肝雙重動脈血供模型的建立與理論應用

田全發鄭衛華王子航李朋飛張俊晶

(1.內蒙古醫科大學附屬醫院肝膽外科,呼和浩特 010030;2.山西省汾陽醫院泌尿男科,山西 汾陽 032200;3.呼和浩特市第一醫院肝膽外科,呼和浩特 010030)

正常肝由門靜脈和肝動脈雙重血液供應。將肝動脈血保持不變,門靜脈血完全或部分被動脈血替代灌注入肝稱之為肝雙重動脈血供(liver double artery blood supply,LDABS)。此術式是門靜脈動脈化的一個分支(portal vein arterialization,PVA),最早由Qiao等[1]提出。LDABS目前主要應用于急性肝功能衰竭、原位肝移植以及輔助肝移植前后的門靜脈血栓形成等[2-4],已顯示較好的效果,且可維持肝功能和形態[5-7]。但LDABS畢竟改變了正常的生理解剖關系,特殊情況下應用產生的良好效果是否說明該技術可常規應用于此類患者,需要臨床前的深入研究[8-9]。因此,建立適宜的動物模型,對于解決上述問題具有重要的意義。目前有關LDABS模型制備方法少有系統文獻闡述,尤其在模型中涉及血流控制、血管吻合等問題更是讓研究者望而卻步。本研究旨在建立一種成熟穩定、易于操作的LDABS動物模型,在此基礎上,探討其理論應用價值。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

6~8周齡SPF級雄性SD大鼠76只,體重300~330 g,購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(浙)2019-0001]。本課題組適應性飼養,無菌手術在上海懿貝瑞生物醫藥科技有限公司中心屏障動物實驗設施進行[SYXK(滬)2017-0014],飼養環境:溫度21℃~24℃,濕度40%~50%,光照:12 h/12 h明暗交替,噪聲＜50 dB,IVC籠內飼養,自由飲食。實驗過程中按“3R”原則給予人道的關懷。手術顯微鏡(Leica M 525 F20)雙人配合完成,本實驗研究通過內蒙古醫科大學倫理審查(YKD2015102)。

1.2 主要試劑與儀器

0.9%氯化鈉注射液,山東齊都藥業有限公司;碳酸氫鈉注射液,山西省芮城科龍獸藥有限公司;肝素鈉,上?；瘜W試劑廠;低分子肝素鈣,兆科藥業(合肥)有限公司;5%葡萄糖注射液,廣東圣戈生物科技有限公司;異氟烷,深圳市瑞沃德生命科技有限公司;注射用青霉素鈉,華北制藥股份有限公司;10-06-04-0縫合線,寧波醫用縫線有限公司;醫用紗布敷料,南昌市恩惠醫用衛生材料有限公司;醫用棉簽,湖南永康醫療器械有限公司;M525F20萊卡顯微鏡,長沙醫療器械廠;小動物氣體麻醉呼吸機,上海玉研科學儀器有限公司;顯微鑷、顯微血管夾,上海醫療器械(集團)有限公司。

1.3 實驗方法

(1)100%O22~4 L/min混合異氟烷吸入麻醉,濃度3.5%~5%誘導,1.5%~2.5%吸入維持。麻醉成功后取仰臥位,將大鼠四肢固定于自制固定板,術野常規脫毛消毒處理。采用腹正中切口,逐層進腹,自制拉鉤暴露手術視野。

(2)血管夾阻斷門靜脈2 min,4-0線結扎肝左外葉及中葉,開放門靜脈,可見剩余肝葉充血性改變(圖1A),沿結扎線切除肝左外葉、中葉(圖1B),可見殘腹腔(圖1C)。

(3)下腔靜脈下方作隧道放4-0線預防出血。剝除下腔靜脈與門靜脈外膜,分離右腎動脈(圖1D),斜形半剪開右腎動脈(圖1E),插入聚乙烯管(管內充滿肝素水,長度23 mm,內直徑0.5 mm)后再離斷右腎動脈,6-0線固定管。

(4)將門靜脈骨骼化(圖1F),沖洗腹腔。顯微鑷夾閉門靜脈遠端,調整脾靜脈端在顯微鑷最里側,定為“0”點。斜形45°半剪開門靜脈(圖2A),插入聚乙烯管另一端,6-0線綁定,再離斷門靜脈。門靜脈開放過程不超過1 s。

圖1 肝雙重動脈血供手術步驟Note.A,Results showed that the right lobe,papillary lobe and caudate lobe were congestive.B,Liver tissue removed.C,Abdominal cavity after partial hepatectomy.D,Separation of right renal artery.E,Catheterization of right renal artery.F,Skeletonization of portal vein.Figure 1 Operative steps for the liver arteral blood supply

(5)4-0線阻斷下腔靜脈兩端。顯微鑷尖端提起下腔靜脈,剪成魚口狀,修剪魚狀口直徑與門靜脈斜形斷端直徑大致相等,肝素水沖洗斷端?？蓪㈤T靜脈近脾靜脈端、下腔靜脈近心端定為0點,門靜脈遠離脾靜脈端、下腔靜脈遠心端定位為6點。“米”字形八個點使用找中點法按門靜脈定點9-10.5-7.5-6-0-3-1.5-4.5順序依次縫合(圖2B)。每一針按“血管外-里-里-外”用10-0線與相對應點縫合,“0”“6”兩點拐角位置,采用拐角水平褥式縫合(圖2C)。拐角即血管吻合形成折角的位置。縫合最后一針前短暫開放門靜脈使高凝血流出,再大量肝素水沖洗管腔,在肝素水里縫合最后一針。開放下腔靜脈兩端及門靜脈,觀察吻合口是否漏血及狹窄(圖2D)。

(6)術畢檢驗聚乙烯管是否通暢。一是觀察肝顏色判斷管是否通暢,如肝顏色鮮紅則通。如肝發黃或暗黃難判定時,顯微鑷從遠心端朝近心端夾閉并擼、刮聚乙烯管,人為制造小氣泡觀察管是否通暢(圖2E)。如通,小氣泡被快速推走,如不通,小氣泡在原處。

(7)觀察如無活動性出血,6-0連續縫合肌肉層連同腹膜,4-0間斷縫合大鼠皮層,動物模型成功。

3.3 入庫：徹底清潔后將機子開進機庫，無機庫的要加蓋防雨淋，日曬的簡易棚，用塑料袋將柴油、機油的加油口、空濾器、排氣管口包扎，以防塵土進入。

1.3.2 圍手術期處理

術前12 h禁食,不限飲水。術前1 h稱重,低分子肝素鈣100 U/kg皮下注射,阿托品0.03 mg/kg肌注,同時頸部皮下注射生理鹽水、5%葡萄糖及5%碳酸氫鈉共4 mL(比例3∶3∶1配置)。術中根據大鼠呼吸頻率判斷麻醉深度以便調節異氟烷濃度,術畢停止吸入麻醉藥,大鼠在術后4 min內蘇醒,可翻身活動。術后暖光照射1 h,自由進水,術后第1天給食。術后前3 d青霉素肌注10000 U/100(g·d),皮下注射低分子肝素鈣100 u/kg,q12 h。

1.4 觀察內容

記錄手術時間,計算造模成功率,觀察大鼠術后一般情況,包括毛發、色澤、尿液顏色、體重、肝體積變化及色澤改變。術后24 h采用Vero 2100超高分辨率小動物超聲影像系統(加拿大Visual Sonics)檢測大鼠門靜脈靜脈及吻合口血流情況。

2 結果

共納入76只大鼠,40只作為訓練組,36只大鼠作為模型組。訓練組動物術中門靜脈出血3只,吻合口縫合完有滲血數量為10只;術后死亡尸檢出血8只,肺栓塞10只,肝壞死4只,腸壞死5只。模型組大鼠死亡4只,尸檢:肺栓塞2只,肝壞死1只,腸道壞死1只。模型組手術時間為(65.3±6.56)min,血管吻合時間(11.1±2.53)min。術中無明顯副損傷,出血量(0.6±0.21)mL,術后存活超過24 h標志造模成功,成功率100%(36/36),相關并發癥發生率為0%。大鼠術后能自由進食水,警覺,活動如常,毛發光澤略暗。術后24 h尿液呈淡紅色,48~72 h后尿液顏色恢復正常色澤。術后24 h超聲檢測門靜脈血流(5.8±1.5)mL/(min·g)肝重(與原門靜脈血流量相似),吻合口血流通暢,無明顯狹窄。1周后造模成功率88.9%(32/36),相關并發癥發生率為11.1%。1周后大鼠取材,剖腹探查發現肝呈鮮紅色色澤改變,肝體積飽滿及增大明顯,右腎實質發黃萎縮,吻合口愈合良好,通暢無狹窄(圖2F)。

3 討論

3.1 手術操作技巧及改進

此模型術式主要包括三個步驟:肝切除、門腔靜脈吻合及門靜脈動脈化。70%肝切除是經典肝再生研究模型,其手術技巧大多文獻談及[10]。此不再贅述,但得需注意以下問題:在結扎肝葉前阻斷門靜脈2 min,可使血量丟失更少。結扎位置較深肝葉時,避免撕扯、牽拉肝組織。打結時盡量靠近被切除的肝葉,避免結扎下腔靜脈。門靜脈動脈化指將門靜脈改道,門靜脈遠端注入下腔靜脈,近端引入右腎動脈血。

血管吻合口漏血及狹窄是主要并發癥[11-13],這也是早期模擬訓練需解決的主要問題之一。因門靜脈及腔靜脈位置固定、內徑小、壁薄、位置深,門腔吻合在技術上更具有挑戰性。吻合方式方法有多種,但至今沒有一個理想的方法可供借鑒,完美的微血管縫合技術應具備吻合方式易操作、血管缺血時間短、血管壁損傷小及最佳的近遠期通暢率等優點。陳永亮等[14]運用縫合的方式,將門靜脈端側與肝動脈吻合,側側吻合連接下腔靜脈與門靜脈制作完全門靜脈動脈化(CPVA)大鼠模型。此方法對于外科手術者操作要求較高且穩定性較差,手術時間長,血液形成逆流,易致大量血栓形成,且創傷大。陳鵬等[15]通過切除左腎,利用同種異體材料作為套管,將左腎動脈與原有門靜脈血共同匯入門靜脈制作門靜脈動脈化,優點是術式簡單,手術時間短。但缺點也明顯:門靜脈屬支有發生回流受阻的可能,易形成免疫反應,術后隨時間推移發生血管扭轉,引起狹窄的可能性較傳統術式高。基于文獻和課題組前期的工作基礎[16-17],針對門腔靜脈解剖特點,課題組再次對血管吻合進行了改進與創新。吻合口修剪為魚口狀,以脾靜脈匯合處作為參照,按照特定的順序進行(圖2B),特定順序能夠在不必牽引血管情況下,保證外翻縫合。Qiao等[17]多采用定點縫合,反復牽引、調整位置用來保證外翻縫合,增加了血管壁損傷的概率,牽引張力不均勻亦出現針距的不均勻。而本研究提出的“米”吻合順序無需反復翻轉血管牽引縫合,可以避免上述情況發生。門腔靜脈吻合時需將系膜組織以及腸管整體向左側翻轉,血管吻合時存在一定的張力,“米”順序吻合時“0”“6”兩點拐角位置尤為明顯,當恢復正常解剖位置時,容易滲、出血。前期訓練組常規方法吻合拐角,有滲血數量為10只,需用壓迫3 min;術后出血死亡數為8只,尸檢發現大部分是因兩拐角出現問題,這種現象與門腔靜脈血管解剖位置、吻合手法技巧有關。在此,筆者課題組創新性采用拐角兩點水平褥式縫合法,既有利于外翻縫合,又讓拐角結合處受力均勻,避免血管牽張力不均而形成漏,又使吻合口出血極少。36只模型組大鼠使用拐角兩點水平褥式縫合法后實現了術中吻合口出血極少,術后出血死亡數為零。但需注意水平褥式縫合時緣距及針距不可過大,否則易狹窄。

圖2 肝雙重動脈血供手術步驟及手術技巧簡圖Note.A,Oblique 45°half cut open-door vein.B,Oblique 45°cut open-door vein,the circle is the cross-section of blood vessel.The number in the tube wall represents the time of the clock and the number outside the tube wall indicates the suture sequence.C,Schematic diagram of portal vein anastomosis.a,Horizontal mattress suture at two points at the corner.D,Portal vena cava anastomosis(0 h).E,Unobstructed anastomosis(168 h).F,Artificially made small bubbles to observe whether the tube is unobstructed.Figure 2 Schematic diagram of the operative steps and surgicaltechnique for the liver dual arterial blood supply

門靜脈動脈化時,因動脈壁厚且直徑小,靜脈壁薄且直徑大,如直接吻合并發癥多,且不易控制血流量。既往文獻研究證實,門靜脈壓力過高過低都會抑制肝再生[18-20]。本研究借助內徑0.5 mm聚乙烯管將右腎動脈血液引入門靜脈,形成肝雙重動脈血供。此管內徑出血量與門靜脈原有血流量相似,且可避免血管吻合所帶來并發癥。門靜脈血流通暢是保證模型成功的基礎,既往有文獻報道,門靜脈動脈化后肝萎縮,考慮與門靜脈架橋血流不通暢有關[18]。架橋血管是否通暢,包含腎動脈側因素、架橋血管因素以及門靜脈側因素。腎動脈側需注意假道,腎動脈插入聚乙烯管時易把動脈內膜或肌層強推到管徑內人為造成堵塞。此時手法技巧很重要,本研究首次使用斜形半剪開腎動脈后,鑷子輕提腎動脈斷端的全層,管旋轉插入可避免。

門靜脈側置管,是本研究的創新點之一,本研究首次提出利用自身牽引法,斜形45°半剪開門靜脈方法(圖2A注意角度及位置)置管,然后離斷,避免了門靜脈回縮。45°斜切可使吻合口面積擴大2倍,不至于產生吻合口狹窄。此外,還需觀察右腎動脈血液流出情況?？梢远虝洪_放右腎動脈,如血流速度快,呈噴射狀,可以置入;如血流速度較慢,注意觀察右腎動脈有無分支。如有,需結扎腎動脈分支,否則會影響血流速度。操作過程中,保持肝素水不定時沖洗聚乙烯管管腔,防止血栓形成。

3.2 并發癥的預防

血管吻合前已述及,是模型制備的關鍵,而由血管吻合導致的并發癥發生率可以通過大量的模擬訓練降低或避免。除此而外,其他并發癥亦影響模型制備的效果和成功率,如模型操作過程中臟器功能保護、麻醉護理等等。通過前期模擬操作后,造模組仍有4只大鼠死亡,其原因考慮如下。

3.2.1 出血

分術中出血及術后出血,術后出血在門腔靜脈吻合處已經談及,此處不再贅述。術中出血多發生在門靜脈骨骼化過程中,由于門靜脈解剖結構復雜,門靜脈下方緊貼肝固有動脈,左側有脾動靜脈分支,且無明顯分離界限,由纖維組織纏繞相連。因此,術中動作盡量輕柔,必要時可用顯微剪刀剪斷纖維組織,不可強撕扯,易造成血管壁破裂。本組沒有術中出血導致的死亡,但術中出血影響術后存活。

3.2.2 肺栓塞

為最嚴重及最常見的并發癥之一。熟練顯微操作,縮短手術阻斷時間是關鍵因素之一,同時皮下注射低分子肝素鈣[21]。及時清理吻合口周圍微小雜物,縫合完畢前肝素水多次沖洗管腔。在吻合最后一針前,短暫開放門靜脈釋放淤阻的高凝血液與血凝塊。通過改進,造模組此并發癥大大減少,但仍有2只動物因此而死亡。

3.2.3 肝壞死

尸檢時發現肝土黃色改變,肝表面有散在出血點。前已述及,結扎肝蒂時線盡量靠近預切除的肝葉,同時注意不能結扎了肝葉后方的下腔靜脈。本組有1例動物肝壞死死亡,考慮與此有關。

3.2.4 腸道壞死

避免腸管長時間受到壓力,暴露視野時,可暫將腸道置于腹腔外。每隔3 min暴露的腸管上滴加生理鹽水,腸管放回原位時,采用棉簽輕撥、動作輕柔,避免腸道折疊甚至打結造成腸梗阻。吻合口狹窄、血栓形成也是腸道壞死的重要原因,術后第1天內禁食,可預防急性胃腸擴張。通過模擬訓練,此種情況在后期較為少見。

3.2.5 感染

由于實驗環境在相對無菌條件下進行,加之術中及術后3 d常規應用青霉素肌注,同時注意術中嚴格按照無菌操作進行。本組大鼠均未因感染而死亡。

圍術期護理方面:(1)吸入性麻醉劑異氟烷在肝代謝率低,肝毒性小,對胃腸道機能影響小,是理想的麻醉劑[22]。術中麻醉劑攝入值越小,副作用越小。當術中調整至濃度1.5%甚至更低時,此時應密切注意大鼠呼吸頻率及幅度。當在大鼠出現首次驚厥,或呼吸頻率急促,表示大鼠即將蘇醒,說明給的劑量低,大鼠會在3~5 min內恢復意識。需立即調高流量0.3%~0.5%劑量。(2)術前肌注阿托品,可減少呼吸道分泌物、防止窒息等并發癥。(3)因門腔靜脈吻合時需阻斷門靜脈、下腔靜脈血液回流,時間過長易致缺氧性酸中毒,適當的補充碳酸氫鈉則可改善腸道缺血缺氧再灌注損傷形成的酸中毒。(4)皮下注射低分子肝素鈣可預防長時間血流阻斷,細小血凝塊析出致肺栓塞發生的幾率。(5)術后24 h內需禁食,進食可能因手術、麻醉等致胃腸蠕動功能降低,有可能導致急性胃腸擴張,必要時可行胃插管進行胃腸減壓對癥治療,可建議給予頸部皮下注射生理鹽水、5%葡萄糖及5%碳酸氫鈉共4 mL(比例3∶3∶1配置)進行基礎能量補充。術后第1天再給予鼠糧進食。

綜上所述,多種因素都能影響LDABS動物模型的存活。因此,必須重視操作中所有細節。熟練進行顯微外科操作,精準手術是縮短操作過程及減少手術并發癥的前提;良好的麻醉控制,穩定的血流動力學及術后圍手術期精心護理等才能夠使手術成功率大大提高。