食品中黃曲霉毒素檢測方法研究進展

黃金發，戴 煌，黃周梅，馬 輝，王加華，肖安紅，舒在習

（1.山東新希望六和集團有限公司，山東青島 266100；2.武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北武漢 430023；3.杭州老爸評測科技有限公司，浙江杭州 310051）

近年來隨著經濟的發展，人們生活水平不斷提高，對食品品質的要求也越來越高，其中符合食品安全要求是保證食品品質的首要前提。水果在生長、采收、貯藏、運輸、銷售等過程中，易受到病原微生物的污染，特別是在貯藏期間，由病原菌侵染引起的水果采后腐爛較多，產生并積累各種真菌毒素。其中，污染水果最主要的真菌毒素包括鏈格孢霉毒素、展青霉素、赭曲霉毒素及黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）。長期以來，由于鮮食水果在食用過程中會去除腐爛部位，水果中的真菌毒素污染未引起足夠的重視。研究表明，腐爛部位周圍的健康組織也會有不同程度的真菌毒素檢出[1]。通過剔除腐爛部分降低毒素及病菌污染，這并不能完全消除水果制品的潛在風險。黃曲霉毒素主要是由黃曲霉和寄生曲霉等在合適的溫度和濕度條件下產生的次級代謝產物，對人畜有強烈的致病性、致癌性，嚴重危害人體健康，在糧油、飼料以及副產品中廣泛存在[2]。污染糧食的黃曲霉毒素主要有B1、B2、G1和G2，黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）毒性最強[3]，被世界衛生組織（WHO）列為Ⅰ類致癌物。AFB1性質穩定，對光和熱比較穩定，在280 ℃高溫時才會發生降解，因此，一般烹調加工溫度難以破壞AFB1結構。近幾年，我國由AFT 引發的食品安全問題不斷發生[2]。我國于2017 年3 月17 日頒布了新修訂的真菌毒素限量標準GB 2761—2017《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》[4]，目前已成為各級政府、質監機構監管食品中真菌毒素污染的標準依據。

為了保障食品安全、維護消費者權益，準確檢測食品中AFT 含量，確定AFT 污染程度至關重要。我國《GB 5009.22—2016 食品安全國家標準食品中黃曲霉毒素B族和G 族的測定》規定的測定方法主要有薄層色譜法、液相色譜-串聯質譜法、高效液相色譜法、酶聯免疫吸附篩查法[5]。隨著檢測技術的快速發展，越來越多的AFT 新型檢測方法被開發。近年來食品安全事件屢見不鮮，消費者對食品安全越來越關注，市場對快速檢測技術的需求也越來越高。2017 年國家食品藥品監管總局組織制定了《食品快速檢測方法評價技術規范》，為開發AFT 快速檢測方法提供了標準和依據。本文針對國內外AFT 的檢測技術進行簡要總結，尤其是近年來發展的新型快速檢測技術和方法，對比分析各種方法的優缺點，以期為AFT快速檢測新技術的開發和應用提供理論支持。

1 色譜法

色譜法是利用混合物中各組分在兩相中分配系數不同，當流動相推動樣品中的組分通過固定相時，在兩相中進行連續反復多次分配，從而形成差速移動，達到分離的方法。

色譜法分為薄層色譜法和液相色譜法。薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）是應用最早的AFT 檢測技術之一，適用于具有熒光性質的毒素檢測[6]。其基本原理是在365 nm 波長的紫外光照射下，AFB1、AFB2產生紫色熒光，AFG1、AFG2產生綠色熒光，通過對比樣品與標準品的熒光強度來確定其含量[7]。TLC 法具有所需設備簡單、操作方便、檢測成本低等優點，缺點在于樣品前處理復雜、易受周圍環境影響、結果準確性差，且該方法的最低檢出限遠高于國際規定的毒性安全限量[8]，故此方法使用較少。液相色譜（liquid chromatography，LC）檢測方法是目前最常用的檢測AFT 的方法之一。其原理是樣品經提取、凈化、去除干擾物質后經過色譜柱，分離組分在色譜柱的流動相和固定相中的溶解度不同而將樣品中的AFT 分離，然后進入檢測器進行分析和鑒定。LC 法具有準確度高、重現性好等優點，但缺點在于樣品前處理復雜、操作繁瑣、成本較高、不利于大批量樣品檢測，且由于AFB1和AFG1接觸水以后，會發生熒光猝滅現象，很難用普通LC 法直接檢測出來。常見的LC 檢測方法有液相色譜-質譜聯用法（liquid chromatography-mass spectromety，LC-MS）、高效液相色譜-質譜法（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）和超高效液相色譜法（ultra high performance liquid chromatography，UHPLC）。MS 作為一種高通量、高靈敏度的檢測器，無需衍生化反應，能簡化樣品的前處理步驟。MS 的多反應檢測模式能同時對多種毒素進行檢測，提高了檢測效率。然而MS 設備昂貴，導致難以普及使用。目前許多新材料被研究用于樣品前處理，例如結合Fe3O4磁性納米粒子（magnetic nanoparticles，MNPs）[9]和分子印跡技術[10]作為吸附劑萃取食品中AFT，能提高富集效率，簡化樣品前處理步驟，大幅提升HPLC-MS 的檢測性能。隨著液相色譜系統顆粒度的不斷降低，色譜分離度不斷提高，填料粒徑＜2 μm 的UPLC 柱效更高，分離效果更好，靈敏度更高，適于微量分析[11]。HPLC/UHPLC 法具有靈敏度高、準確、可靠的優點，是國標使用的方法，但是需要較昂貴的儀器及專業操作，且樣品前處理復雜，難以進行大規模的樣品檢測。

2 免疫法

免疫分析法是利用抗原和抗體間的特異性結合反應、來檢測待測物質（如藥物、毒素、蛋白質、微生物等）的一種分析方法。由于抗原的抗原決定簇和抗體的抗原結合部位間具有結構互補性及良好的親和力，可以發生相互作用，因此，抗原和抗體之間具有較高的特異性和選擇性。在抗原-抗體結合過程中，一般通過已知抗原檢測未知的抗體，或通過已知抗體檢測未知的抗原，然后選擇定性或定量的方法進行測定。目前，免疫分析技術已廣泛應用于臨床診斷和醫學研究中，成為一種常見的生化分析手段。標記免疫技術是在抗原-抗體反應基礎上標記抗體或抗原的免疫檢測技術，一般將酶、熒光素、放射性核素等作為標記物進行標記。標記物可以保持抗原或抗體本身的活性，而不改變其免疫特性。當標記物連接到相應抗原或抗體后，可通過直接測定復合物中的標記分子及相應反應，實現目標物質的定量分析。按標記物可以分為酶聯免疫吸附法、側流免疫層析法、熒光法、放射免疫測定法、化學發光免疫分析法等。

2.1 酶聯免疫吸附法

酶聯免疫法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是基于免疫學和細胞工程學的檢測技術，是檢測食品中AFB1最簡單、方便的方法之一。ELISA 一般吸附在96 孔或394 孔板表面進行，常采用競爭法構建ELISA檢測AFT。利用抗原與抗體之間的高度特異性和酶的高效催化性，將抗原或抗體與載體蛋白結合固定在基板表面，加入酶標抗原/抗體與樣品中的抗原和載體上的抗原或抗體發生反應，產生酶-抗原-抗體的復合物，通過添加酶的反應底物使溶液快速產生顏色變化，從而進行定性定量分析的方法，又稱比色法[12]。常用底物為3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺和2,2’-氨基-二（3-乙基苯并噻唑啉磺酸-6）銨鹽[13]。有研究利用酸堿指示劑作為顯色底物，在不同pH 下的顏色變化來開發簡易的比色法[14]。相比于儀器檢測方法，ELISA 在靈敏度、成本、操作技術等方面具有優勢。目前，市場上已有許多商業化的ELISA 試劑盒[15]，其準確性、檢測范圍等方面都已較為成熟，可為現場快速檢測提供支持，特別是對滿足發展中國家和不發達國家的食品安全檢測需求具有重要意義。然而，ELISA 方法存在線性范圍窄，試劑保質期短，酶活性不穩定，需要低溫保存，在實際檢測樣品中易出現假陽性結果等缺點[16]。

基于酶聯免疫技術的比色法是通過酶催化顯色底物產生顏色變化，檢測相應信號的分析方法，具有快速、簡便的優點，結果可用肉眼直接觀察。類似的利用適配體作為識別原件，結合納米材料的比色法也是常用的檢測方法之一，其原理是納米顆粒（納米金、納米銀等）具有非常高的消光系數和強吸附性，在分散狀態下呈紅色，溶液環境改變使得納米顆粒聚集后變為藍色，根據分散和團聚狀態下的不同顏色從而間接地實現目標物定性和定量測定[17]。基于納米顆粒開發的比色方法可直接通過肉眼觀察顏色變化定性判別，也可利用紫外-可見光譜檢測吸光度定量分析AFB1含量[18]。基于適配體的納米顆粒比色法可提供穩定的、視覺上可觀察到的實驗結果，操作簡單快捷，適于現場快速檢測。

2.2 側流免疫層析法

側流免疫層析法（lateral flow immunoassay strips，LFIAs）是集單克隆抗體技術、免疫技術和新材料技術于一體的檢測方法，其原理是在免疫層析紙上固定半抗原作為檢測線，間隔一段距離固定免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）作為對照線。在樣品中加入標記物-抗體復合物，若樣品中不含待測抗原，標記物-抗體將與檢測線上半抗原特異性結合形成顏色帶，同時標記物-抗體與對照線上的IgG 結合也形成顏色帶，顯示兩條顏色帶，結果呈陰性；若樣品中含有待測抗原，則游離抗原與標記物-抗體結合，競爭性抑制檢測線上的半抗原與標記物-抗體的結合，導致檢測線的條帶顏色變淺，甚至消失，檢測結果呈陽性，樣品中待測抗原的含量與測試線條帶顏色的深淺成反比[19]。信號標記物一般都具有合成簡單、信號強等優點，常用的標記物有納米金（gold nanoparticle，AuNPs）[20]、碳納米材料[21]、量子點[22]、MNPs[23]等。其中，基于AuNPs 的LFIAs 具有迅速、便捷、安全、可現場化檢測等優勢，被開發成各類目標物的免疫試紙條很快進行商業化應用[24]，而且可同時實現多目標檢測[25]，現已廣泛用于AFT 檢測[26]。基于膜的LFIAs 具有簡單、快速（可在10 min 內檢測）、成本低的優點，被廣泛用于食品安全檢測領域。然而LFIAs 只能用于初步篩選，僅提供定性或半定量結果，而沒有定量信息。利用條紋閱讀器將試紙條上的顏色密度轉換成測試線或控制線的光密度可以準確測量信號強度。

2.3 熒光法

熒光法是將具有熒光的物質制成熒光標記物作為探針來檢測目標物，具有特異性強、靈敏度高、分析速度快、使用時間長等優點。熒光法有效克服了比色法靈敏度相對較低的缺點，通常與免疫層析法結合使用。常用的熒光標記物包括量子點[27]、熒光微球[28]、熒光有機染料[29]等。熒光法主要包括熒光標記法[30]和熒光共振能量轉移法（fluorescence resonance energy transfer，FRET）[31]。熒光標記法采用熒光標記物代替酶來產生熒光信號，原理與ELISA 類似。Tang 等[32]把AFB1-BSA 耦合物修飾在Fe3O4MNPs 表面作為探針，將熒光染料羅丹明B（rhodamine B，RB）包埋在介孔SiO2納米粒子內，在其表面修飾抗體作為熒光探針，利用直接競爭模式構建熒光法檢測AFB1。加入含AFB1樣品時，AFB1和AFB1-BSA-MNPs 與抗體-SiO2-RB 競爭性結合，磁分離后檢測剩余溶液的熒光信號，熒光強度與AFB1含量呈負相關。該方法在花生油樣品中檢測結果與HPLC 結果一致。供體熒光基團的發射光譜與受體熒光基團的吸收光譜有一定的重疊，當用供體基團的激發波長激發時，可觀察到受體基團發射熒光的現象稱為熒光共振能量轉移。通過測量分別標記有供體/受體熒光團的熒光可建立熒光檢測法[33]。供體為熒光標記物，受體一般為較強熒光猝滅的材料，如氧化石墨烯（graphene oxide，GO）[34]、AuNPs[33]、MNPs[35]等納米材料。熒光法具有較高的靈敏度，在AFT 檢測中顯示出巨大的潛力。然而，在熒光檢測過程中，生物系統中的核酸、氨基酸和蛋白質分子容易被激發出強烈的背景熒光，增加背景干擾而影響檢測靈敏度，需要除去食品基質，降低基質產生的背景干擾。

3 光譜法

光譜分析技術是指獲取來自目標特定波長范圍內的光譜信息進行變換分析，提取相關物理參數信息。該目標所產生的光譜信息可以來自目標自身的自發輻射，或者光譜信息來自測試目標對來自輻射源的反射轄射。光譜的波長位置信息包含了轄射光源和傳播介質的化學元素構成，譜線強度則反映了目標的元素含量大小、壓力、形狀等信息。目前用于AFT 檢測的光譜法主要有表面增強拉曼散射光譜法和近紅外光譜法。

3.1 表面增強拉曼散射技術

表面增強拉曼散射（surface enhanced raman scattering，SERS）光譜具有強特異性、高分辨率、高靈敏度等獨特優勢，其原理是吸附貴金屬（如金、銀或銅）粗糙表面的樣品用拉曼光譜法測定時，拉曼光譜信號受表面等離子共振而得到增強。SERS 是觀察和檢測目標分子的有效方法。通過高度增強的拉曼信號，可以識別非常低的分子濃度并改善傳感器應用中的檢測極限。利用SERS 檢測AFB1、AFB2、AFG1、AFG2時，發現四種AFT 的特征拉曼峰為1 592 cm-1，拉曼信號強度與AFT 含量呈良好的線性關系，結果與密度泛函理論計算一致[36]。基于免疫法的SERS 傳感器，在一塊芯片上可實現三種真菌毒素的獨立檢測[37]。拉曼光譜檢測快速、簡單，但是極少數貴金屬粗糙面才具有較強的SERS 效應，其制作工藝難以統一標準化，導致其重復性較差，應用受到限制。

3.2 近紅外光譜技術

近紅外光譜（near infrared spectroscopy，NIRS）是一種快速、無損且經濟的評估產品質量的分析工具[38]，在農業、食品和制藥等產業中用于原料測試、產品質量控制和過程監控[39]。Putthang 等[40]利用短波NIRS 檢測拋光大米中的AFB1殘留，建立偏最小二乘判別分類模型的相關系數（r）為0.952，對含有AFB1的樣品分類正確率達到90%，表明NIRS 技術能用于篩選被AFB1污染的拋光大米。Tao 等[41]利用可見-近紅外光譜法在400～2 500 nm下檢測去殼花生表面的AFB1，采用隨機森林算法篩選最適特征波長，建立的PLS-DA 模型在20 μg/kg 和100 μg/kg 閾值下的整體分類判別正確率分別為90.00%和94.29%。相比于其他方法，NIRS 法靈敏度不高，但分析簡便快速、不會破壞待分析樣品，可用于AFT 的快速篩查和在線檢測。

目前在特定波長下的成像技術也應用于AFT 的檢測。如Wang 等[42]利用NIRS 成像技術檢測玉米中AFB1，選擇1 739 nm 和2 344 nm 波長作為輸入，經過主成分分析后建立模型，像素驗證準確率達到100%，利用獨立數據驗證方法重復性，準確率為92.3%。高光譜成像（hyperspectral imaging，HSI）是一項新興技術，將成像和光譜學集成到樣品的空間和光譜特性的系統中。HSI 為圖像中的每個像素獲得完整的光譜，能在樣本內的多個位置識別獨特的光譜特征[43]。成像技術靈敏度不高，但能簡便快速檢測食品表面AFT 污染情況，有較強的應用潛力。

4 生物傳感器方法

生物傳感器是一種以生物敏感材料為識別元件（包括酶、抗體、抗原、微生物、細胞、組織、核酸等生物活性物質）結合適當的理化換能器及信號放大裝置的分析工具或系統。基本原理為當目標物與識別元件特異性結合后，可通過信號轉換器將檢測信號轉變為電信號，經過儀表放大和輸出從而達到檢測目標物的目的。目前在AFT 檢測中使用較多的有電化學生物傳感器、石英晶體微天平傳感器、表面等離子共振傳感器等。

4.1 電化學法

電化學法（electrochemistry，EC）是基于電化學原理在化學反應和電流反應之間建立關系，將生物活性材料或化學復合物附著到電極表面，AFT 被固定在電極表面上的材料捕獲，引起電極表面電活性分析物的化學反應而發生變化，測量形成的電化學信號，如電位、電流、電導率或電量的物理量。常采用三電極系統，包含工作電極、對電極和參比電極[44]。為了提高檢測性能，可在工作電極表面修飾一些功能材料，如GO[45]、AuNPs[46]、單壁碳納米管[47]、多壁碳納米管[48]、MNPs[49]等。這些功能材料的修飾，提升了工作電極的電子傳導效率，同時能提高抗體或適配體的負載量，進而提高檢測靈敏度[50]。電化學法以其靈敏度高、檢測迅速、設備操作簡單、成本低、不受樣品顏色和濁度的影響等優勢在AFT 的快速檢測中脫穎而出。目前常用的電化學方法有電流法（例如電流-時間曲線）、伏安法（例如差分脈沖伏安法、循環伏安法）和阻抗法。設計新穎的納米材料作為制造電極的基底是獲取高性能生物傳感器的理想方法。許多先進的納米復合材料具有高電導率，與受體的強結合相互作用，例如，ZnS 量子點、核-殼結構和金屬有機框架材料被設計用于制造具有高靈敏度、選擇性和穩定性的電化學生物傳感器[51]。同時為了提高電流信號強度，通常將酶標記在AFB1 抗體/適配體上進行信號放大。電化學法在成本低、簡便性、便攜性、快速響應、靈敏度高、特異性強、易實現自動化等方面有優勢，已被廣泛研究。隨著材料和加工技術的發展，可拋棄、便攜式商業化電極，如絲網印刷電極[52]、叉指微電極[53]等已經逐步顯現實際應用潛力，降低了檢測成本。然而電化學法環境適應性差，食品基質容易對背景信號產生干擾，需要根據不同的環境來調整方法并優化。為了驗證電化學法的可靠性，應對開發電化學法與金標法進行更多的比較研究，充分探索電化學法的性能、使用范圍和條件。

4.2 石英晶體微天平生物傳感器法

石英晶體微天平生物傳感器法（quartz crystal microbalance，QCM）的基本原理是將表面修飾有識別元件的壓電傳感器放置在含有分析物的溶液中時，目標物與固定在涂層表面的識別元件相互作用會導致晶體質量增加，并引起QCM的震蕩頻率偏移，從而進行檢測[54]。QCM傳感技術可實現AFB1 的無標記和實時檢測。目前應用QCM的新策略主要包括：（1）構建新的識別元件來捕獲更多的目標物將信號增大。例如開發分子印跡層、共價有機骨架復合材料等[55]作為識別原件，來捕獲更多的AFT，使得界面質量增大來增強檢測信號。利用基因技術開發靈敏度更高的抗體IgA，由于IgA 的分子量比IgG 大，其敏感性更高[56]。（2）開發新型信號放大材料，如Fe3O4@SiO2核-殼磁性復合納米粒子，在外加磁鐵的作用下將復合磁性納米粒子固定在QCM電極表面，實現信號放大。

目前QCM 的設計和開發通常在實驗階段比較成熟，但在實際應用方面有明顯局限性。實際樣品中食品基質引起的噪聲會導致低濃度的AFB1信號難以檢測，QCM界面的非特異性吸附導致實驗結果與QCM的真實物理現象之間的誤差較大。QCM具有簡單、快速、成本低和免標記的優點，但在實際應用方面有明顯的局限性。

4.3 表面等離子共振生物傳感器法

表面等離子共振生物傳感器法的基本原理是當入射光以一定的入射角照射到金屬表面（通常是金表面）時，一部分光能穿過金屬涂層與金屬表面層中的電子耦合，電子由于激發在平行于金屬表面方向上移動，發生表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）[57]。目前常用的是基于適配體和抗體的SPR 傳感器來檢測AFB1。適配體具有價格便宜、易獲得、穩定性好等優點，當AFB1與基于適配體的SPR 傳感器的芯片結合時，SPR 信號增加。傳感器芯片可通過流注緩沖劑將綁定的AFB1從適體上解離實現再生。該方法的芯片靈敏度高、穩定、易于再生，克服了基于抗體和競爭性SPR 分析的限制[58]。SPR還可以對多種霉菌毒素進行同時檢測，例如利用直接競爭法構建SPR 傳感方法，同時檢測大麥中六種真菌毒素，該芯片可以重復使用60 次，對6 種霉菌毒素的交叉反應低，與LC-MS/MS 驗證結果具有很好的一致性[59]。

SPR 生物傳感器對AFs 的檢測具有實時、免標記、試劑消耗少等優勢，然而SPR 法存在設備體積大、價格昂貴等問題，限制了其實際應用。

綜上所述，本文所綜述方法的優缺點見表1。從表1中可以看出，不同的檢測方法各有優劣。儀器分析法靈敏度高，能夠進行精確的定量檢測，是國標中規定的金標方法，但存在對儀器和操作人員的要求較高、難以對大量樣本進行快速檢測等問題。為實現更方便快捷、高通量、現場檢測的要求，將免疫原理與現代分析技術相結合研究開發新型食品安全快速檢測技術，以適用于現場快速檢測是目前研究的熱點和難點。所有檢測方法中，樣品的前處理是影響檢測結果以及方法推廣使用的重要因素。當前的樣品前處理方法存在前處理復雜、耗時長、效率低的缺陷，開發快速、簡單、高效的樣品前處理方法來有效富集AFT 是未來開發檢測方法的關鍵。

表1 常見黃曲霉毒素的檢測方法Table 1 The common detection methods of aflatoxins

5 小結

AFT 毒性極強，在自然界中分布廣泛，已經嚴重威脅人類健康，對畜牧業、飼料行業、食品工業、藥業等也造成了嚴重的經濟損失。各國政府、企業、消費者以及相關專家迫切需要使用最經濟、最有效的手段來檢測食品中AFT 含量。傳統的色譜、質譜等儀器檢測方法準確率高、靈敏度高、重復性好，是國標中使用的方法，但設備昂貴、檢測程序復雜，不適于大批量樣品的檢測，難以滿足基層監管過程中快速出檢測結果的需求，不便推廣應用。隨著現代科學技術不斷發展，開發快速、簡便、特異、靈敏、低耗的AFT 檢測方法是未來發展的方向，其中比色法快速、簡便，結果可以通過肉眼直接觀察，具有現場應用潛力。熒光法具有高度特異性和靈敏性。免疫層析法制作簡單、成本低，適用于現場檢測，是快速篩選食品和原材料的有效方法。電化學法具有靈敏度高、可微型化、可再生的優點，商業化程度較高，已被證明是很有實際應用價值的檢測方法。光譜法能實現AFT 含量的現場快速檢測，其中近紅外光譜可用于AFT 的在線快速篩查，具有很強的應用潛力。以上方法有各自的優勢與特色，需要結合實際情況選取合適的檢測方法。相信隨著新技術和新材料的發展，AFT 檢測方法將在未來得到更多的發展，以滿足靈敏、簡便、智能和便攜的檢測需求。