均質技術制備黑木耳多糖的研究

梁愛梅，蔣士龍，李德海，包怡紅，劉浩帆

(1.黑龍江飛鶴乳業有限公司，北京 100015；2.東北林業大學林學院，哈爾濱 150040)

0 引言

近些年大量的藥理和臨床研究發現，食用菌多糖具有多種生物活性[1-2]，其中木耳多糖在預防心腦血管疾病發生、降血脂、抗凝血、抗氧化、防輻射、抗炎等[3-4]方面具有顯著的效果。因此，木耳多糖的研究在醫藥和食品等領域中越來越受到重視。

黑木耳(Auriculariaauricula)，由菌絲體和子實體構成，在真菌分類學中，錄屬擔子菌亞門、層菌綱、木耳目、木耳科、木耳屬[5]。黑木耳的細胞壁質地堅韌，胞壁內多糖等活性物質不容易從中溶出，導致傳統水提法制備黑木耳多糖生產周期長、提取效率較低。通過使用一些現代物理技術可以對黑木耳進行破壁處理，可以加速多糖等成分的釋放提高生產效率。研究發現高壓均質技術破壁率高、可控制、產熱量低以及破壁速度快等特點[6-7]，有利于黑木耳多糖迅速完全溶出，縮短制備時間。

以黑木耳為原料，研究高壓均質技術對黑木耳多糖制備率的影響，采用單因素試驗重點考察料液比、均質時間、均質壓力等因素對黑木耳多糖得率的影響，并進一步通過響應面Box-Behnken中心組合試驗設計，優化高壓均質技術制備黑木耳多糖的最優工藝。通過研究為黑木耳多糖的開發利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑木耳，2019年5月黑龍江省海林林業局提供，將干黑木耳粉碎后過40目篩，至于常溫下保存備用；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

SRH60-70型高壓均質機，上海申鹿均質機有限公司；FJ-200型高速萬能粉碎機，天津泰斯特儀器公司；R-205B型旋轉蒸發儀，上海申勝儀器公司；DL-6M型離心機，湖南星科科學儀器有限公司；LT502型電子天平，常熟市天量儀器有限責任公司；722型可見分光光度計，深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 高壓均質技術制備黑木耳多糖的工藝研究。將一定量黑木耳原料粉采用食品級石油醚進行脫脂處理，然后采用95%乙醇處理去除去小分子量糖，將脫脂后的黑木粉按一定料液比(1∶60、1∶80、1∶100、1∶120、1∶140 g/mL)加入蒸餾水，采用高壓均質機在一定壓力(15、20、25、30、35 MPa)下均質處理一定時間(10、15、20、25、30、35 min)，取出黑木粉水提液以4500 r/min離心15 min后收集上層清夜，殘渣復提，然后合并復提上清液，在65 ℃條件下旋轉蒸發濃縮至原初始體積的1/4，加入無水乙醇調至濃度為80%，放置于4 ℃醇沉過夜，以4 500 r/min離心10 min收集沉淀為黑木耳粗多糖，最后采用苯酚-硫酸法測定黑木耳多糖得率。

根據單因素試驗結果，進行三因素三水平的Box-Behnken中心組合設計，以黑木耳多糖得率Y(%)為響應值進行響應面試驗，確定均質壓力(A)、均質時間(B)和料液比(C)對高壓均質方法制備黑木耳多糖的工藝的影響。

1.3.2 黑木耳多糖得率的測定。采用苯酚-硫酸法[8]，配置不同濃度的標準葡萄糖溶液并置于25 mL具塞比色管中，加入6%溶解的苯酚溶液1 mL，加入5 mL濃硫酸，振搖并混合，使其在室溫下靜置30 min，采用可見分光光度計于OD490nm處測定光密度，建立葡萄糖質量濃度與吸光光度值的關系標準曲線。然后將黑木耳多糖稀釋至合適濃度，以使其測量范圍在標準曲線內，在試管中精確稱取多糖稀釋液1 mL，加入1 mL水后加入6%苯酚溶液1 mL，迅速搖勻，加入5 mL濃硫酸，室溫靜置30 min后，在490 nm測量吸光度，重復3次操作，樣品中的總糖含量由標準曲線計算，最后計算出黑木耳多糖得率。

1.4 數據處理

實驗數據做3組平行，取平均值(means±SD)，結果采用Origin 9.0軟件進行繪圖，采用Design Expert 10軟件進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 均質壓力對黑木耳多糖得率的影響

從圖1結果可以看出，均質壓力小于25 MPa時，隨著均質壓力的增加黑木耳多糖得率提高，當壓力為25 MPa時黑木耳多糖得率最高，隨著均質壓力繼續增加時黑木多糖得率反而下降。其原因是適當的均質壓力可以破碎組織壁或細胞壁，同時有利增加溶劑的溶解能力，從而提高多糖得率，但是均質壓力過大會對導致溶液黏度增加不利于提取，也可能會破壞多糖結構，導致多糖得率降低[9]。因此選擇均質壓力25 MPa為最佳點進行響應面優化試驗。

圖1 均質壓力對提取率的影響

2.2 均質時間對黑木耳多糖得率的影響

從圖2結果可以看出，黑木耳多糖得率隨著均質時間的延長呈現出先提高后降低的趨勢，當均質時間為25 min時，黑木耳多糖得率最高，值為33.0%。在較低均質時間范圍內，黑木耳多糖隨著壓力時間的延長溶出量逐漸增加，但是均質時間過長可能會導致多糖降解，而降低多糖得率[10]。因此選擇均質時間25 min較為合適。

圖2 均質時間對提取率的影響

2.3 料液比對黑木耳多糖得率的影響

從圖3結果可以看出，黑木耳多糖得率隨著料液比增加呈現出先提高后降低的趨勢，當液料比為1∶80(g∶mL)時，黑木耳多糖得率最高，值為32.9%。其原因是液料比越大，黑木耳原料在溶劑中分散越均勻，黑木耳與溶劑接觸越充分，多糖就越容易溶出，提高多糖得率。但是當液料比非常大時，黑木耳原料濃度顯著下降，高壓均質對黑木耳原料組織壁破壞能力下降，導致多糖溶出效果不好，而降低多糖得率[11]，同時溶劑過多還會增加后期濃縮時間，增加成本。因此選擇1∶80(g∶mL)的液料比較為合適。

圖3 料液比對提取率的影響

2.4 黑木耳多糖制備工藝條件的優化

2.4.1 模型方程建立與方差分析。以均質壓力(A)、均質時間(B)和料液比(C)為影響因素，以黑木耳多糖得率(Y)為響應值進行研究，響應面試驗結果如表1所示，采用Design-Expert軟件進行試驗數據處理，得到響應面回歸方程為Y=40.60-0.43A+0.10B-1.31C-0.45A×B+0.09A×C+1.57B×C-3.23A2-4.57B2-3.50C2。

表1 Box-Behnken 試驗方案及結果

從表2中可以看出，模型p<0.0001，表明回歸模型對黑木耳多糖提取率的響應值表現出極顯著水平，說明試驗設計合理。失擬項不顯著(P=0.1378>0.05)，表明該回歸模型計算結果與檢驗結果的差異性不顯著。模型決定系數R2=0.9937，變化系數CV=1.29，說明試驗預測值和實際值顯著相關，模型擬合較好，可以用于響應值的預測。從表2中方差分析結果中還可以看出，回歸模型二次項中的C、BC、A2、B2、C2對黑木耳多糖得率有極顯著影響(P<0.01)，A達到顯著水平，AB與AC不顯著(P>0.05)。從F值可知，三個因素對黑木耳多糖得率的影響大小順序為：料液比(C)>均質壓力(A)>均質時間(B)。

表2 回歸模型方差分析

2.4.2 響應面交互作用分析。Box-Behnken中心組合設計響應面圖和等高線圖能夠直觀看出制備因素兩兩之間的交互作用，曲面越平緩等高線越稀疏表明對成分提取率影響越小；而曲面越陡峭等高線越密集表明對成分提取率影響越顯著[12]。因此將回歸模型中的某個因素看成零水平，就能夠知道其他兩個變量的相互作用結果。由圖4、圖5和圖6響應面和等高線圖中可以看出，料液比(C)的響應面最為陡峭，說明料液比(C)對高壓均質法制備黑木耳多糖影響最為顯著，其次是均質壓力(A)與均質時間(B)，此結果與方差分析結果一致。

圖4 均質壓力和均質時間交互影響的響應面圖和等高線圖

圖5 均質壓力和料液比交互影響的響應面圖和等高線圖

圖6 均質時間和料液比交互影響的響應面圖和等高線圖

2.4.3 提取工藝條件的優化和可靠性驗證。通過響應面軟件得到最佳提取工藝為：均質時間24.91 min，均質壓力24.66 MPa，料液比1∶76.15，黑木耳多糖得率理論值可達40.74%。考慮到實際操作的方便，將最佳工藝條件調整為：均質時間25 min，均質壓力25 MPa，料液比1∶76，進行3次平行實驗，黑木耳多糖得率為(40.33±0.41)%。可見，實驗結果與預測值非常接近，說明該模型能較好地模擬和預測高壓均質法提取黑木耳多糖的得率。

3 結論

采用高壓均質技術提取了黑木耳多糖，并利用響應面分析法進行優化，得到的最優工藝參數為均質時間25 min，均質壓力25 MPa，料液比1∶76，在此工藝下黑木耳多糖得率可達(40.33±0.41)%。高壓均質技術能夠充分破碎黑木耳組織結構，使可溶性多糖最大限度的溶出，與傳統工藝相比具有操作簡單、耗時短，提取率高等優點，為多糖的提取提供了一條新型綠色的新途徑，具有廣闊的應用前景。