EPL/PCL/HA復合支架修復兔顱骨骨缺損的實驗研究*

田彬 江青松 張振庭

由腫瘤、外傷、先天性畸形以及老年性骨質疏松等導致的骨組織缺損，是發生于顱頜面部的常見問題［1］。骨組織缺陷的修復與重建主要依賴于骨移植替代材料。隨著組織工程各學科的發展，人工合成骨替代材料逐漸得到臨床的認可。口腔頜面部由于存在與外界相通的竇腔的解剖特點，增加了骨移植術后感染的風險，因此，骨組織工程學的研究集中于開發可以預防潛在感染風險同時具有良好的成骨能力的理想的骨組織工程材料［2］。

ε-多聚賴氨酸（ε-poly-lysine，EPL）是由鏈霉菌天然產生的陽離子多肽［3］。它易溶于水，可以分解為賴氨酸或胺，酰胺，羥基或羧基，從而促進細胞粘附和生長［4］。重要的是，EPL具有廣譜的抗菌活性，可生物降解，并且對人類無毒［5］，因而被廣泛應用于食物防腐、制藥、材料表面改性及基礎研究細胞培養等領域。但以往的文獻報道中并未見將EPL應用于骨組織工程復合支架的研究報道。

我們前期的研究已通過FDM-3D（熔融沉積成型-3D）打印技術成功構建了具有EPL涂層的3D結構納米級聚己內酯/羥基磷灰石（EPL/PCL/HA）復合支架［6］。前期的體外實驗證實，EPL涂層的3D結構EPL/PCL/HA支架具有抗菌性能，還可以促進成骨細胞的成骨分化。然而，EPL/PCL/HA支架的動物體內骨缺損修復作用仍不清楚。本實驗將EPL/PCL/HA復合支架植入兔顱骨臨界骨缺損模型，觀察其在體內是否可以促進骨缺損的成骨。

1.材料與方法

1.1 主要試劑、實驗儀器和動物 納米羥基磷灰石（HA）（昆山華僑科技新材料有限公司），聚己內酯（PCL）（深圳市易生新材料有限公司），ε-多聚賴氨酸（EPL）（鄭州拜納佛生物工程有限公司）。OLYMPUS倒置光學/熒光顯微鏡（OLYMPUS BX61，日本)，種植機（諾瓦格MD20）。

20只雄性4-6月齡，體重3.0±0.5千克的普通級新西蘭白兔，實驗動物的使用已通過首都醫科大學附屬北京口腔醫院研究所實驗動物倫理委員會審查通過（倫理號：KQYY-201803-002）。

1.2 PCL支 架、PCL/HA復 合 支 架 及EPL/PCL/HA復合支架的制備3D PCL支架和3D PCL/HA復合支架由江陰瑞康健生物醫學科技有限公司通過自行開發的熔融沉積成型儀打印制作而成［6］。簡要步驟如下：

PCL/HA支架采用聚己內酯與羥基磷灰石（PCL和HA混合比例7∶3）為原材料，攪拌器攪拌均勻混合，然后使用熔融沉積建模（FDM）系統構建PCL/HA支架。計算機編寫相關程序設定參數后，微型擠出機系統通過沉積噴嘴以熔融形式輸出PCL/HA支架，制成直徑為300μm，間距為450μm的3D支架。PCL支架僅用PCL作為原材料打印。支架打印完成后鈷60輻照滅菌，密封包裝備用。

將PCL/HA支架浸入5mg/ml EPL溶液（EPL溶于無菌去離子水，制成濃度為5mg/ml的EPL水溶液），24小時后，吸出溶液。支架在無菌干燥箱中干燥，完成EPL/PCL/HA支架的制備。并密封于無菌存儲器中備用。

1.3 支架的動物體內植入實驗 將舒泰10mg/kg和速新眠II 0.2ml/kg混合后肌肉注射，全身麻醉實驗兔。麻醉起效后，顱頂區備皮，消毒，鋪巾。沿顱中線做4cm矢狀切口，剝離皮下組織及骨膜，暴露骨面。在低速旋轉和大量生理鹽水冷卻下，顱頂區制備四個圓形直徑6mm的全層骨缺損。骨缺損中心點距中縫5mm連線，與中縫交點處球鉆制備凹坑至松質骨層，填入金屬釘做參考標記點（方便以后結果測量及分析時骨缺損中心點的確定）。然后以四個中心點為標志使用外徑為6mm的取骨環鉆制備四個圓形全層骨缺損，保證下方硬腦膜完整。骨缺損分為四組：1.BC，空白對照組；2.PCL組；3.PCL/HA組；4.EPL/PCL/HA組。根據分組填充對應的復合支架，空白對照組不填入任何材料，僅以新鮮出血形成的血凝塊充盈骨缺損（圖1）。沒有使用額外膜覆蓋。嚴密對位縫合術區骨膜，分層縫合皮下組織和皮膚。消毒皮膚。在手術后即刻和手術后48h內肌肉注射青霉素（10萬U/kg），并密切觀察頭顱手術區恢復情況。

圖1 兔顱骨制備4個6 mm直徑的標準骨缺損，填入不同成骨材料示意圖及手術過程圖。

1.4 熒光標記及標本制取 動物處死前13、14天耳緣靜脈注射10mg/ml鈣黃綠素熒光注射液，動物處死前3、4d耳緣靜脈注射10mg/ml茜素紅熒光注射液。實驗動物隨機分為2組，每組10只，分別于術后4周、8周處死，取顱頂骨標本。

1.5 影相學檢測 顱骨標本，大體觀察完成后，常規固定，通過微型計算機斷層掃描（micro-CT：Siemens Inveon Micro，德國）系統對其進行360度旋轉掃描。數據在Micro-CT自帶軟件中進行三維重建，觀察骨缺損的愈合情況。

1.6 脫鈣標本組織學切片及不脫鈣磨片的制取 經過缺損中心分切標本，平均分成2份。一份行脫鈣處理，切片行HE染色及Masson染色；另一份行脫水處理，制備硬組織磨片。標本在共聚焦顯微鏡下觀察鈣黃綠素、茜素紅相應的激發熒光，分別觀察到綠色和紅色的自發熒光，采集圖像。然后，用甲苯胺藍對磨片進行染色，在顯微鏡下觀察并拍片。確定以下組織形態學參數：新骨面積比（%）=（新形成的骨面積，mm2）/（總面積，mm2）×100（%）。

1.7 統計分析 采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，計量資料以“均數±標準差”表示，統計方法采用ANOVA單因素方差分析比較各組間及組內差異，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 術后觀察及標本大體觀察 所有手術均順利完成，頭顱傷口恢復良好，手術區域未出現感染、及傷口裂開等并發癥，無一例動物死亡，均可參加實驗數據統計。

所取標本肉眼觀察均可見骨缺損處覆蓋纖維軟組織，如圖2所示。術后4周標本，觸摸骨缺損處，所有空白對照組的骨缺損處組織都較軟，邊緣清晰；放置支架組較空白對照組略硬，邊界模糊。術后8周，空白對照組，觸摸較軟，邊界變模糊。PCL組骨缺損處支架材料變軟，骨缺損處邊界不明顯。PCL/HA組和EPL/PCL/HA組骨缺損處無明確邊界，缺損區質地較硬。

圖2 手術后4周及8周的骨組織樣本大體觀

2.2 CT結果Micro-CT掃描數據進行三維重建，結果見圖3。對數據進行分析，Micro-CT分析中，骨體積分數（BoneVolume/TotalVolume，BV/TV）表示骨組織體積與組織體積比值，可直接反應骨量變化情況。用BV/TV對新生骨組織進行定量分析，四周時，EPL/PCL/HA組和PCL/HA組中新生骨顯著多于PCL組及BC組，EPL/PCL/HA組與PCL/HA組差別不大。術后8周時，與4周相比，各組新生骨均有所增加，四組新生骨組織量均有顯著性差異，EPL/PCL/HA＞PCL/HA＞PCL＞BC，EPL/PCL/HA組中新生骨在所有組中是最多的（圖四）。

圖3 手術后4周及8周的骨組織樣本Micro-CT三維重建圖及骨體積分數（BV/TV）統計分析

2.3 脫鈣切片的組織形態學檢測（HE染色，Masson染色）HE染色和Masson染色用于評估缺損區域的骨再生情況。結果表明，新生的礦化組織為骨樣組織。在第4周，空白組和PCL組中從缺損周圍向中心的新形成的骨組織非常有限。在PCL/HA和EPL/PCL/HA組中檢測到更多的新骨形成，EPL/PCL/HA組有最多的新骨形成。當植入時間延長至8周時，空白組僅形成了少量新骨，在放置支架的三組中均比4周對應組有更多新形成的骨。在EPL/PCL/HA組中觀察到的新骨形成量最高，這表明EPL/PCL/HA支架具有強大的骨缺損修復能力（圖4，圖5）。

圖4 手術后4周及8周的骨組織樣本切片HE染色（×40）及新生骨組織面積的統計分析

圖5 手術后4周及8周的骨組織樣本切片Masson染色（×40）及新生骨組織面積的統計分析

2.4不脫鈣磨片的熒光檢測與組織形態學檢測

2.4.1 不脫鈣磨片的熒光檢測 在激光共聚焦顯微鏡下分別拍攝2種熒光條帶并獲得融合照片，新生骨組織螯合鈣黃綠素而呈現出亮綠色，螯合茜素紅而呈現為紅色。用Image J圖像分析軟件通過讀取熒光顯微鏡圖片的灰度值來進行統計學分析。4周時，結果顯示BC組中沒有明顯的新生礦化物組織形成，而PCL、PCL/HA和EPL/PCL/HA組的缺損邊緣處形成了少量不規則和不對稱的新生礦化骨組織，并且支架的形狀得到了很好的維護（圖6 A，C，E，G），且沒有跡象顯示骨代用品的吸收或溶解。EPL/PCL/HA組和PCL/HA組中新生骨顯著多于PCL組及BC組，EPL/PCL/HA組與PCL/HA組差別不大。8周時，放置支架的三組中新生的礦化物組織形成的數量均顯著增加。支架材料的表面逐漸被新的礦物組織所替代（圖6 B，D，F，H）。數據分析顯示，在EPL/PCL/HA組中形成了新的礦物質組織最多，隨后是PCL/HA和PCL組。最低的新礦物組織形成發生在BC組中（圖6）。

圖6 手術后4周及8周的骨組織樣本磨片熒光檢測（×40）及新生骨組織面積的統計分析

2.4.2 不脫鈣磨片的組織形態學檢測 如圖7所示，甲苯胺藍染色結果表明，骨缺損邊緣的新生骨組織被染成藍色，也有少量在骨缺損的中心區形成的新生骨組織被染成藍色。圖六的熒光染色中的亮綠色及紅色標記與染色結果中新生骨組織位置基本一致。統計學結果表明，在兔顱骨骨缺損植入后第4和第8周，與空白組和PCL組相比，EPL/PCL/HA和PCL/HA組中出現了更多的新生礦物組織形成（圖7A-H）。此外，EPL/PCL/HA組中新礦化組織的百分比在第8周時顯著高于其他三組（圖7）。

圖7 手術后4周及8周的骨組織樣本磨片甲苯胺藍染色（×40）及新生骨組織面積的統計分析

3.討論

本研究通過熔融沉積成型（FDM）技術，將納米羥基磷灰石與聚己內酯成功的制備了具有仿生多孔結構的PCL/HA支架，然后在此基礎上負載ε-多聚賴氨酸，形成EPL/PCL/HA復合支架。課題組前期的體外實驗已經證實，EPL/PCL/HA支架具有抗菌性能，還可以促進成骨細胞的成骨分化［6］。本研究將支架運用于兔顱骨骨缺損的修復，從大體解剖、影像學及組織病理學等方面觀察其動物體內的促成骨能力，從而獲得一種具有潛在抗感染功能有具有骨誘導性的骨組織替代物的新型組織工程骨。

3.1 實驗動物模型的選擇 兔的生長周期短，顱骨與頜骨的胚胎學的同源性，顱骨手術操作方便，可重復性好，因而兔顱骨缺損是研究顱頜面部骨缺損的動物模型中最為常用的。

對于兔顱骨的臨界骨缺損的尺寸有多種理論［7］，我們綜合各種觀點后進行了前期實驗驗證，選擇了以直徑6mm全層骨缺損做為本實驗的動物模型。我們的實驗結果顯示，在手術后4周和8周，空白對照組新生骨百分比均少于10%，反應出我們采用制作的6mm圓形貫通顱骨缺損符合臨界骨缺損的要求。此外實驗結果進行micro-CT、不脫鈣組織磨片的顯微熒光分析，以及多種的組織學評價結果分析，放置支架的三組骨缺損形成的新骨均明顯多于空白對照組。由此說明我們的組織工程支架對于骨缺損的修復是有明確意義的。

3.2 3D打印復合材料的優勢 由單一組分加工而成的骨組織工程支架難以實現復雜的臨床條件下的骨再生要求。近年來，學者們著力于將幾種組分材料通過簡單可行的方法復合，從而集中幾種材料的優勢，形成的復合型支架材料，更好的促進骨缺損的愈合。

羥基磷灰石是自然骨的主要無機部分，具有良好的生物相容性和骨傳導性。但羥基磷灰石生物陶瓷脆性高、抗折強度低。聚己內酯（Polycaprolactone，PCL）是一種人工高分子材料。PCL由于其生物可吸收性、力學性能優良、熔點較低、低溫成型等，是優秀的3D打印材料，因而常用作FDM技術制造材料。但是其機械強度低不能夠滿足骨組織工程支架的需求。本實驗中，我們將羥基磷灰石與聚己內酯以3∶7的比例混合，然后使用FDM技術進行三維支架的打印，因而PCL/HA復合支架綜合了兩種材料的優點。

支架材料影響支架的性能，而支架的結構更是影響其成功的重要的因素。成功的支架取決于它的孔隙率、孔結構、力學性能和其表面化學性質［8］。支架需要具有高的孔隙率和貫穿性以支持細胞的黏附和增殖，同時方便營養物質和代謝廢物的轉移［9］。傳統的支架制造方法包括粒子瀝濾法、溶劑澆鑄法、氣體誘導發泡法、纖維網格粘結法、溶液澆鑄法、階段分離法和冷凍干燥法等等［10］，這些傳統的支架制造方法制造的生物支架內部結構隨機，不可控，批次之間無法形成統一的結構。熔融沉積成型（FDM）屬于快速成型技術，在3D打印技術的輔助下，對材料孔徑、孔隙率調控的同時將幾種材料融合整合了幾種成分材料的優勢。本研究采用3D-FDM打印技術制備的PCL/HA支架保證了其多孔狀結構，表面形態整齊，孔徑規整均勻，連通性好。本實驗的結果中4周及8周時，PCL/HA組及EPL/PCL/HA組均可觀察到缺損中心區域成骨，而空白對照組僅觀察到從骨缺損邊緣向中央方向開始形成新生骨，缺損中央未見新生骨。證明了本研究通過FDM技術打印的3D支架達到了組織工程支架的要求，有利于骨組織的細胞及血管向支架內部生長，使缺損中心區域成骨。

對實驗組數據進一步分析，4周時PCL/HA組與EPL/PCL/HA支架組新骨形成量沒有顯著性差異，但兩組明顯高于PCL組。此結果說明組織工程支架由于HA的加入對成骨有明顯的促進作用。8周時PCL/HA組與EPL/PCL/HA支架組仍然明顯高于PCL，但這兩組間也存在顯著性差異，EPL/PCL/HA支架組明顯高于PCL/HA支架組。這個結果說明打印出的PCL/HA支架被EPL表面改性后，有抗菌功能的EPL的添加并沒有影響骨組織生長而是更加促進了成骨。

3.3 EPL的促成骨作用 如何預防骨移植后造成手術失敗的最主要的原因——感染的發生，是材料學、組織工程學等相關學科領域共同關注的難題。全身應用抗生素存在感染位點藥物濃度低、用藥時間長、易產生抗藥性等缺點。因此，對于骨缺損修復的感染的控制，尋找既促進成骨又有局部抗感染能力的骨替代物成為當前研究的熱點。

提高骨組織工程支架的骨傳導性的主要手段有對支架材料進行表面改性，以增強其對細胞的親和力。在我們的研究中，用ε-多聚賴氨酸修飾PCL/HA支架，除了增加了支架的抗菌功能，同時達到對支架表面進行改性的目的。先前的研究發現，EPL作用于細胞膜和蛋白質合成系統以及通過與核糖體結合來抑制蛋白質和酶的合成，抑制細菌的呼吸作用，而具有抗菌功能。那么EPL的加入是否會影響骨缺損區域的成骨呢？

在我們的實驗結果中，4周時EPL/PCL/HA支架和PCL/HA支架促成骨作用相似，而8周時EPL/PCL/HA支架組新骨形成最多，促成骨作用最好。可以說明EPL對支架表面的改性并沒有影響成骨。

EPL是一類可通過體內的水解或酶解反應最終降解為可被人體吸收的小分子氨基酸的可生物降解高分子聚合物，因而具有良好的生物相容性。EPL促進細胞生長、增殖的作用機制可能有幾點。1.通過EPL帶的陽離子與組織細胞表面或細胞外基質的特異陰離子產生的的交聯作用，增加細胞與黏附表面的親和性。EPL能通過靜電吸引等作用，避免細胞聚集成球狀，使細胞在材料上黏附并鋪展為單層，明顯提高了三維條件下的細胞黏附效率［11］。2.EPL修飾過的PCL/HA支架表面親水性增強，表面正電荷增多，吸附組織液和血清中層的粘連蛋白和纖維粘連蛋白，容易保持支架的結構［12］。3.EPL與細胞磷脂雙層有直接的相互作用，材料表面的活性提高了，從而增加細胞的黏附［13］。4.前期實驗中掃描電鏡高放大倍數下觀察到EPL/PCL/HA支架纖維表面呈微粗糙狀，說明經EPL處理后支架表面變的粗糙，提高了細胞在材料上的黏附［6］。

通過實驗證明我們制作的EPL/PCL/HA支架材料因為其良好的宏觀和微觀的三位孔隙結構，表面改性后利于細胞粘附，組織再生，具有良好的生物相容性及促成骨性能。EPL/PCL/HA支架可以增強骨缺損的修復能力。我們的結果表明，EPL/PCL/HA是骨組織工程的有希望的替代品。

鑒于體內研究的觀察時間較短，EPL/PCL/HA支架用于骨缺損的修復效果仍有待于更長觀察時間的評價，此外EPL對PCL/HA支架的表面改性的機理及促成骨機理也是該材料值得進一步研究的方向。