柴芍六君湯對肝郁脾虛型慢性萎縮性胃炎大鼠胃黏膜細胞增殖和凋亡因子的影響

朱景茹,洪銀潔,黃婉儀,張 斐,涂文玲,楊宗保,甘慧娟*

(1.福建中醫藥大學中醫證基地,福州 350122;2.福建中醫藥大學針灸學院,福州 350122;3.廈門大學中醫系,福建 廈門 361102)

慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)是臨床常見的胃癌前期疾病,可見胃黏膜組織病理萎縮、變薄,是“炎癌轉化”的關鍵環節[1]。大量臨床研究證實,柴芍六君湯對CAG患者有顯著療效,可以確切改善胃脘部不適癥狀,逆轉病理萎縮,促進疾病向愈[2-4]。然而,柴芍六君湯防治CAG的整體調節機制尚未得到充分揭示,因此,有必要從分子生物學角度深入研究柴芍六君湯對肝郁脾虛型CAG大鼠胃黏膜細胞增殖、凋亡的影響,為中藥防治CAG、阻斷其向胃癌進展的臨床應用提供科學實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級SD大鼠,8周齡,26只,雌雄各半,體重(200±20)g,購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司[SCXK(滬)2019-0005]。大鼠群養于墊玉米芯的飼料籠中,墊料4 d更換1次,雌雄分籠飼養,控制室溫21℃~23℃,相對濕度50%,自由攝食飲水,在廈門大學動物實驗中心[SYXK(閩)2018-0009]適應性喂養7 d后進行分組實驗。本實驗經廈門大學實驗動物管理倫理委員會批準(XMULAC20190142),實驗過程嚴格遵循3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

脫氧膽酸鈉(批號:20190901,北京奧博星生物技術);25%~28%氨水(批號:C10586777,上海百舜生物科技);維酶素片(批號:20190405,樂普恒久遠藥業);HE染色試劑盒(批號:J19S11Y125305,上海源葉生物科技);逆轉錄試劑盒(批號:AJ52623A,日本TaKaRa公司);PCNA抗體(貨號:24036,美國Proteintech公司);Ag-NOR染色液(貨號:G2015,北京索萊寶科技);TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(貨號:C1088,上海碧云天生物技術);基因擴增儀、熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司);正置熒光顯微鏡(德國Carl Zeiss公司);半自動切片機(德國Leica公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 藥物制備

維酶素混懸液:給藥前用蒸餾水配制混懸液,按照大鼠是人常規劑量的6倍計算[5],給藥量為240 mg/(kg·d)。柴芍六君湯出自《醫宗金鑒》,組方:北柴胡6 g,人參9 g,白芍4.5 g,白術9 g,茯苓9 g,法半夏4.5 g,制陳皮6 g,炙甘草3 g,飲片由閩侯上街致誠醫藥商店提供,經鑒定為質量合格的中藥飲片。常規煎煮2次后混勻,濃縮成含生藥量0.51 g/mL中藥湯劑,無菌紗布過濾后分裝入瓶,4℃冰箱儲存。

1.3.2 分組、造模與處理

26只大鼠根據Excel隨機生成數字分為2組,即正常組6只和造模組20只。正常組不予處理,造模組采用復合因素造模法[6-7]建立肝郁脾虛型CAG大鼠模型:大鼠予每日現配的20 mmol/L脫氧膽酸鈉溶液和0.1%氨水溶液交替自由飲用,配合2 d足食、1 d禁食的饑飽失常法,每日夾尾激惹1 h,造模10周。造模組每5周隨機抽取1只大鼠進行造模評價,取材胃黏膜組織觀察形態色澤、皺壁厚薄及病理形態,結合大便性狀、毛發色澤、精神狀況及強迫游泳實驗等結果綜合判斷。將成模大鼠隨機分為3組,即模型組、維酶素組和柴芍六君湯組,每組6只。柴芍六君湯組予柴芍六君湯5.1 g/(kg·d),維酶素組予維酶素混懸液240 mg/(kg·d),正常組和模型組予滅菌飲用水,按體重10 mL/kg灌胃,干預4周后取材。修剪胃黏膜組織周邊多余脂肪,生理鹽水漂洗后觀察胃黏膜形態色澤、皺壁厚薄,取胃竇部固定于4%多聚甲醛溶液中24 h,胃體部凍存-80℃冰箱備用。

1.3.3 胃黏膜組織形態學觀察

胃黏膜組織經流水沖洗6 h后,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,浸蠟,石蠟包埋后切片,切片厚度約4μm,63℃烘片機烤片4 h,脫蠟后行HE染色,顯微鏡觀察胃黏膜組織病理結構變化。

1.3.4 qPCR法檢測胃黏膜凋亡基因c-myc和p53 mRNA水平

引物序列5’-3’:c-myc:F-TCTCCGTCCTATG TTGCG,R-GGCTGGTGCTGTCTTTGC;p53:F-GCGTT GCTCGATGGTGA,R-CAGCGTGATGATGGTAAGG;βactin:F-CTGGCTCCTAGCACCATGAA,R-AAAACGC AGCTCAGTAACAGTC。引物由上海百賽生物技術有限公司設計合成。TRIzol法提取胃黏膜組織總RNA并進行濃度測試,逆轉錄成cDNA后按照說明書配制反應體系,放入熒光定量PCR儀進行qPCR反應,記錄各組CT值,采用2-△△Ct計算方法進行統計分析。

1.3.5 IHC法檢測PCNA和Ag-NOR含量

胃黏膜組織切片、脫蠟、水化后進行熱抗原修復,10%山羊血清室溫封閉1 h,一抗37℃孵育1 h,PBS漂洗4次,加入二抗37℃孵育1 h,PBS漂洗10次,DAB顯色,蘇木素復染后流水沖洗30 min,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片后顯微鏡觀察。運用軟件Image J v1.8.0進行平均光密度(IOD/area)分析。

1.3.6 TUNEL法檢測胃黏膜細胞凋亡指數

胃黏膜組織脫蠟,蛋白酶K消化,按照說明書配制TUNEL試劑,加檢測液37℃避光孵育1 h,PBS漂洗3次,用抗熒光淬滅的封片液封片,綠色熒光發射波長為515~565 nm,顯微鏡下計數陽性細胞個數。

1.4 統計學方法

運用軟件SPSS 23.0進行統計分析,計量資料屬正態分布用平均數±標準差(±s)表示,反之則用M(P25,P75)表示。多組比較符合正態分布采用單因素方差分析,組間比較不符合正態分布用秩和檢驗。按α=0.05檢驗水準,以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 模型評價

正常組大鼠活潑喜動,好奇心強,毛發潔白光澤,大便色褐且無明顯臭味;胃黏膜組織形態正常,上皮細胞完整無缺損,固有腺體整齊規則。造模組大鼠毛發淡黃質硬,神態疲倦,大便味臭,溏結不調;胃黏膜組織固有腺體萎縮,炎性細胞浸潤,主細胞和壁細胞減少;強迫游泳靜止時間較正常組明顯延長(P＜0.01)。見表1。

表1 兩組大鼠強迫游泳靜止時間比較M(P25,P75)Table 1 Comparison of static time in forced swimming of rats in two groups M(P25,P75)

2.2 大鼠一般情況比較

正常組大鼠毛發潔白光澤,活躍好奇,精力充沛,灌胃抵抗較明顯;模型組大鼠毛發蓬松無光澤,色淡黃質硬,神態仍稍疲憊,偶見安靜扎堆,反應較遲鈍,灌胃時溫順不抵抗;維酶素組大鼠毛發蓬松,少有光澤,活潑警惕,灌胃偶有抵抗;柴芍六君湯組大鼠毛發淡黃質硬,稍有光澤,活潑好動,灌胃抵抗。

2.3 大鼠胃黏膜組織形態學比較

正常組大鼠胃黏膜組織顏色鮮紅,色澤光亮,黏膜皺襞豐富充盈,形態正常;光鏡下可見組織結構完整,細胞排列緊密整齊,未見細胞壞死。模型組大鼠胃黏膜組織顏色稍灰暗,厚度變薄,色澤較差,皺襞減少甚至消失;固有腺體萎縮,炎性細胞浸潤,部分細胞脫落、壞死,排列紊亂。維酶素組大鼠胃黏膜組織色澤鮮紅,胃黏膜厚度較模型組增厚,黏膜皺襞增加;胃黏膜形態較模型組改善,炎性細胞浸潤減輕,腺腔仍較大,細胞排列較整齊。柴芍六君湯組大鼠胃黏膜形態趨向于正常組,胃黏膜未見充血水腫,黏膜皺襞明顯增多,厚度較厚;固有腺體萎縮改善,黏膜層連續完整,腺腔體積小,少量炎性細胞浸潤。見圖1。

圖1 大鼠胃黏膜組織直觀圖與組織病理圖(HE染色)Figure 1 Visual and histopathological images of gastric mucosa in rats(HE staining)

2.4 大鼠胃黏膜凋亡基因c-myc和p53比較

與正常組比,模型組大鼠胃黏膜c-myc、p53 mRNA表達均顯著上升(P＜0.01);維酶素組和柴芍六君湯組大鼠胃黏膜p53 mRNA表達上升(P＜0.05或P＜0.01),c-myc mRNA表達較正常組均有上升趨勢,差異無統計學意義(P＞0.05)。與模型組比,維酶素組和柴芍六君湯組大鼠胃黏膜c-myc、p53 mRNA表達均下降(P＜0.05或P＜0.01)。與維酶素組比,柴芍六君湯組大鼠胃黏膜c-myc、p53 mRNA表達均有上升趨勢,差異無統計學意義(P＞0.05)。這說明柴芍六君湯和維酶素均能抑制肝郁脾虛型CAG大鼠胃黏膜細胞過度凋亡且作用基本一致。見表2,圖2。

表2 大鼠胃黏膜細胞凋亡基因c-myc和p53比較(±s,n=6)Table 2 Comparison of apoptosis genes c-myc and p53 in gastric mucosa of rats

表2 大鼠胃黏膜細胞凋亡基因c-myc和p53比較(±s,n=6)Table 2 Comparison of apoptosis genes c-myc and p53 in gastric mucosa of rats

注:與 正 常 組 比 較,a P＜0.05,b P＜0.01;與 模 型 組 比 較,c P＜0.05,d P＜0.01。Note.Compared with the normal group,a P＜0.05,b P＜0.01.Compared with the CAG group,c P＜0.05,d P＜0.01.

組別Groups c-myc p53正常組Normal group 1.06±0.361.06±0.38模型組CAG group 11.42±3.21b 17.26±6.28b維酶素組VI group 3.44±1.62d 5.80±1.85bc柴芍六君湯組CS group 4.08±2.58d 7.43±2.85ac

圖2 大鼠胃黏膜細胞凋亡基因c-myc及p53電泳圖Figure 2 Electrophoretogram of apoptosis genes c-myc and p53 in rat gastric mucosa

2.5 大鼠胃黏膜增殖因子PCNA和Ag-NOR比較

與正常組比,模型組大鼠胃黏膜PCNA、Ag-NOR蛋白表達均上升(P＜0.05或P＜0.01),維酶素組大鼠胃黏膜PCNA蛋白表達顯著上升(P＜0.01),柴芍六君湯組大鼠胃黏膜PCNA、Ag-NOR蛋白表達均有上升趨勢,差異無統計學意義(P＞0.05)。與模型組比,柴芍六君湯組大鼠胃黏膜PCNA、Ag-NOR蛋白表達均上升(P＜0.05或P＜0.01),維酶素組大鼠胃黏膜PCNA、Ag-NOR蛋白表達較模型組有下降趨勢,差異無統計學意義(P＞0.05)。與維酶素組比,柴芍六君湯組大鼠胃黏膜PCNA、Ag-NOR表達均有下降趨勢,差異無統計學意義(P＞0.05)。這提示柴芍六君湯在抑制肝郁脾虛型CAG大鼠胃黏膜細胞過度增殖方面的效果要優于維酶素。見表3,圖3。

圖3 大鼠胃黏膜PCNA和Ag-NOR表達量Note.PCNA, Proliferating cell nuclear antigen.Ag-NOR,Argyrophilic nucleolar organizer region protein.Compared with the normal group, a P＜0.05,b P＜0.01.Compared with the CAG group,c P＜0.05,d P＜0.01.Figure 3 Expression of PCNA and Ag-NOR in gastric mucosa of rats

表3 大鼠胃黏膜細胞增殖因子PCNA和Ag-NOR表達量比較(±s,n=6)Table 3 Comparison of PCNA and Ag-NOR expression in gastric mucosa of rats

表3 大鼠胃黏膜細胞增殖因子PCNA和Ag-NOR表達量比較(±s,n=6)Table 3 Comparison of PCNA and Ag-NOR expression in gastric mucosa of rats

注:與正常組比較,a P＜0.05,b P＜0.01;與模型組比較,c P＜0.05,d P＜0.01。Note.Compared with the normal group,a P＜0.05,b P＜0.01.Compared with the CAG group,c P＜0.05,d P＜0.01.

組別Groups PCNA Ag-NOR正常組Normal group 0.58±0.100.46±0.14模型組CAG group 0.83±0.12b 0.64±0.16a維酶素組VI group 0.73±0.14b 0.54±0.12柴芍六君湯組CS group 0.61±0.77d 0.47±0.77c

2.6 大鼠胃黏膜凋亡指數比較

與正常組比,模型組大鼠胃黏膜凋亡指數上升(P＜0.05)。與模型組比,柴芍六君湯組大鼠胃黏膜凋亡指數下降(P＜0.05),維酶素組大鼠胃黏膜凋亡指數較模型組有下降趨勢,差異無統計學意義(P＞0.05)。與維酶素組比,柴芍六君湯組大鼠胃黏膜凋亡指數有下降趨勢,差異無統計學意義(P＞0.05)。這表明柴芍六君湯對肝郁脾虛型CAG大鼠胃黏膜細胞過度凋亡具有抑制作用。見表4,圖4。

表4 大鼠胃黏膜凋亡指數比較(±s,n=6)Table 4 Comparison of gastric mucosal apoptosis index in rats

表4 大鼠胃黏膜凋亡指數比較(±s,n=6)Table 4 Comparison of gastric mucosal apoptosis index in rats

注:與正常組比較,a P＜0.05;與模型組比較,b P＜0.05。Note.Compared with the normal group,a P＜0.05.Compared with the CAG group,b P＜0.05.

組別Groups凋亡指數(%)Apoptosis index正常組Normal group 0.19±0.07模型組CAG group 0.64±0.21a維酶素組VI group 0.39±0.16柴芍六君湯組CS group 0.19±0.51b

圖4 大鼠胃黏膜凋亡情況Figure 4 Apoptosis of gastric mucosa in rats

3 討論

胃癌發病率和死亡率均居我國惡性腫瘤第3位,嚴重威脅人類生命健康,CAG是由于多種致病因素關聯作用于機體后出現胃黏膜侵襲與防御因素失衡的胃黏膜損傷性疾病,與胃癌的發病率呈正相關[8-10],因此,對CAG采取早期干預措施,防止甚至逆轉腸化生與上皮內瘤變的發生,是阻斷胃癌進展的重要手段。中醫認為脾胃虛弱是CAG的發病基礎,氣滯亦為本病核心,課題組前期研究表明,肝郁脾虛是CAG重要病理特點,二者常相互影響導致CAG的發病,又因氣滯不行或脾虛不運,妨礙津液正常運行,以致痰聚濕阻,日久易致癌變[11]。肝郁脾虛型病證結合動物模型一直是中醫藥基礎研究的熱點和特色理論,有學者從宏觀表征、行為學以及理化指標方面進行模型評價[12]。本實驗造模結束后,造模組大鼠病理可見胃黏膜固有腺體萎縮,明顯炎性細胞浸潤;一般行為觀察出現毛發色黃質硬,神態疲倦,大便溏結不調,安靜扎堆,行為抑郁,強迫游泳靜止時間明顯延長,上述表現較符合肝郁脾虛型CAG的生物學特征,提示模型成功建立。柴芍六君湯是臨床治療肝郁脾虛型CAG的經典方劑,具有疏肝健脾化痰的作用,經本方治療后,模型大鼠可見精神狀態好轉,活動度增加,胃黏膜皺襞明顯增多、固有腺體萎縮改善、少量炎性細胞浸潤。本實驗結果提示,柴芍六君湯能夠明顯改善肝郁脾虛型CAG大鼠的精神及活動狀態,促進胃黏膜組織損傷修復。

CAG發生發展過程中涉及胃黏膜細胞信號轉導紊亂和多基因表達異常,細胞增殖、凋亡失衡是CAG發生的關鍵因素之一,有研究指出,促凋亡基因c-myc和p53等異常表達均可能參與癌變的某個環節[13-14]。c-myc作為原癌基因磷酸化蛋白質,能夠直接控制DNA的合成,在細胞凋亡、分化、黏附以及細胞周期調控中發揮重要作用,可以維持胃癌細胞的惡性表型,在CAG甚至胃癌中存在過表達情況[15]。p53是腫瘤抑制基因,能夠監護細胞基因的完整性,其蛋白活化水平的增加可降低細胞發生凋亡反應的閾值,癌組織分化越差,p53異常表達的分布就越廣泛[16]。本實驗結果顯示,模型組大鼠存在胃黏膜細胞過度凋亡的表現,凋亡基因c-myc、p53以及凋亡指數表達均升高,經藥物干預后,柴芍六君湯組大鼠胃黏膜c-myc、p53 mRNA表達和凋亡指數均下降,維酶素組大鼠胃黏膜c-myc、p53 mRNA表達下降,凋亡指數有下降趨勢但無統計學差異,提示柴芍六君湯和維酶素都能夠有效抑制CAG大鼠胃黏膜細胞的過度凋亡,下調胃黏膜c-myc、p53 mRNA表達水平,從而起到治療肝郁脾虛型CAG的作用。

PCNA主要參與細胞DNA復制、修復及細胞周期調控等多個重要環節,其含量反映出細胞的生長速度及狀態,對胃癌癌前病變的診斷、分級、指導治療、預后轉歸具有實用性價值,是具有代表性的細胞增殖標記物[17]。Ag-NOR含量取決于轉錄活動的水平和染色體組中攜帶NOR染色體的數量,細胞增殖活躍導致Ag-NOR大量增加,細胞中Ag-NOR的含量對胃黏膜變異程度研究有著重要意義[18]。IHC檢測結果證實,模型組大鼠胃黏膜PCNA、Ag-NOR蛋白存在高表達,經藥物干預后,柴芍六君湯組大鼠胃黏膜PCNA、Ag-NOR蛋白表達水平均出現不同程度的下降,維酶素組大鼠胃黏膜PCNA、Ag-NOR蛋白表達有下降趨勢但無統計學差異,表明柴芍六君湯能夠對肝郁脾虛型CAG大鼠胃黏膜細胞的過度增殖起抑制作用,且相較于陽性藥物維酶素具有更大的治療優勢。

綜上所述,柴芍六君湯對肝郁脾虛型CAG大鼠精神狀態和病理形態具有明顯改善作用,且能夠下調胃黏膜c-myc、p53 mRNA和PCNA、Ag-NOR蛋白表達水平,抑制胃黏膜細胞過度增殖、凋亡。因此認為,柴芍六君湯對肝郁脾虛型CAG大鼠的整體治療作用可能與調控胃黏膜細胞過度增殖、凋亡,從而使其增殖、凋亡水平趨向于平衡狀態有關。此外,是否還涉及其他更多增殖凋亡基因參與或者信號轉導通路的影響,還需要進一步驗證。