干擾FUT8的表達抑制結直腸癌細胞增殖和侵襲能力的作用及機制

卞艷麗,張春瑞*,宋書波,張體鵬

(1.鄭州澍青醫學高等專科學校臨床醫學,鄭州 450000;2.河南省人民醫院心血管外科,鄭州 450000)

結直腸癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,是發達國家與腫瘤相關死亡的第二大常見原因。世界衛生組織統計數據顯示,2018年全球結直腸癌病例180萬例,約有88萬例結直腸癌死亡病例,已成為世界范圍內的公共衛生問題[1]。盡管結直腸癌在診斷和治療方面取得了顯著的進步,但是患者的存活率仍然較差[2]。結直腸癌的發生和發展是一個多因素及復雜的過程,與其它類型腫瘤一樣,幾種關鍵信號通路中的驅動程序突變會促進結直腸癌的發生發展[3]。異常糖基化被視為腫瘤的標志,涉及細胞信號傳導、免疫調節和腫瘤增殖、侵襲等過程[4]。巖藻糖基轉移酶8(fucosyltransferase 8,FUT8)催化α-1,6-鍵的巖藻糖轉移到最內層N-乙酰氨基葡糖中,完成核心巖藻糖基化[5]。FUT8異常表達促進乳腺癌、非小細胞肺癌和肝細胞肝癌等惡性腫瘤的增殖、侵襲和耐藥等腫瘤的惡性生物學特性[6-8]。Noda等[9]研究報道FUT8蛋白的表達可能成為II期和III期結直腸癌患者預后的生物標志物。但是FUT8在結直腸癌中發揮的具體作用未知,因此本文研究了FUT8對結直腸癌細胞增殖和侵襲的影響及作用機制,旨在獲得FUT8作為結直腸癌新型治療靶點的實驗依據。

1 材料和方法

1.1 細胞

結直腸癌細胞SW480購自上海中國科學院細胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

L15細胞培養基、胎牛血清和胰酶購自美國Hyclone公司;FUT8 siRNA購自上海生工生物技術有限公司;脂質體2000購自美國Invitrogen試劑公司;蛋白裂解液購自北京索萊寶試劑公司;BCA檢測試劑盒購自美國Thermo公司;5×蛋白上樣緩沖液和ECL化學發光試劑盒購自上海碧云天科技有限公司;PVDF膜購自邁博瑞生物膜技術有限公司;CCK8試劑購自日本同仁化工試劑有限公司;Boyden小室購自美國BD公司;FUT8、AKT、pAKT和β-catenin抗體購自美國proteintech公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 基因表達譜數據動態分析(GEPIA)數據庫分析結直腸癌組織中FUT8的表達水平

于GEPIA數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)中“表達”菜單中輸入FUT8基因,選擇結直腸癌進行分析。

1.3.2 細胞培養和細胞轉染

SW480細胞從液氮復蘇后重懸至含有10%胎牛血清的L15細胞培養基中,放置在37℃、5%CO2的全濕度培養箱中培養。SW480細胞呈對數生長時,采用胰酶收集細胞進行計數,接種至6孔板中,每孔1×105個細胞,分為si-NC組和si-FUT8組。培養箱中培養12 h后,將脂質體2000與NC siRNA混合后轉染至si-NC組細胞中,脂質體2000與FUT8 siRNA混合后轉染至si-FUT8組細胞中。8 h后更換新鮮培養基,放置培養箱中繼續培養進行后續實驗。

1.3.3 Western blot檢測蛋白表達

胰酶消化收集細胞,PBS洗3次,加入適量蛋白裂解液吹打細胞。超聲裂解細胞30 min,4℃、14000 r/min離心30 min,棄掉細胞沉淀,吸取液體移至新的EP管中。按照BCA試劑盒說明書檢測細胞蛋白濃度,并加入5×蛋白上樣緩沖液混勻后沸水煮5 min。SDS-PAGE凝膠電泳80 V電泳120 min,100 V濕轉100 min。5%BSA常溫孵育PVDF膜1 h,目的一抗稀釋液(FUT8、AKT、pAKT和β-catenin抗體稀釋比均為1∶500)4℃孵育過夜。TBST洗3次,兔二抗稀釋液(1∶10000)室溫孵育1 h,TBST洗3次后,加ECL發光液進行曝光。

1.3.4 CCK8實驗檢測細胞增殖

在待測樣品96孔中加入10μL CCK8試劑,培養箱中繼續孵育1 h。酶標儀450 nm波長處檢測每個樣品孔的吸光度值(OD值)。

1.3.5 Boyden實驗檢測細胞侵襲

胰酶消化收集待測細胞,無血清培養基將胰酶和血清洗去后進行計數,接種至Boyden小室的上室中,每孔1×105個細胞。將Boyden小室放入含有10%胎牛血清的500μL細胞培養基的24孔板中,作為Boyden小室的下室,放置培養箱中培養。培養16 h左右,細胞由上室穿入下室時,終止培養。將Boyden小室上未穿過的細胞采用PBS洗去,甲醇固定,結晶紫染色。顯微鏡下拍照,計數穿膜細胞的個數。

1.3.6 SC79處理回復實驗

SW480細胞呈對數生長時,采用胰酶收集細胞進行計數,接種至6孔板中,每孔1×105個細胞,分為si-NC組、si-FUT8組、si-NC+SC79組和si-FUT8+SC79組。si-NC組和si-FUT8組分別轉染NC siRNA和FUT8 siRNA,si-NC+SC79組和si-FUT8+SC79組分別轉染NC siRNA和FUT8 siRNA的同時加入SC79試劑,處理48 h后進行后續實驗。

1.4 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析,數據均以平均數±標準差(±s)表示,兩組間的統計學差異采用獨立樣本t檢驗比較。兩組以上的統計學差異采用方差分析比較,兩兩間的比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 FUT8在結直腸癌組織中的表達水平

采用GEPIA數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)分析FUT8在結直腸癌組織中的表達水平,結果顯示FUT8 mRNA在結直腸癌組織中的表達水平顯著高于其在正常結直腸組織中的表達水平,P＜0.05,見圖1。

圖1 TCGA數據庫分析FUT8在結直腸癌中的表達Note.Compared with normal colorectal tissues,*P＜0.05.Figure 1 TCGA database analyzed the expression of FUT8 in colorectal cancer

2.2 FUT8 siRNA敲減效果

結直腸癌細胞系SW480感染FUT8 siRNA,采用Western blot檢測FUT8 siRNA干擾效果,結果顯示si-NC組SW480細胞中FUT8的相對表達量為(0.35±0.05),si-FUT8組SW480細胞中FUT8相對表達量為(0.08±0.02)。si-FUT8組中FUT8相對表達量顯著低于si-NC組(t=8.132,P=0.001),見圖2。

圖2 Western blot檢測FUT8 siRNA轉染效果Note.Compared with si-NC group,*P＜0.05.Figure 2 Western blot detected the transfection effect of FUT8 siRNA

2.3 敲低FUT8對結直腸癌細胞增殖能力的影響

采用CCK8實驗檢測FUT8對結直腸癌細胞增殖能力的影響,結果顯示與si-NC組SW480細胞相比,si-FUT8組SW480細胞增殖能力顯著降低,P＜0.05,見圖3。

圖3 CCK8檢測結直腸癌細胞SW480增殖能力Note.Compared with si-NC group,*P＜0.05.Figure 3 CCK8 detected the proliferation ability of colorectal cancer cells SW480

2.4 敲低FUT8對結直腸癌細胞侵襲能力的影響

采用Boyden實驗檢測FUT8對結直腸癌細胞侵襲能力的影響,結果顯示si-NC組SW480細胞中FUT8的相對表達量為(52.67±4.72),si-FUT8組SW480細胞中FUT8相對表達量為(25.00±4.58),與si-NC組SW480細胞相比,si-FUT8組SW480細胞侵襲能力顯著降低(t=7.280,P=0.002),見圖4。

圖4 Boyden實驗檢測結直腸癌細胞SW480侵襲能力Note.Compared with si-NC group,*P＜0.05.Figure 4 Boyden experiment detected the metastasis of colorectal cancer cells SW480

2.5 SC79對轉染FUT8 siRNA的結直腸癌細胞增殖能力的影響

采用CCK8實驗檢測SC79對轉染FUT8 siRNA的結直腸癌細胞增殖能力的影響,結果顯示si-NC組和si-NC+SC79組SW480細胞增殖能力無差異,與si-NC組和si-NC+SC79組相比,si-FUT8組和si-FUT8組+SC79組細胞增殖能力降低,但是與si-FUT8組相比,si-NC+SC79組細胞增殖能力增加。P＜0.05,見圖5。

圖5 CCK8實驗檢測SC79對轉染FUT8 siRNA的結直腸癌細胞能力的影響Note.Compared with si-NC+SC79 group,*P＜0.05.Compared with si-FUT 8 group,#P＜0.05.The same as below.Figure 5 CCK8 experiment detected the effect of SC79 on the ability of colorectal cancer cells transfectedwith siRNA of FUT8

2.6 SC79對轉染FUT8 siRNA的結直腸癌細胞侵襲能力的影響

采用Boyden實驗檢測SC79對轉染FUT8 siRNA的結直腸癌細胞侵襲能力的影響,結果顯示si-NC組、si-NC+SC79組、si-FUT8組和si-FUT8組+SC79組SW480細胞穿膜細胞數為(56.67±7.09)個、(25.33±1.53)個、(59.00±3.61)個和(33.33±3.79)個。si-NC組和si-NC+SC79組SW480細胞侵襲能力無差異,與si-NC組和si-NC+SC79組相比,si-FUT8組和si-FUT8組+SC79組細胞侵襲能力降低,但是與si-FUT8組相比,si-NC+SC79組細胞侵襲能力增加。P＜0.05,見圖6。

圖6 Boyden實驗檢測SC79對轉染FUT8 siRNA的結直腸癌細胞侵襲能力的影響Figure 6 Boyden experiment detected the effect of SC79 on the invasion ability of colorectal cancer cells transfected with FUT8 siRNA

2.7 Western blot實驗檢測FUT8對AKT/βcatenin信號通路的影響

采用Western blot實驗檢測FUT8對結直腸癌細胞AKT/β-catenin信號通路的影響,結果顯示si-NC組和si-NC+SC79組SW480細胞中pAKT和β-catenin蛋白的表達無顯著性差異,與si-NC組和si-NC+SC79組相比,si-FUT8組和si-FUT8組+SC79組細胞中pAKT和β-catenin蛋白的表達降低,但是與si-FUT8組相比,si-NC+SC79組細胞中pAKT和β-catenin蛋白的表達增加。P＜0.05,見圖7。

圖7 Western blot實驗檢測FUT8對AKT/β-catenin信號通路的影響Figure 7 Western blot experiment detected the effect of FUT8 on AKT/β-catenin signaling pathway

3 討論

結直腸癌是男性和女性中常見的消化系統惡性腫瘤,嚴重威脅著人類的健康[10]。隨著結腸鏡檢查的普及,結直腸癌的發病率和死亡率在過去的幾十年中雖然有所下降,但是由于初次診斷時患者已處于晚期,手術切除、化學治療、放射治療和分子靶向等治療對其療效有限,導致結直腸癌患者的預后仍然很差[11]。結直腸是由癌基因、抑癌基因和與DNA修復機制相關的基因突變引起的[3]。轉移和復發的頻率高是導致結直腸癌患者死亡的主要原因[12-13]。因此研究結直腸癌細胞增殖和侵襲的分子機制對探索治療結直腸癌新的分子靶點非常重要。

糖基化是寡糖鏈與蛋白質或脂質共價連接的過程,其在包括細胞生長、分化和轉化等許多生理和病理變化中發揮重要作用[4]。巖藻糖基化是腫瘤中最重要的糖基化類型之一,與腫瘤的惡性轉化、侵襲和轉移有關。巖藻糖基化是由FUTs家族將巖藻糖轉移到糖蛋白和糖脂中合成的,FUTs表達失調引起巖藻糖基異常化涉及腫瘤發生的各種基本細胞生物學過程[14]。FUTs家族包括13種成員,其中由FUT8編碼的α1,6-巖藻糖基轉移酶是唯一負責核心巖藻糖基化的酶,而核心巖藻糖基化對粘附分子和生長因子受體具有重要的調節功能,因此FUT8密切參與腫瘤細胞的惡性增殖和侵襲過程[15]。同時研究報道FUT8與實體腫瘤患者的預后相關,胰腺導管癌組織中高表達的FUT8蛋白與患者淋巴結轉移和無復發生存率顯著相關[16]。在結直腸癌組織中FUT8的表達對患者預后的影響與p53的狀態有關,在p53陰性的晚期結直腸癌患者中FUT8蛋白的陽性表達與患者更好的無疾病進展生存期顯著相關[9]。但是FUT8在結直腸癌中發揮的功能仍然未知。本文采用GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)數據庫分析顯示FUT8在結直腸癌組織中的表達水平顯著高于其在正常結直腸組織中的表達水平,提示FUT8在結直腸癌中發揮癌基因的作用,與FUT8在其它腫瘤中的表達情況具有一致性[6-8]。

本文采用siRNA轉染結直腸癌細胞抑制FUT8的表達后,CCK8和Boyden實驗檢測結直腸癌細胞的增殖和侵襲能力,結果顯示干擾FUT8的表達抑制結直腸癌細胞的增殖和侵襲能力,表明FUT8在結直腸癌中高表達促進其增殖和侵襲。Tu等[6]報道抑制FUT8的表達則抑制了高侵襲性乳腺癌細胞的侵襲性。癌癥相關成纖維細胞中FUT8的表達促進非小細胞肺癌的增殖和侵襲能力[17]。與本文中觀察到FUT8的生物學功能一致。在乳腺癌中FUT8可能通過巖藻糖基化TGF-β受體復合物,以促進TGF-β結合并增強下游信號傳導發揮促癌作用[6]。AKT、WNT和KRAS等信號途徑的改變導致結直腸癌細胞增殖和遷移增加[18-19]。而在肝細胞肝癌中表達上調的FUT8通過激活PI3K-AKT-NFκB信號傳導促進肝細胞肝癌細胞的增殖能力[8]。FUT8缺乏可以通過減少核β-catenin蛋白的積累抑制乳腺癌細胞的粘附、遷移和侵襲[20]。FUT8是否可以調控AKT/β-catenin信號通路促進結直腸癌的進展,本文采用一種可以增加AKT磷酸化水平的小分子化合物SC79處理FUT8 siRNA轉染的結直腸癌細胞,功能實驗檢測SC79和FUT8 siRNA共同作用對結直腸癌細胞增殖和侵襲能力的影響,結果顯示si-NC組與si-NC和SC79共同處理組細胞的增殖和侵襲能力無差異,表明在si-NC組細胞中AKT信號通路均為激活狀態。而與si-NC組相比,si-FUT8和SC79處理組細胞的增殖和侵襲能力降低,但是高于si-FUT8組細胞的增殖和侵襲能力,表明在si-FUT8組細胞中AKT信號通路活性被抑制,且SC79僅能部分恢復AKT信號通路的活性。同時Western blot同樣發現SC79可以減弱FUT8 siRNA對結直腸癌細胞中pAKT和β-catenin蛋白的抑制作用,表明FUT8通過調控AKT/β-catenin信號通路促進結直腸癌細胞增殖和侵襲能力。

綜上所述,FUT8 siRNA可能通過調控AKT/βcatenin信號通路抑制結直腸癌細胞的增殖和侵襲能力,是結直腸癌候選癌基因,可能是治療結直腸癌新的分子靶點。