞與CD3+T細胞共培養比例為1∶20時其基因檢測較為穩定，因此此部分實驗檢測PDLSCs與CD3+T細胞在共培養比例1∶20時CD3+T細胞CCND1 mRNA表達水平。結果顯示，H-PDLSCs與CD3+T細胞共培養組相較對照組CCND-1表達水平降低（0.27倍，P＜0.05）；I-PDLSCs與CD3+T細胞共培養組CCND-1相較對照組表達水平降低（0.48倍，P＜0.05）。而與I-PDLSCs共培養后CD3+T細胞CCND-1的表達水平高于與H-PDLSCs組共培養組（圖4）。

圖4 H-PDLSCs/I-PDLSCs與CD3+T細胞以1∶20比例共培養48h后Real Time PCR檢測CCND1 mRNA的相對表達量（*P＜0.05）

3.討論

PDLSCs近年來在牙周組織再生領域的研究中，受到了廣泛關注。其多向分化潛能已經得到公認。MSCs可以釋放多種細胞因子，其條件培養基能夠有效增加骨缺損部位的組織愈合，促進纖維結締組織及骨組織增生。與MSCs類似，PDLSCs具有很強的免疫調節能力。PDLSCs在維持牙周組織內環境穩定、創傷愈合及組織再生中發揮重要的作用。有學者通過對PDLSCs條件培養基及牙周炎動物模型的研究發現，PDLSCs可以通過降低TNFα的水平，來抑制牙槽骨吸收，促進牙周組織再生［13，14］。LI等研究表明PDLSCs可以通過分泌可溶性因子的旁分泌途徑及直接接觸抑制來抑制PHA激活的外周血單核細胞的增殖，并可以抑制IL-2及IFNγ的分泌［15］。炎癥環境下，當免疫細胞被活化后，干細胞分泌的免疫調節蛋白增加，從而調控自身免疫調節能力。針對干細胞的免疫調節與組織再生的雙重功能本研究設計相關實驗以檢測炎癥條件下PDLSCs對免疫細胞生物學性能的影響。

MSCs在機體微環境調控下，可以分泌特定的蛋白質，在多種細胞組織的抗炎和生長愈合中發揮重要的作用。其可以從多種組織中獲得，除優異的分化能力外，其最顯著的特征是免疫調節及營養能力［16］。有報道證實MSCs可以促進調節性T細胞的產生［17］。組織駐留記憶T細胞（Tissue resident memory T cells，Trm）是一種新的長壽命記憶T細胞亞群，在先前的細菌或病毒感染后仍存在于屏障組織中，以支持早期/即時防御機制，提供針對病原體攻擊的位點特異性保護。有學者研究提示，Trm在維持牙周內穩態中發揮重要的作用。當牙周內穩態被打破，牙齦屏障的防護作用被破壞，細菌抗原進入更深的結締組織，激活記憶性T細胞，導致牙周炎的發生發展［18，19］。本實驗采用免疫磁珠法進行T細胞的分離培養，磁珠分選系統分離的細胞純度可以達到80-99%，得率在60-90%左右［20］，我們使用了CD3+磁珠從人外周血單個核淋巴細胞中特異性分離獲取了CD3+T細胞。

雖然大部分的文獻報道間充質干細胞具有較強的抗炎作用，但近期也有相關研究表明在炎癥也能反作用于干細胞，并提升其免疫調節性能。當使用外源性炎癥因子TNF-α及INF-γ刺激MSCs后其分泌的iNOS水平增高，從而使其對T淋巴細胞的增殖抑制能力增強，能夠更好的發揮免疫抑制作用［21］。INF-γ聯合Toll受體激動劑能共同介導PDLSCs產生IDO-1，從而增強PDLSCs在牙周炎疾病條件下的免疫應答。T淋巴細胞在人體細胞免疫中起著重要作用，研究證實PDLSCs不引起同種異體T淋巴細胞的增殖，卻能抑制絲裂原和混合淋巴細胞反應引起的T淋巴細胞增殖，其主要是由可溶性因子在PDLSCs介導的免疫抑制中發揮了主導作用［22］。Caspase-8在Caspases家族中舉足輕重，作為介導細胞凋亡的重要蛋白，可以在外界因素刺激下，啟動級聯反應，從而激活Caspase-3，釋放DNA降解酶，降解DNA，最終使細胞發生凋亡［23］。TNFα作為牙周炎發生發展中經典的炎癥因子，在活動性牙周炎的牙周組織中呈高表達水平，在牙周膠原破壞以及骨質吸收中發揮關鍵性作用。IL-6具有多種生物學活性，可以借助內分泌途徑發揮全身功效，其中就包括強大的免疫調節及抗感染功能。本實驗結果表明，正常組PDLSCs與CD3+T細胞共培養時，在PDLSCs與CD3+T細胞比例1∶10至1∶100范圍內，隨著PDLSCs比例的降低，前者對后者的抑制作用增加，抑制了凋亡基因Caspase3/8、炎癥因子IL-6、TNFα的mRNA表達水平。在二者比例為1∶50時，抑制作用較為穩定。炎癥因子組PDLSCs與CD3+T細胞共培養時，在PDLSCs與CD3+T細胞比例1∶10至1∶100范圍內，隨著PDLSCs比例的降低，前者對后者凋亡及炎癥因子分泌的抑制作用增加，抑制了凋亡基因Caspase3/8、炎癥因子IL-6、TNFα的mRNA表達水平。說明PDLSCs可以保護淋巴細胞數目的減少。在二者比例為1∶20及1∶50時，作用較為穩定。這與Najar M等的研究結果相似，從各種來源中（骨髓、脂肪組織等）分離的MSCs以劑量依賴方式抑制CD4+T細胞和CD8+T細胞亞群［24］。H-PDLSCs在與CD3+T細胞按照1∶10、1∶20、1∶50及1∶100的比例共培養后CD3+T細胞的Caspase3、Caspase8、IL-6、TNF-α的表達呈逐步下降趨勢，說明正常情況下H-PDLSCs的免疫調節方面的能力呈穩定趨勢。而在I-PDLSCs在與CD3+T細胞按照1∶10、1∶20、1∶50及1∶100的比例共培養后CD3+T細胞的Caspase3、Caspase8、IL-6、TNF-α的表達在1∶10、1∶20、1∶50時呈逐步降低趨勢，而在1∶100時出現反彈式增高趨勢，呈現這種不穩定的趨勢的原因可能是由于在本實驗的檢測期間CD3+T Caspase3、Caspase8表達水平增高致使細胞呈現顯著凋亡趨勢，而鑒于CD3+T的免疫執行能力進而反饋性的轉錄合成大量IL-6、TNF-α。另一方面，慢性炎癥導致的干細胞生物學功能的變化機理較為復雜，炎癥刺激可導致干細胞內關鍵蛋白的自分泌及旁分泌功能發生變化，這些蛋白可影響干細胞的自噬、凋亡、增殖、分化等功能，本研究的結果在而在I-PDLSCs在與CD3+T細胞按照1∶100時出現反彈式增高趨勢這與上述因素有一定的關系，其具體分子生物學機制尚待深入研究。

此外，我們的研究還證實無論正常還是炎癥條件下的牙周膜干細胞對CD3+T細胞均有一定的增殖抑制能力。CCND1在細胞周期調控中發揮重要的作用。細胞周期蛋白依賴性激酶與細胞周期蛋白結合后被激活，促進細胞周期G1、S、G2、M的定向轉變。本實驗數據表明，在共培養后，與H-PDLSCs組共培養的CD3+T細胞CCND1基因的表達水平是與I-PDLSCs共培養的0.5倍，說明I-PDLSCs對CD3+T細胞增殖的抑制作用減弱。提示在炎癥狀態下PDLSCs的免疫調節能力下降。我們證實了正常及炎癥因子組PDLSCs均可呈濃度依賴性抑制CD3+T細胞的增殖及炎癥因子分泌。但是具體的機制尚不清楚，仍待我們進一步探究。