高效液相色譜法測定番木瓜中的草酸

周 昉，馬麗艷,2*

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（北京），北京 100083；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

番木瓜（Carica papayaL.）是番木瓜科（Caricaceae）番木瓜屬植物，起源于熱帶美洲，主產(chǎn)于巴西、墨西哥、印度等國家，我國廣東、廣西、福建、臺(tái)灣等地均有栽培[1]。番木瓜營養(yǎng)較高，富含糖類、蛋白質(zhì)、粗纖維、維生素等多種營養(yǎng)成分，以及鈣、磷、鉀、鐵等無機(jī)礦質(zhì)元素外，還含有番木瓜堿、凝乳酶、木瓜蛋白酶、胡蘿卜素等多種活性物質(zhì)，具有抗炎、抑菌、護(hù)肝、降脂、抗癌等藥理活性[2-6]。番木瓜除了可加工為木瓜籽油、酒、醋和果汁等外，還因含有大量香氣成分而成為高檔日化用品的天然香料原料，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2,5,7]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)，番木瓜的果實(shí)、葉、種子（籽）、樹皮、根和花等不同部位均有特定的藥理功效[8-11]。研究表明，番木瓜不同部位對(duì)不同類型癌癥具有良好的預(yù)防或治療效果[4-6,12]。

草酸又名乙二酸，是最簡單的二元酸，廣泛存在于植物源食品、肉類以及真菌中，多以可溶態(tài)的草酸鈉、草酸鉀和難溶態(tài)的草酸鈣、草酸鐵和草酸鎂的形式存在。不同科屬植物的草酸含量差異很大，同一植物不同部位（如莖、葉和種子）的草酸含量差異也很大。從環(huán)境毒理學(xué)和食品營養(yǎng)學(xué)的角度看，草酸是一種環(huán)境毒素和抗?fàn)I養(yǎng)因子，長期食用草酸含量高的蔬菜、水果容易引發(fā)關(guān)節(jié)炎、低血鈣、膀胱結(jié)石和腎結(jié)石等疾病[13-17]。目前關(guān)于水果中草酸含量的報(bào)道主要集中在草莓、梨、蘋果、桃、橘子、菠蘿、枇杷和西瓜中，如朱巖等[18]測定了草莓中草酸的含量，其含量為0.094%～0.153%，張晉芬等[19]、郝蔚霞[20]和郭柏坤等[21]研究了不同水果中草酸的含量，草莓、水晶梨、富士蘋果、油桃中分別為1.137 mg/g、0.307 mg/g、0.358 mg/g 和0.242 mg/g[19]，橘子和蘋果為261.24 mg/kg 和469.07 mg/kg[20]，菠蘿、枇杷和西瓜為5.693 mg/kg、0.465 mg/kg 和0.182 mg/kg[21]。番木瓜中草酸含量鮮見報(bào)道，也沒有相關(guān)測定標(biāo)準(zhǔn)。為了解番木瓜中草酸的含量，給消費(fèi)者合理膳食提供參考，建立一個(gè)操作簡單快速、結(jié)果準(zhǔn)確、回收率高、檢出限低的檢測方法十分必要。目前草酸的測定方法主要有滴定法、比色法、原子吸收法、離子色譜法和色譜分析法等[17-26]。傳統(tǒng)的滴定法、比色法和原子吸收法存在操作繁瑣、耗時(shí)、重復(fù)性差、靈敏度低、回收率差等缺點(diǎn)，而色譜法靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡便快捷，檢測限和回收率等指標(biāo)均優(yōu)于傳統(tǒng)方法，因此本文建立了一種用高效液相色譜法測定番木瓜中草酸的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

番木瓜，購自超市和農(nóng)貿(mào)市場。

甲醇，色譜純，購自北京百靈威科技有限公司；辛醇、磷酸、氫氧化鈉，色譜純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260 高效液相色譜儀（紫外檢測器），安捷倫科技有限公司；IKA T25 高速組織勻漿機(jī)，北京德泉興業(yè)商貿(mào)有限公司；MilliQ 超純水機(jī)，北京德泉興業(yè)商貿(mào)有限公司；HC-3018 離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；pH 計(jì)，上海精密科學(xué)儀器廠。

1.3 提取

稱取木瓜鮮樣10.00 g（精確到0.01 g）于200 mL 高腳燒杯中，加入70 mL 0.2%磷酸水溶液（以下簡稱磷酸溶液），并加入1～2 滴辛醇，于8000r/min 下勻漿提取2min，將提取液轉(zhuǎn)入100 mL 容量瓶中，再用20 mL 磷酸溶液少量多次洗滌高腳燒杯，洗滌液全部轉(zhuǎn)入100 mL 容量瓶中，定容，搖勻。取25 mL 處理后的樣品液于50 mL 離心管中，9 000 r/min 離心5 min，取上清液待凈化。

準(zhǔn)確移取5 mL 上清液，用1 mol/L NaOH 溶液調(diào)pH至6.0～6.5，轉(zhuǎn)至事先用5 mL 甲醇和5 mL 水預(yù)活化的SAX 固相萃取柱中，控制流速在1～2 mL/min，棄去流出液。用5 mL 水淋洗凈化柱，再用8 mL、2%磷酸-甲醇溶液洗脫，控制流速在1～2 mL/min，收集洗脫液于100 mL雞心瓶中，在45 ℃下減壓蒸發(fā)至近干，用磷酸溶液溶解殘?jiān)D(zhuǎn)入5 mL 容量瓶中定容，過0.22 μm 濾膜，待測定。

1.4 色譜條件

色譜柱：Waters symmetry C18 柱（4.6 mm×250 mm、5 μm）；流動(dòng)相：A 為0.2%磷酸水溶液；B 為甲醇；梯度洗脫程序?yàn)?% B 保持8 min，9 min 變?yōu)?0% B，保持5 min，15 min 變?yōu)?%B，保持15 min；檢測波長：210 nm；柱溫：30 ℃；流速：0.7 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

1.5 方法學(xué)驗(yàn)證

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取草酸標(biāo)準(zhǔn)品100.0 mg，加水溶解并定容至100 mL，配置成濃度為1 000 μg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。取1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用水定容至10 mL，配成濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液。準(zhǔn)確吸取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)中間液，配制成濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.5.2 檢出限與定量限

對(duì)樣品溶液稀釋，按3 倍信噪比（S/N）和10 倍信噪比（S/N）計(jì)算檢出限和定量限，并通過添加回收實(shí)驗(yàn)確定方法的定量限。

1.5.3 回收率和精密度

稱取樣品10.00 g，加入草酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使加標(biāo)濃度分別為10.0、50.0、100.0 mg/kg，按所建立的方法進(jìn)行提取、測定，并計(jì)算樣品的回收率。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有樣品處理至少重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示，采用Excel 2013 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖，并做顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 番木瓜中草酸提取方法的確定

2.1.1 提取溶液的優(yōu)化

植物體內(nèi)的草酸主要以游離態(tài)形式存在，通過比較國內(nèi)外文獻(xiàn)，實(shí)驗(yàn)選擇了水[20]、0.5 mol/L HCl 溶液[17]、80%乙醇水溶液和0.2%磷酸水溶液4 種溶液作為提取溶液進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見表1。

從表1 可以看出，以水、0.5 mol/L HCl 溶液、80%乙醇為提取溶劑時(shí)，草酸含量無明顯差異；以0.2%磷酸水溶液作為提取溶劑時(shí)，提取效率最高，因此實(shí)驗(yàn)選用0.2%磷酸水溶液作為提取溶劑。

2.1.2 提取方式的優(yōu)化

以0.2%磷酸水溶液作為提取溶劑，比較了渦旋提取、超聲提取、振蕩提取、勻漿提取4 種提取方式的提取效果，結(jié)果見圖1。

圖1 不同提取方式對(duì)番木瓜中草酸提取效果的影響Fig.1 Effect of extraction methods on the extraction efficiency of oxalic acid from papaya

如圖1 所示，渦旋、超聲和振蕩三種提取方式的提取效果無明顯差異，但均與勻漿提取有明顯差異，勻漿提取的效果最高。因此本實(shí)驗(yàn)選用勻漿提取作為提取方式，提取時(shí)為避免泡沫過多，可在提取前加幾滴辛醇。

2.1.3 提取時(shí)間的優(yōu)化

以0.2%磷酸水溶液為提取液，料液比為1∶5，采用勻漿提取方式，比較不同提取時(shí)間（1、2、3、4 min）的提取效果，結(jié)果見圖2。

圖2 不同提取時(shí)間對(duì)番木瓜中草酸提取效果的影響Fig.2 Effect of different extraction time on oxalic acid extraction from papaya

如圖2 所示，提取1 min 時(shí)，草酸的含量最低，與其他提取時(shí)間無明顯差異，提取時(shí)間為2、3、4 min 時(shí)，不同時(shí)間點(diǎn)的提取效果無明顯差異。因此，確定實(shí)驗(yàn)提取時(shí)間為2 min。

2.1.4 料液比的優(yōu)化

以0.2%磷酸水溶液為提取液，采用勻漿提取2 min的方式，分別比較了不同料液比（1∶4、1∶5、1∶6、1∶7和1∶8）對(duì)番木瓜中草酸提取效率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 不同料液比對(duì)番木瓜中草酸提取效果的影響Fig.3 Effect of liquid-to-solid ratio on oxalic acid extraction from papaya

如圖3 所示，當(dāng)料液比為1∶4、1∶5、1∶6 和1∶7時(shí)，隨著料液比的增加，樣品的提取效率逐漸增加，當(dāng)料液比提高至1∶8 時(shí)，樣品提取效率與料液比為1∶7 時(shí)稍有減少，表明料液比達(dá)到1∶7 就能將樣品中的草酸提取完全，洗滌更充分，樣品損失更小，因此確定料液比為1∶7。

2.1.5 凈化條件的優(yōu)化

草酸分子的最大吸收波長在紫外區(qū)，很多化合物在紫外區(qū)有吸收，如樣品提取后直接上機(jī)分析，會(huì)干擾草酸的測定，不能準(zhǔn)確積分。為了減少基質(zhì)對(duì)檢測的影響，提高草酸的響應(yīng)值，實(shí)驗(yàn)采用固相萃取柱（SPE）進(jìn)行凈化處理。根據(jù)草酸的性質(zhì)，實(shí)驗(yàn)選擇了強(qiáng)陰離子交換柱SAX，并對(duì)SAX 的凈化過程進(jìn)行了優(yōu)化。

（1）上柱液pH 值的優(yōu)化

用NaOH 將上柱液的pH 調(diào)至3.0～8.0 后進(jìn)行凈化，分析結(jié)果見圖4。

由圖4 可以看出，上柱液pH 值在4.0 和6.0～6.5 左右時(shí)草酸的含量較高。SAX 柱為強(qiáng)陰離子交換柱，為使化合物最大程度離子化，樣品基質(zhì)的pH 應(yīng)該高于該化合物的pKa 至少兩個(gè)pH 單位。草酸屬于二元酸，解離常數(shù)分別為pKa1=1.23 和pKa2=4.19，因此在pH 為4.0 和pH 為6.0～6.5 時(shí)上樣效果最好。為保障草酸分子的充分解離及操作的可行性，實(shí)驗(yàn)中上柱液的pH 值控制在6.0～6.5。

圖4 上樣液pH 對(duì)番木瓜中草酸提取效果的影響Fig.4 Effects of pH of the solution on oxalic acid extraction from papaya

（2）洗脫液的優(yōu)化

用離子交換柱凈化時(shí)，洗脫液的pH 對(duì)柱回收影響較大。實(shí)驗(yàn)用加標(biāo)回收的方式進(jìn)行，提取液上柱后，用5 mL水淋洗，再分別以1.5%、1.8%、2.0%、2.2%磷酸-甲醇溶液作為洗脫液洗脫，洗脫體積為10 mL。經(jīng)對(duì)比，2.0%磷酸-甲醇溶液作為洗脫液時(shí)回收率最高，因此確定2.0%磷酸-甲醇溶液作為洗脫液。

（3）洗脫體積的優(yōu)化

用0.2%磷酸提取液配制10 μg/mL 標(biāo)液草酸標(biāo)液100 mL，取5 mL 用1 mol/L NaOH 調(diào)至pH 6.0～6.5，加入活化后的SAX 柱上，用5 mL 水作淋洗液，以2.0%磷酸-甲醇溶液作為洗脫液，洗脫體積分別為5、6、7、8、9、10 mL，洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干后定容至5 mL，過膜測定，比較洗脫液體積對(duì)柱回收的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 洗脫液體積對(duì)回收率的影響Fig.5 Effects of elution volume on recoveries

由圖5 可以看出，隨著洗脫體積的增加，柱回收先增加再降低，洗脫液用量在6～9 mL 之間時(shí)，柱回收率都在85%以上，繼續(xù)增加到10 mL 時(shí)，柱回收率反而明顯下降，而在8 mL 時(shí)柱回收率最好，因此實(shí)驗(yàn)選擇用8 mL 2.0%磷酸-甲醇溶液作為洗脫液。提取液經(jīng)過SAX 柱凈化后，明顯地降低了基質(zhì)對(duì)樣品的干擾（見圖6），提高了檢測方法的準(zhǔn)確性。

圖6 凈化前后樣品色譜圖Fig.6 Chromatograms of samples before and after purification

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 檢測波長的選擇

對(duì)濃度為100 μg/mL 的草酸溶液進(jìn)行紫外光譜掃描，發(fā)現(xiàn)最大波長出現(xiàn)在200 nm 處，但是在200 nm 時(shí)流動(dòng)相基線波動(dòng)較大，影響檢測的靈敏度，而把檢測波長調(diào)整為210 nm 時(shí)，基線平穩(wěn)且草酸響應(yīng)值高，更利于草酸的檢測，因此選擇210 nm 作為檢測波長。

2.2.2 流動(dòng)相的選擇

實(shí)驗(yàn)比較了0.5%KH2PO4-0.5 mmol/L 四丁基硫酸氫銨水溶液、0.2%磷酸二氫銨溶液、0.2%磷酸水溶液三種流動(dòng)相體系對(duì)草酸響應(yīng)值及分離效果的影響。0.5%KH2PO4-0.5 mmol/L 四丁基硫酸氫銨的水溶液做流動(dòng)相時(shí)，由于引入了離子對(duì)試劑，增加了色譜柱平衡時(shí)間，同時(shí)可能會(huì)與色譜柱填料中的基團(tuán)結(jié)合而導(dǎo)致對(duì)其他化合物造成影響，且對(duì)草酸的分離效果并無明顯改善。而用0.2%磷酸水溶液與0.2%磷酸二氫銨溶液為流動(dòng)相時(shí)，分離效果相當(dāng)，考慮用磷酸配制流動(dòng)相更為簡便，因此選擇0.2%磷酸水溶液作為流動(dòng)相。

2.2.3 流動(dòng)相pH 值的選擇

由于草酸在C18 柱上不易保留，出峰時(shí)間極短，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，偏酸性的流動(dòng)相能夠適度增加草酸在色譜柱的保留，延長出峰時(shí)間。實(shí)驗(yàn)比較了0.1%磷酸水溶液（pH 2.2）、0.2%磷酸水溶液（pH 2.0）、1.0 %磷酸水溶液（pH 1.5）、2.2%磷酸水溶液（pH 1.0）作為流動(dòng)相時(shí)對(duì)草酸的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相pH 值為2.2 和1.0 時(shí)，草酸不能與雜質(zhì)峰分離；流動(dòng)相pH 值為1.5 和2.0 時(shí)，草酸能從雜質(zhì)峰中分離出來，其中流動(dòng)相pH 值為1.5 時(shí)分離效果最佳，但考慮到普通C18 柱對(duì)酸的耐受pH 值在2.0 以上，長期使用低pH 流動(dòng)相，色譜柱難以長時(shí)間耐受，會(huì)縮短色譜柱使用壽命，因此最終選用pH 2.0 的0.2%磷酸水溶液作為流動(dòng)相，既可以滿足草酸分離的要求，又可最大程度對(duì)色譜柱進(jìn)行保護(hù)。

2.3 線性范圍及檢出限

將標(biāo)準(zhǔn)工作液注入高效液相色譜儀中進(jìn)行分析，以草酸濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明在0.5～50.0 μg/mL 范圍內(nèi)線性良好，線性方程為y=20.349x-8.558 6，R2=0.999 7。以3 倍信噪比計(jì)算，草酸的檢出限為0.3 mg/kg；以10 倍信噪比計(jì)算，草酸的定量限為1.0 mg/kg。

2.4 回收率和精密度

以某一番木瓜樣品為空白，分別添加草酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，使添加量分別為10.0、50.0、100.0 mg/kg，按實(shí)驗(yàn)建立的方法進(jìn)行提取、測定，番木瓜樣品回收率和精密度測定結(jié)果見表2（見上頁）。從表中可以看出，該方法的回收率為88.6%～90.5%，精密度為3.1%～5.8%。

表2 番木瓜樣品回收率和精密度（n=6）Table 2 The recovery and precision of papaya samples(n=6)

2.5 番木瓜中草酸含量測定

關(guān)于番木瓜中草酸含量的測定目前鮮有報(bào)道。實(shí)驗(yàn)對(duì)購自市場上的12 個(gè)番木瓜樣品進(jìn)行了測定，草酸的含量在17.2～69.0 mg/kg 之間，不同番木瓜樣品的草酸含量不同，這可能與番木瓜的品種、成熟度及貯藏時(shí)間有關(guān)。為了解番木瓜不同部位草酸的含量，實(shí)驗(yàn)分別選取番木瓜的皮、外層肉（從皮內(nèi)側(cè)到距皮1.5 cm 處果肉）、內(nèi)層肉（從距皮1.5 cm 至果核內(nèi)部的果肉）和籽等4 個(gè)部位進(jìn)行了測定，結(jié)果見表3。

表3 番木瓜不同部位草酸含量（n=3）Table 3 Content of oxalic acid in different part of papaya(n=3)

從表3 中可以看出，番木瓜中各部位的草酸含量總體呈現(xiàn)從外到內(nèi)（即從表皮到果肉再到籽）逐漸增加的趨勢(shì)。其中皮含量最低，外層肉和內(nèi)層肉均比皮稍高，但兩者差別不大，而籽中草酸的含量最高，約為皮含量的10 倍。通常情況下，消費(fèi)者只食用番木瓜果肉部分，果肉中草酸的含量相對(duì)較低，正常食用番木瓜不會(huì)因攝入草酸過量對(duì)身體產(chǎn)生影響。

3 結(jié)論

本方法以番木瓜為材料，建立并優(yōu)化了番木瓜中草酸的高效液相色譜檢測方法。最終確定以0.2%磷酸水溶液為提取溶劑，料液比為1∶7，采用勻漿提取方式輔助提取效果最優(yōu)。番木瓜提取液經(jīng)SAX 柱凈化后可明顯降低基質(zhì)干擾，提高草酸定量的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，不同番木瓜樣品中草酸含量為17.2～69.0 mg/kg，籽中草酸含量最高，其次為果肉，而果皮中草酸含量最低，正常食用番木瓜不會(huì)對(duì)消費(fèi)者健康產(chǎn)生影響。