硅酸二鈣對人牙髓干細胞增殖及骨向分化的影響*

劉亞蕊 羅倩婷 鐘文超 曹威 李傳潔 黎星陽 朱明靜 吳安桐 曾素娟

齲病是口腔常見的慢性進行性疾病［1］，當齲病進展累及牙髓組織時，如何保護牙髓、維持牙髓組織對牙體組織的營養支持作用成為了口腔臨床的難題。為保護牙髓組織活性，蓋髓治療是目前有效的治療方法之一，氫氧化鈣、三氧化礦物凝聚體（mineral trioxide aggregate，MTA）、波特蘭水門汀、等為最常用的蓋髓材料［2-4］。其中硅鈣類蓋髓劑——波特蘭水門汀具有良好的生物相容性和密閉性，在牙科治療中受到了越來越多的關注［5］。硅酸二鈣（Dicalcium silicate，C2S）作為波特蘭水門汀的主要成分之一，與其他蓋髓材料成分（如磷酸三鈣、羥基磷灰石等）相比，C2S生物毒性更低，并對銅綠假單胞菌、糞腸球菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等展現出更加強大的長期抗菌能力［6］。

人類來源的牙髓干細胞（hDPSCs，Human dental pulp stem cells）是牙源性干細胞的一種，因其具有良好的多向分化潛能，易獲取等優點，常常被用作口腔組織工程的種子細胞。hDPSCs具有維持牙髓組織內穩態的作用［7］。在使用直接蓋髓術對患牙進行治療時，hDPSCs是最先與蓋髓材料接觸的干細胞，而蓋髓材料中C2S在hDPSCs中的功能作用尚不清楚。本研究將通過多種實驗方法，探究hDPSCs在C2S顆粒的刺激下細胞增殖和骨向分化能力的影響，為蓋髓材料的性能提升、牙體組織的修復和再生等方面提供一定的依據。

1.材料與方法

1.1 主要實驗試劑及儀器C2S微米級顆粒（中科院上海硅酸鹽研究所，中國）；α-MEM基礎培養基（Gibco，美國）；氯化十六烷基吡啶（CPC，Sigma，美國）；Triton-100X（碧云天，中國）；CCK-8試劑盒（碧云天，中國）；ALP染色試劑盒（碧云天，中國）；茜素紅染色液（索萊寶，中國）；ALP、RUNX2、OPN、GAPDH、HRP-Rabbit抗體（abcam，美國）；澳洲胎牛血清（Gibco，美國）；5% CO2恒溫孵育箱（Thermo Fisher Scientific，美國）；β-磷酸甘油（Sigma，美國）；地塞米松（Sigma，美國）；光學顯微鏡（Leica，德國）；L-抗壞血酸（Sigma，美國）；酶標儀（Thermo Fisher Scientific，美國）；Western Blot系統（Bio-Rad，美國）。

1.2 細胞來源hDPSCs購自上海斯德喏生物科技有限公司（貨號：HUM-iCell-m003，中國）。

1.3 CCK-8實驗 選取3-6代hDPSCs作為工作細胞接種到96孔板（3×103個/孔），用完全培養基作為溶劑，配制含有1、5、10、50、100μg/mL C2S的培養液。每個分組設置3個生物學重復，向各組孔中分別加入100μL含不同濃度C2S溶液的條件培養基。選取培養第1、3、5、7d為檢測時間點，向每孔加入10μL CCK-8試劑后，將培養板置于5%CO2恒溫孵育箱，避光孵育1-4h，選擇450nm濾光片下檢測吸光度（OD）值。

1.4 Transwell實驗 將生長狀況良好的第3-6代hDPSCs接種到Transwell小板上室（1×105個/孔），分別加入含1、5、10、50、100μg/mL C2S溶液的培養基，培養24h后，取出Transwell小板下室，PBS洗滌后固定染色。對遷移細胞進行定量分析（Image J）。

1.5 堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）實驗 取hDPSCs，接種于48孔板（2.5×104個/孔）。實驗分為陰性對照組、10μg/mL C2S組和50μg/mL C2S組，配制含10mM β-甘油磷酸鈉、50μg/mL抗壞血酸，10mM地塞米松的成骨誘導培養基，加入濃度為0、10、50μg/mL的C2S溶液。培養7d后，使用BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒進行染色。使用ALP定量試劑盒進行ALP定量分析，并相對于總蛋白含量進行標準化校正。

1.6 茜素紅染色實驗 細胞培養及骨向誘導同步驟5。培養14d后，茜素紅染色并定量分析礦化結節形成情況。4%多聚甲醛固定細胞，0.1%茜素紅染液染色。室溫下用10%氯化十六烷基吡啶脫色30min，測量562nm OD值，總蛋白質濃度作為內參，定量分析礦化結節的含量差異。

1.7 RT-PCR實驗 使用Takara公司的RNA提取試劑盒TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit（Takara，中國）提取總RNA，使用Takara公司的逆轉錄試劑盒PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser和SYBR Premix Ex Taq（Takara，中國）進行逆轉錄反應。每個樣本取1μg總RNA用于逆轉錄。在細胞骨向誘導的第7d，RT-PCR檢測ALP、成骨相關轉錄因子（RUNX2）和骨橋蛋白（OPN）等骨向分化標志物的表達，GAPDH作為內參。通過比較Ct值法（2-△△Ct法）計算各RNA表達值，利用內參將數據進行標準化校正。所得到的數據使用平均值±標準差進行表示。

1.8 Western Blot實驗 選取hDPSCs，接種于6孔板中（2×105個/孔），實驗設對照組、10μg/mL C2S組和50μg/mL C2S組，加入成骨誘導培養基7d后，冰上裂解細胞，BCA試劑盒測定蛋白濃度，100℃金屬浴加熱5min，每組取等質量蛋白質，與loading buffer混合均勻，10% SDS-PAGE 80V恒壓電泳，20V恒壓濕轉17h，室溫下5%脫脂奶粉浸泡，封閉1h；按照1∶1000稀釋目標基因一抗，置于搖床上，4℃過夜，次日反復洗膜后稀釋兔二抗（1∶2000）、洗膜、顯影，最后進行條帶灰度值定量分析。

1.9 統計學處理 將全部實驗數據導入R語言統計分析軟件，對組間差異采用One-Way ANOVA檢測方差齊性，使用t檢驗數據差異，并記錄結果。每個實驗均進行3次生物學重復，當P＜0.05時認為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 不同濃度C2S對hDPSCs增殖和遷移能力的影響 分別用含有0、1、5、10、50、100μg/mL C2S的培養基對hDPSCs實行1、3、5、7d共培養。于第一天，CCK-8實驗顯示各濃度C2S對細胞增殖無明顯影響。從第3d開始，在一定濃度范圍內，細胞增殖能力隨C2S濃度增強，其中50μg/mL C2S的促進作用最強（圖1），差異具有統計學意義（P＜0.01）。Transwell實驗顯示，一定濃度范圍內的C2S對hDPSCs遷移能力有一定的促進作用，通過使用Image J軟件分析染色細胞數目，結果表明50μg/mL C2S的促進作用最強（圖2），差異具有統計學意義（P＜0.001）。基于以上增殖與遷移的實驗，初步篩選出0、10、50μg/mL濃度的C2S用于進一步探究其促進細胞骨向分化的能力。

圖1 C2S促進hDPSCs的增殖

圖2 A-C2S促進hDPSCs的遷移；B-遷移細胞數定量分析

2.2 C2S對hDPSCs骨向分化能力的影響 分別用含有0、10、50μg/mL C2S的成骨誘導培養基處理hDPSCs 7d，通過ALP染色及定量實驗測定ALP活性。我們發現50μg/mL C2S可以顯著提高hDPSCs的ALP活性（圖3），差異具有統計學意義（P＜0.001）。在處理21d后對細胞進行茜素紅染色，染色及定量分析的結果顯示，在50μg/mL C2S作用下，hDPSCs的體外礦化能力顯著提高（圖4），差異具有統計學意義（P＜0.001）。

圖3 A,B,C-C2S增強hDPSCs ALP的活性；D-ALP活性定量分析

圖4 A,B,C-C2S促進hDPSCs礦化結節的形成；D-礦化結節定量分析

2.3 C2S對hDPSCs的成骨相關基因表達的影響RT-PCR結果顯示，在10、50μg/mL的C2S刺激后第7d，10、50μg/mL的C2S均促進成骨相關基因ALP、RUNX2和OPN的RNA表達，且隨著C2S濃度的提高，ALP、RUNX2和OPN的RNA表達也與之上調（圖5）。蛋白檢測結果顯示，hDPSCs中的ALP、RUNX2、OPN等成骨相關蛋白在加入50μg/mLC2S處理后表達水平顯著升高（圖6A，B），差異具有統計學意義（P＜0.01）。

圖5 10、50μg/mL的C2S上調hDPSCsALP、RUNX2以及OPN的RNA表達水平

圖6 A-C2S上調hDPSCs成骨蛋白ALP、RUNX2、OPN的表達；B-蛋白表達定量分析

3.討論

牙髓在牙齒組織中起到營養、調節、感覺等左右，使牙齒能更好、更長久地在我們的口腔中行使功能［8］。堅硬的牙本質包繞著牙髓組織，由于牙體組織具有不可讓性、缺乏有效的側支循環等特點，因此，牙髓損傷后易導致強烈的疼痛，且難以自愈。如何能更好地保存牙髓的功能，成為了口腔內科醫生追求的重要目標。口腔內科常見的活髓保存治療包括：直接蓋髓術、間接蓋髓術以及活髓切斷術［9］。直接蓋髓術是在已暴露的牙髓創面上覆蓋有保護牙髓組織功能的材料，常見有氫氧化鈣、MTA等。于20世紀30年代，氫氧化鈣便開始被用作蓋髓劑，該材料的弱堿性，使其能夠防止口腔內多種細菌導致的感染，并擁有誘導修復性牙本質的形成的潛能［10，11］。但氫氧化鈣易溶解于口腔環境［12］，且在蓋髓治療中的遠期效果并不理想［13-15］。MTA在活髓保存治療中也存變色效應的缺陷［16］，且與現有牙體粘接系統不兼容，影響復合樹脂的粘接性能［17，18］。因而在使用MTA蓋髓治療的情況下，患牙不可直接進行樹脂充填修復操作。因此，不少學者專注研發新型的直接蓋隨材料，其中備受關注的就是硅酸鈣類的蓋髓材料，如Biodentine、BioAggregate、TheraCal、calcium-enriched mixture cement和endosequence root repair material等［19-23］。

C2S作為硅酸鈣材料的家族成員，引起了學者的關注。C2S是一種硅基生物玻璃材料，除了具有促進細胞增殖、遷移的作用之外，Li HW等人還發現C2S能夠促進成骨細胞中成骨相關RNA和蛋白的表達，促進成骨細胞的成骨向分化［24，25］。課題組前期研究表明，50μg/mL C2S可以通過調控mRNA和circRNA之間的相互作用促進BMSCs的成骨向分化［26］，20μg/mLC2S浸提液培養72h后能夠促進牙周膜干細胞的ALP表達和礦化結節的形成［27］。C2S顆粒還可用于組織工程復合支架的制作，向支架中加入C2S后可顯著促進小鼠前體成骨細胞MC3T3-E1的增殖和骨向分化［28］。也有研究報道稱，C2S涂層與模擬體液混合后會形成類似于碳酸羥基磷灰石的表面結構，該結構與骨組織形態非常接近，這種C2S涂層可以促進成骨細胞的黏附、增殖和分化［29］。

本研究結果顯示培養3d以上時，濃度為10、50μg/mL的C2S能夠促進hDPSCs的增殖，而過高濃度（100μg/mL）使用時則可能會影響hDPSCs增殖能力。細胞遷移能力也是hDPSCs修復活動的重要指標之一，良好的遷移能力顯示細胞活力較好，對局部組織的修復能力較強［30，31］，本研究中通過Transwell實驗驗證了50μg/mL C2S對hDPSCs遷移能力有顯著促進作用。ALP是成骨細胞活性增強的標志物，ALP活性升高表明骨形成正處于活躍的階段。RUNX2在成骨細胞分化中具有重要作用，它的升高提示存在成骨祖細胞增殖，間充質細胞成骨向分化。在成骨細胞分化過程中，RUNX2在早期弱表達，其表達量在前成骨細胞中提高，在未成熟的成骨細胞時為最高水平，而在成熟的成骨細胞中則下調。OPN是骨組織中發現的第一種細胞外基質蛋白，其中的OPN會從成骨細胞和破骨細胞中釋放出來，具有調節骨細胞粘附、破骨細胞功能和基質礦化作用，并在抑制過度礦化中具有重要意義［32］。可見在成骨的整個時期，一定濃度的C2S可以促進hDPSCs成骨向分化并促進其形成鈣化顆粒。本研究結果顯示，hDPSCs在50μg/mL C2S的環境中，其ALP活性有顯著增強。茜素紅染色定量分析結果顯示，在加入50μg/mL C2S礦化培養21d后，hDPSCs的體外礦化能力顯著增強。本研究分別從RNA水平與蛋白水平檢測hDPSCs骨向分化能力。其中成骨早期標志物ALP、成骨相關轉錄因子RUNX2和骨橋蛋白OPN是細胞成骨活動的重要標志物［33-35］。在歷時7d的骨向分化誘導后，ALP、RUNX2和OPN的RNA表達水平及蛋白水平均發生顯著上調，進一步證實了C2S具有良好的成骨誘導性能。

綜上所述，C2S在適當濃度時不僅對hDPSCs的增殖、遷移有促進作用，并且能顯著促進其成骨礦化能力，具有成為直接蓋髓劑的潛能。但本研究僅在體外環境探討了C2S于hDPSCs中的功能作用，體內環境中C2S的功能作用尚未得到驗證，其成骨誘導的機制亦有待于進一步探討。