高效液相色譜法測定化妝品中甲基氯異噻唑啉酮的不確定度分析

程紅新 陸軍

【摘要】 本文對高效液相色譜法測定化妝品中甲基氯異噻唑啉酮含量進行了不確定度分析，計算出樣品含量為0.000991%時的合成不確定度和擴展不確定度。

【關鍵詞】 不確定度;甲基氯異噻唑啉酮;化妝品;高效液相色譜法

【DOI編碼】 10.3969/j.issn.1674-4977.2021.04.017

Analysis of Uncertainty in Determination of 5-Chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one in Cosmetic

CHENG Hong-xin，LU Jun

（Liaoning Institute for Drug Control，Shenyang 110036，China）

Abstract： The uncertainty of determination of 5-Chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one in cosmetic using high performance liquid chromatography was analyzed in this paper. When the 5-Chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one content in the sample was 0.000991%，the combined uncertainty and extended uncertainty were calculated.

Key words： uncertainty;5-Chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one;cosmetic;high performance liquid chromatography

化妝品中因含有大量的水分、營養物質，易滋生細菌、真菌等微生物，故一般使用防腐劑，確保其使用安全。甲基氯異噻唑啉酮（5-Chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one，簡稱MCI）與甲基異噻唑啉酮（2-methylisothiazol，簡稱MI）的混合物作為一種防腐劑，被廣泛應用在淋洗類化妝品中，商品名為卡松。《化妝品安全技術規范》（2015年版）準用防腐劑列表中卡松最大允許使用濃度僅為0.0015%，其中這兩種成分的質量比約為m（MCI）：m（MI）=3：1，并常含有少許氯化鎂及硝酸鎂作為穩定劑。近年來，對化妝品督抽驗時，發現部分化妝品防腐劑卡松的添加量在規定限值的上限附近。因此，測量其不確定度對判定產品是否合格影響顯得尤為重要。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

L-2000型高效液相色譜儀（帶有二極管陣列檢測器，日立公司）;

XS105 DU 電子天平（d=0.01 mg，METTLER TOLEDO）;

BECKMAN Avanti J-E型離心機;

AS3120A型超聲波清洗儀;

Millipore-Q超純水器（美國Millipore公司）;

PHS-3C酸度計（上海精科）。

1.1.2 試劑

甲基氯異噻唑啉酮：純度98.4%（德國Dr.Ehrenstorfer GmbH）;甲醇，色譜純;磷酸氫二鈉，優級純;乙腈，色譜純;氯化十六烷基三甲胺，優級純;0.45 μm微孔濾膜（美國Millipore公司）

1.2 環境條件

溫度：（20±5） ℃，相對濕度：≤70%。

1.3 實驗方法

樣品中的甲基氯異噻唑啉酮組分經甲醇提取，用高效液相色譜儀分析，以標準曲線法計算含量。

1.3.1 樣品處理

稱取樣品1 g（精確到0.0001 g）至具塞比色管中，加甲醇至10 mL，振搖，超聲提取15 min，離心，經0.45 μm濾膜過濾，濾液作為待測溶液，供液相色譜測定，進樣量5 μL。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX C18柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）;流動相：0.05 mol/L磷酸二氫鈉+甲醇+乙腈（50+35+15），加氯化十六烷基三甲胺至最終濃度為0.002 mol/L，并用磷酸調pH至3.5;流速：1.0mL/min;檢測波長：280 nm;柱溫：30 ℃。

2 結果與分析

2.1 數學模型

樣品中甲基氯異噻唑啉酮含量的計算公式為：

[ω=C×V×10-4m×100%] （1）

式中：[ω]——樣品中甲基氯異噻唑啉酮含量，%;

C——從標準曲線上得到待測組分的質量濃度，μg/mL;

V——樣品定容體積，mL;

m——樣品取樣量，g。

2.2 測量不確定度的來源

根據甲基氯異噻唑啉酮檢測方法，分析不確定度的主要來源有：樣品稱量引入的不確定度，樣品定容引入的不確定度，待測液中甲基氯異噻唑啉酮的濃度引入的不確定度，重復性測量引入的不確定度。

2.3 測量不確定度分量的計算

2.3.1 樣品稱量引入的不確定度

本方法稱樣量為1.000 g，測定使用電子分析天平準確至0.1 mg，根據電子分析天平校準證書，在50 g量程范圍內，該天平的最大允差是0.2 mg，按均勻分布k=[3]計算則樣品稱量引起的相對不確定度為：[ur（樣m）=0.2k=0.23=0.115 mg]，則樣品稱量引入的不確定度為：[ur（樣m）=0.1151000=0.000115]，其他因素引入的不確定度較小，可以忽略不計。

2.3.2 樣品定容體積引入度的不確定度

樣品定容，10 mL具塞比色管定容體積引入的不確定度是由量器校準和溶劑與量器校準時的溫差引入的。經查JJG 11-1987標準，10 mLA級具塞比色管容量允差為±0.1 mL，取均勻分布，k=[3]，則[ur（樣V1）=0.1k×10=0.13×10=0.00577];實驗室的溫度在20±5 ℃，溫度變化引起的不確定度可通過甲醇體積膨脹系數（1.2×10-3 ℃-1）與溫度變化來進行計算，取均勻分布k=[3]，不確定度為：[ur（樣V2）=0.0012×53=0.00346];樣品定容體積引入的相對不確定度是：[ur樣V=（u2r樣V1+u2r樣V2=0.00673]。

2.3.3 待測試樣甲基氯異噻唑啉酮濃度引入的不確定度

標準物質純度引入的不確定度;標準物質稱量引入的不確定度;標準曲線配制引入的不確定度;標準曲線擬合引入的不確定度。

2.3.3.1 標準物質純度引入的不確定度ur（標p）

從標準物質證書查得甲基氯異噻唑啉酮的擴展不確定度，[Ur=0.31%]（k=2），[ur標p=0.00155]。

2.3.3.2 標準物質稱量引入的不確定度ur（標m）

標準物質稱量采用精度d=0.01 mg的電子天平，稱取標準品甲基氯異噻唑啉酮20.74 mg。根據儀器計量檢定證書結果，在5 g量程范圍內，天平示值誤差為0.01 mg，則其區間半峰寬度為0.01 mg，按均勻分布k=[3]計算，則[u（樣m）=0.01k=0.013=0.00577] mg。則標準物質稱量引入的不確定度[ur（標m）=0.00577/20.74=0.000278]。

2.3.3.3 標準曲線配制引入的不確定度ur（標v）

標準曲線配制引入的不確定度主要來源于量具誤差和環境溫度。

標準曲線配制過程：準確稱取適量甲基氯異噻唑啉酮標準品20.74 mg至50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，混勻，即得甲基氯異噻唑啉酮標準儲備溶液;用1 mL移液器吸取甲基氯異噻唑啉酮標準儲備溶液1 mL至50 mL容量瓶中，用甲醇定容混勻，得甲基氯異噻唑啉酮標準使用溶液。用1 mL移液器分別吸取甲基氯異噻唑啉酮標準使用溶液0.5 mL、1 mL，用5 mL移液器分別吸取甲基氯異噻唑啉酮標準使用溶液2 mL、4 mL、5 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇定容混勻，得系列濃度標準溶液。

經查甲醇體積膨脹系數為1.20×10-3 ℃-1，根據移液器和常用玻璃量器檢定規程規定的最大允許誤差，按照下面公式計算其相對標準不確定度。

[ur（V校準）=a校準k×V] （2）

[ur（V溫度）=a溫度k×V] （3）

式中：[a校準]——量具校準引起的體積偏差;

[a溫度]——溫度波動引起的體積偏差，等于溫度波動×體積膨脹系數×使用體積;

K——[3]（按均勻分布計算）;

V——標準溶液體積。

標準曲線配制引入的不確定度見表1。

標準曲線配制引入相對標準不確定度為：

[ur標V=0.003652×5+0.003512×2+0.006732+0.006732×2+0.004512+0.004892+0.004892=0.0172]

2.3.3.4 標準曲線擬合引入的不確定度ur（[x]）

對標準系列溶液中的每一個濃度測定2次，得到相應的響應值，用最小二乘法擬合，擬合結果見表2。

[u（x）=Syb1p+1m+（x-c0）2i=1n（ci-c0）2] （4）

[SXX=i=1n（ci-c0）2] （5）

[Sy=i=1n[yi-（α+bci）]2n-2] （6）

式中：S[y]——峰面積的剩余標準偏差;

[yi]——各個標準溶液濃度對應的儀器響應值;

[α]——校準曲線的截距;

b——校準曲線的斜率;

m——曲線點數，每個點測量2遍，m=2×5=10;

ci——校準曲線系列標準工作溶液的濃度。

校準曲線擬合的相對標準不確定度為：

[u（x）=Syb1p+1m+（x-c0）2i=1n（ci-c0）2=847.54477612+110+0.991-1.22421.667=0.0120]

其中，m=n×重復次數（n為標準系列點數5，重復次數2次）;p為待測樣品的重復測定次數，p=2;[c0]為標準系列各點濃度的平均值=1.224 μg/mL;[x]為待測樣品濃度的平均值（0.991 μg/mL），由式（6）計算得[Sy=847.5]，由式（4）計算得標準曲線擬合引入的標準不確定度為[u（x）=0.0120]，由標準曲線擬合引入的相對標準不確定度為：[ur（x）0.0120/0.991=0.0121]。

2.3.4 液相色譜儀引入的不確定度u（儀）

由高效液相色譜儀校準證書查得：定量測量重復性RSD=0.60%，則相對擴展不確定度為0.60%，按均勻分布計算[k=3]，[ur（儀）=0.0063=0.00346]。

2.3.5 重復性引入的相對標準不確定度

將同一樣品重復測定6次，得到相應的峰面積及濃度，數據見表3。

應用標準偏差公式[sc=i=1nci-c2n-1]計算，[sc=0.00179]。

則被測樣品引入的相對標準不確定度為：[ur（樣ω）=Scx=0.001790.990=0.00181]。

2.4 相對標準不確定度的合成

測量模型中輸入量估計值相互獨立，將各項不確定度的分量進行合成，合成標準不確定度為：

[ur（ω）=u2r樣m+u2r樣v+u2r標p+u2r標m+u2r標v+u2rlx+u2r儀+u2r樣ω=]

[0.0001152+0.006732+0.001552+0.0002782+0.01722+0.01212+0.003462+0.001812=0.0225]

2.5 擴展不確定度

該測量誤差分布屬正態分布，在95%置信水平，包含因子k=2，則甲基氯異噻唑啉酮的擴展不確定度[Ur（ω）=k×ur（ω）=2×0.0225=0.0450]，[U（ω）=ωUr（ω）= 0.000991%×0.0450= 0.000045%]。

2.6 甲基氯異噻唑啉酮檢驗結果

甲基氯異噻唑啉酮含量為：0.000991%±0.000045%，k=2。

3 結語

由以上評定結果可知，標準曲線配制和標準曲線擬合對檢測結果影響最大。用高效液相色譜法測定化妝品中甲基氯異噻唑啉酮含量，當樣品中甲基氯異噻唑啉酮為0.000991%時，擴展不確定度為0.000045%。根據《化妝品安全技術規范》（2015年版）化妝品準用防腐劑（表4）規定，甲基氯異噻唑啉酮和甲基異噻唑啉酮與氯化鎂及硝酸鎂的混合物（甲基氯異噻唑啉酮：甲基異噻唑啉酮為3∶1）最大允許添加濃度為0.0015%，計算甲基氯異噻唑啉酮最大允許添加濃度僅為0.001125%。

【參考文獻】

[1]??? 莊藝協，吳思敏.高效液相色譜法測定化妝品中苯甲醇的不確定評估[J].廣東化工，2017（10）：215-216.

[2]??? 蘇哲，林慶斌，王鋼力，等.化妝品防腐劑甲基異噻唑啉酮的安全風險評估及技術法規要求最新進展[J].香料香精化妝品，2019（1）：78-82.

[3]??? 化妝品安全技術規范[S].

[4]??? 測量不確定度評定與表示：JJF 1059.1-2012[S].

[5]??? 常用玻璃量器：JJG 196-2006[S].

[6]??? 移液器：JJG 646-2006[S].

[7]??? 專用玻璃量器：JJG 10-2005[S].

【作者簡介】

程紅新（1966-），女，高級工程師，學士，研究方向為食品化妝品檢測，手機號碼：13252821380，E-mail：sychx66@163.com。

陸軍（1968-），女，教授級高級工程師，學士，研究方向為食品化妝品檢測。