聚苯胺/聚乳酸復合納米纖維表面形貌對生物相容性的影響

劉榮濤，張詩洋，黃興文，朋小康，閔永剛，2

（1廣東工業大學材料與能源學院，廣東廣州 510006；2東莞華南設計創新院，廣東東莞 523808）

聚苯胺（PANI）因為良好的加工性、優良的導電性和生物相容性被認為是組織工程和再生醫學的潛在候選材料[1-3]。許多研究表明電刺激下PANI能夠調節細胞附著、增殖、遷移和分化[4-6]。但PANI在體液環境下（pH=7.4）會發生脫摻雜，使其導電性極大地減弱[7]，不能很好地發揮自身的電活性優勢，從而使得PANI基可降解納米纖維在促進細胞增殖分化方面的應用受到一定限制。然而，大量文獻表明，無外加電場下PANI基導電可降解納米纖維仍具有良好的生物相容性[8-9]，并且不同類型酸摻雜劑得到的PANI基導電可降解納米纖維增強生物相容性效果也表現出差異[10-11]，這種現象可能是由不同PANI形貌對細胞活性的影響產生的。

本文將靜電紡絲法得到的聚乳酸納米纖維等離子體處理后，選擇酒石酸作為PANI原位氧化聚合過程中的酸摻雜劑，考察酒石酸與苯胺單體不同摩爾比下PANI/PLA復合納米纖維生物相容性表現。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

苯胺（AN）、過硫酸銨（APS）、DL-酒石酸，Sigma Aldrich公司；聚乳酸（PLA，Mw=60000），上海阿拉丁試劑有限公司；N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷（DCM），天津市富宇精細化工有限公司；磷酸緩沖液（PBS），Biosharp，北京Labgic科技公司；低糖DMEM培養基，Gibco，美國Thermo Scientific公司；胎牛血清（FBS）、堿基磷酸酶（ALP），中國碧云天生物技術公司；MTT噻唑藍，德國Bioforx公司；FITC標記的鬼筆環肽，北京Solarbio科技公司。

靜電紡絲機，DP-30型，天津云帆科技公司；等離子體清洗機，PCE-6型，美國MTI公司；傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR），Niconlet iS50型，美國Thermo Scientific公司；場發射掃描電子顯微鏡（FESEM），Hitachi-SU8220型，日本日立公司；接觸角分析儀，OCA 15 plus型，德國；酶標儀，Synergy HTX型，美國BioTek公司；共聚焦顯微鏡，A1型，日本尼康公司。

1.2 PLA靜電紡絲納米纖維制備

一定質量的PLA顆粒加入在DCM和DMF（質量比為7∶3）混合液中，攪拌直到溶解，得到質量分數為10%的PLA混合溶液。將PLA溶液裝入注射器中，連接高壓電源，設置電壓15kV、距離15cm。

1.3 酒石酸摻雜聚苯胺/聚乳酸復合納米纖維的制備

將酒石酸與苯胺單體分別按照1∶1、1∶2和1∶4的摩爾比溶解在40mL去離子水中，冰浴下攪拌1h，將等離子體（plasma）處理的PLA納米纖維浸入在上述混合溶液中。然后將與苯胺相同物質的量的APS溶解在10mL去離子水中，冰浴下攪拌30min充分溶解后，逐滴加入到酒石酸與苯胺的混合溶液中，持續攪拌反應24h，取出纖維薄膜后無水乙醇清洗，40℃真空干燥8h。將酒石酸與苯胺單體摩爾比為1∶1、1∶2和1∶4得到的聚苯胺記為PT1、PT2和PT4，對應得到的PANI/PLA復合納米纖維標記為PLT1、PLT2和PLT4。靜電紡絲納米纖維和PANI/PLA復合納米纖維的制備過程見圖1。

圖1 PLA靜電紡絲納米纖維和PANI/PLA復合納米纖維制備

1.4 PANI/PLA復合納米纖維支架的表征

通過場發射掃描電子顯微鏡（FESEM）和透射電子顯微鏡（TEM）觀察不同摩爾比酒石酸摻雜的PANI/PLA復合納米纖維表面形貌和結構。為了確定PANI完全負載在PLA納米纖維上，對制備的PANI/PLA復合納米纖維進行FTIR測量。通過接觸角實驗評價PANI/PLA復合納米纖維支架的潤濕性。

1.5 PANI/PLA復合納米纖維生物相容性表征

采用人骨肉瘤細胞（HOS，購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫）活性作為生物相容性指標。HOS細胞在含有10%FBS、100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素的低糖DMEM培養基中，于37℃、5%CO2的細胞培養箱中孵育。細胞增殖試驗開始之前需要將HOS細胞接種在PANI/PLA復合納米纖維上。將PANI/PLA復合納米纖維放入96孔板中，完全覆蓋培養板底部，紫外殺菌30min，以3×104每孔的密度接種到PANI/PLA復合納米纖維上，同時設置空白組和對照組，孵育1天、3天、5天，每隔2天更換培養基。

用細胞增殖檢測（MTT）法檢測PANI/PLA復合納米纖維細胞活性。堿基磷酸酶活性（ALP）采用堿性磷酸酶檢測試劑盒方法測定。細胞熒光免疫染色實驗用FITC標記的鬼筆環肽染色細胞膜外肌動蛋白，使用共聚焦顯微鏡觀察細胞染色情況。

2 結果與討論

2.1 PANI與PANI/PLA復合納米纖維性能

2.1.1 表面形貌

圖2為不同酒石酸和苯胺摩爾比得到的PANI和對應PANI/PLA復合納米纖維表面形貌。從圖2(a)可以看出，酒石酸和苯胺摩爾比為1∶1時的PT1形貌為納米顆粒；摩爾比為1∶2時的PT2形貌主要為納米纖維；摩爾比為1∶4時PT4呈現出明顯的納米空心管狀纖維結構，表面有明顯的小毛刺。為進一步觀察PANI納米纖維的結構，通過TEM表征酒石酸和苯胺摩爾比為1∶2和1∶4得到的PANI納米結構（圖3）。從圖3可以看出，酒石酸與聚苯胺摩爾比為1∶2的聚苯胺（PLT2）為實心納米纖維，而酒石酸與聚苯胺摩爾比為1∶4的聚苯胺（PLT4）有明顯的空心管狀結構，這與SEM結果表現一致。圖2(b)所示為對應的PANI/PLA復合納米纖維SEM圖，可以看出不同酒石酸和苯胺摩爾比的PANI主要是覆蓋在PLA納米纖維表面，形貌與對應的純PANI表現一致，酒石酸摻雜的PANI/PLA復合納米纖維仍能保持良好的纖維形貌和多孔纖維結構。SEM結果表明，酒石酸摻雜的PANI成功負載在PANI/PLA復合納米纖維表面。

圖2 不同酒石酸和苯胺摩爾比的PANI形貌和對應的PANI/PLA納米纖維形貌

圖3 酒石酸與聚苯胺摩爾比為1∶2和1∶4的聚苯胺TEM圖

在酒石酸作為摻雜劑生成PANI過程中，酒石酸作為模板附著在PLA納米纖維表面，氧化劑存在下，苯胺分子在酒石酸表面聚合產生的苯胺低聚物，進而相互連接形成PANI納米纖維[12]。反應體系中酒石酸濃度過低時，不足以使苯胺低聚物相互連接，因此得到的PANI形貌多表現為納米顆粒或短棒狀[13-14]。酒石酸濃度增加，使得苯胺低聚物相互連接的過程繼續進行，生成PANI納米纖維狀和空心納米管狀結構[15]。與顆粒狀PANI相比，納米纖維狀PANI表現出更強的分子排列有序性，分子鏈規整性好，并且納米管狀結構PANI具有更大的比表面積[16-17]。

2.1.2 表面成分分析

通過FTIR說明PANI/PLA復合納米纖維表面組成，不同酒石酸和苯胺摩爾比的PANI和PANI/PLA復合納米纖維的FTIR如圖4。在純摻雜PANI的FTIR圖 譜 中[圖4(a)]，1568cm-1、1492cm-1、1298cm-1和1141cm-1的峰分別對應醌環伸縮、苯環C==C伸縮、苯環C—N伸縮和==CH伸縮[18]。在PANI/PLA復合納米纖維FTIR圖譜中[圖4(b)]，除了PANI的特征峰外，還可以看到PLA特征峰，分別為1092cm-1和1184cm-1代表的C—O伸縮振動峰，1757cm-1代表的C==O伸縮振動峰[19]。結果表明，酒石酸摻雜的PANI能夠在PLA納米纖維表面成功負載。

圖4 酒石酸與苯胺摩爾比為1∶1、1∶2和1∶4的聚苯胺及對應聚苯胺/聚乳酸復合納米纖維FTIR圖譜

2.1.3 接觸角分析

支架的潤濕性影響細胞的黏附、遷移和增殖[20-21]，通常通過材料與水的接觸角來評價。在室溫下，將50μL去離子水滴在納米纖維表面，每種納米纖維取3個樣品，取3次測試接觸角的平均值。圖5所示為水滴在1s內與納米纖維膜上的接觸角。可以看出，經過plasma處理的PANI/PLA復合納米纖維的接觸角明顯減小。對應的PLT1、PLT2和PLT4的接觸角分別為76.3°、64.3°和61.4°，與PLA接觸角為（111.2°）相比，分別降低了34.9°、46.9°和49.8°，納米顆粒狀形貌PANI的PLT1減小最少，納米纖維的PANI的PLT2和PLT4減少的較多。不同PANI形貌增加了PANI/PLA體系的表面能，納米纖維的取向結構有助于水分子的擴散，而管狀結構增加了接觸面積，使得接觸面積增加。在實際測試過程中，觀察到納米纖維初始與水接觸時，表現出不同的接觸角，與水接觸5s后，接觸角變為0°，表現出良好的親水性[22]。這是因為經plasma處理后，PLA納米纖維表面會產生親水含氧基團（如—OH、—COOH等），與酒石酸摻雜原位聚合的PANI共同作用，最終使PANI/PLA復合納米纖維完全濕潤，表現出良好的親水性[23]。

圖5 PLA納米纖維和不同酒石酸與苯胺摩爾比得到的PANI/PLA復合納米纖維表面接觸角

2.2 靜電紡絲納米纖維的生物相容性

生物支架材料除自身具有一定的力學性能和一定的降解性外，最重要的是能促進細胞在表面的黏附、生長和增殖，即要具有一定的生物相容性[24]。通過HOS在PLA和PANI/PLA復合納米纖維上細胞活性表征生物相容性，堿性磷酸酶活性的高低反映成骨細胞活性及狀態，細胞免疫熒光染色觀察細胞肌動蛋白狀態說明細胞生長黏附狀態。

圖6和圖7分別為接種在PLA和PANI/PLA復合納米纖維上的HOS細胞培養1天、3天、5天后的細胞活性和孵育7天的細胞ALP活性。可以看出，PLA和PANI/PLA復合納米纖維表面細胞活性逐漸提高，PANI/PLA復合納米纖維細胞活性和7天的ALP活性高于對照組PLA納米纖維，細胞活性和ALP活性順序為PLT4>PLT2>PLT1。從潤濕性角度分析，PANI/PLA復合納米纖維都表現出良好的親水性，因此對細胞的黏附和生長沒有影響差異。能夠影響細胞活性和ALP活性的只有酒石酸與苯胺摩爾比不同形成的不同形貌的PANI，從這點來看，納米纖維狀的PLT2和PLT4生物相容性要強于納米顆粒狀形貌的PLT1，并且具有納米空心管狀結構的PLT4表現最好。

圖6 在PLA納米纖維和PANI/PLA復合納米纖維上培養1天、3天和5天細胞活性

這是因為PLA納米纖維表面附著的PANI能夠增加體系的接觸位點和極性，更有利于細胞的黏附和生長，特別是納米纖維狀形貌的PANI具有較高的有序度和取向，更利于細胞黏附和遷移，空心管狀納米纖維結構提供了更大的接觸面積和表面能，使得細胞更傾向于在其表面黏附和生長，從而表現出更加優異的生物相容性[16,25]。細胞免疫熒光染色結果進一步證實以上結論，圖8中可以看到肌動蛋白和細胞形態在不同納米纖維表面的狀態。HOS細胞的肌動蛋白束在PLA和PANI/PLA復合納米纖維上皆表現出良好伸展狀態，細胞生長密度表現與細胞活性和ALP活性結果一致。以上結果表明，酒石酸摻雜的PANI/PLA復合納米纖維具有良好的生物相容性，不同酒石酸和苯胺摩爾比得到的PANI形貌對PANI/PLA復合納米纖維生物相容性增強表現有所不同，納米纖維狀的PANI對生物相容性的增強效果明顯優于納米顆粒狀PANI，而具有空心管狀結構的PANI對生物相容性增強作用更優。

圖8 HOS細胞在PLA納米纖維和不同酒石酸與苯胺摩爾比得到的PANI/PLA復合納米纖維表面培養24h后細胞免疫熒光染色顯微圖像

3 結論

選擇酒石酸作為PANI/PLA復合納米纖維制備過程中的酸摻雜劑，考察了不同酒石酸與苯胺單體摩爾比下PANI形貌的不同對生物相容性的影響，得到如下結論。

（1）酒石酸摻雜的PANI附著在PLA納米纖維表面，不會對靜電紡絲的多孔結構基體產生影響。

（2）PANI/PLA復合納米纖維表面親水性初始親水性因PANI形貌不同而有所區別，但5s后能夠完全潤濕。

（3）納米纖維狀的PANI對生物相容性的增強效果明顯優于納米顆粒狀PANI，而具有空心管狀結構的PANI對生物相容性增強作用更優。

選擇對pH不敏感的導電高分子，通過改變外加酸摻雜劑與單體的比例調控導電高分子形貌，在外加電場配合下，可以更好地促進細胞的生長和組織的修復，滿足在組織工程的實際需要。