白皮杉醇通過MAPK/ERK信號通路對急性重癥一氧化碳中毒大鼠腦損傷的保護作用

曹 娟,王士杰,畢見龍

(北京大學國際醫院急診科,北京 102206)

一氧化碳(carbon monoxide,CO)中毒是臨床上常見的吸入性中毒事件之一[1]。CO中毒的致病機理是CO與血紅蛋白結合,形成結構穩定的碳氧血紅蛋白(carboxyhemoglobin,HbCO),使血紅蛋白無法結合氧分子,造成組織缺氧[2]。機體在短時間內吸入過量CO可致急性重癥CO中毒(acute carbon monoxide poisoning,ACOP),引起組織細胞損傷,其中對腦組織細胞的損害最嚴重[3]。它能引起多種嚴重并發癥,尤其是急性腦損傷和遲發性腦病[4]。

絲裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路是一個復雜的細胞內信號轉導網絡,參與調控細胞生長、分裂、分化、死亡等各個階段的生理活動,對調節機體生理病理反應過程中起著重要作用[5]。其中細胞外調節蛋白激酶(extracellular siganl-regulated kinase,ERK)信號通路涉及生長和分化中不同受體的激活,參與細胞的增殖、分化、形態維持、骨架構建、細胞凋亡和癌變等多種生化反應[6-7]。然而,在已經不需要增殖和分化的成熟神經元細胞中仍有大量的ERK上游調控子和下游靶蛋白的存在,經研究發現,ERK與哺乳動物的學習和記憶過程有著緊密關系[8]。

白皮杉醇(piceatannol,PIC)也稱比杉特醇,是一種多酚類化合物,化學名為3,3’,4,5’-四羥基反式二丙乙烯,分子式為C14H12O4。PIC主要存在于葡萄、甘蔗、大黃、藍莓及百香果等植物中[9]。PIC具有抗炎、抗氧化活性,清除自由基的作用[10]。根據已有研究報道[11],PIC可抑制腦細胞凋亡發揮對缺血缺氧性腦組織損傷大鼠大腦具有保護作用。本研究旨在通過MAPK信號通路揭示PIC對一氧化碳中毒大鼠腦損傷的保護作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠100只,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2016-0011],45周齡,體重為(220±20)g,飼養于本院動物實驗中心[SYXK(京)2016-0044],飼養室保持良好通風,飼養環境溫度為(25±2)℃,濕度(50±10)%,12 h晝夜周期。正常飼養1周以適應環境,第2周開始進行實驗,使用大鼠時嚴格按照3R原則給予人道關懷。動物實驗按照本院動物管理委員會(IACUC2018001)的規定執行,并已通過北京大學國際醫院實驗動物倫理與管理委員會審批(20190508001)。

1.2 主要試劑與儀器

PIC購自梯希愛(上海)化成工業發展有限公司(批號:10083-24-6);ERK1/2通路抑制劑(500μmol/L)購自美國Sigma公司;HE染色試劑盒和TUNEL染色試劑盒購自南京凱基生物有限公司;ROS檢測試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司;Western blot試劑盒購自美國BD公司。

處理箱(訂制90 L容積的亞克力材質密封箱體,箱側壁存在可密封的進氣口和出氣口,箱內裝有CO檢測儀);99.99%CO氣體購自西南化工研究所;血氣分析儀購自德國拜耳公司;Morris水迷宮及分析跟蹤系統由首都醫科大學宣武醫院實驗動物室提供;線粒體提取試劑盒及膜電位檢測試劑盒購自北京Solatbio Sciences&Technology有限公司;光學顯微鏡;透射電子顯微鏡(日產JEM-1230)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組及急性CO中毒動物模型制備

飼養的第8天,將100只大鼠隨機分為四組:空白對照組(NC組)、ACOP模型組(CO組)、ACOP模型采用PIC處理組(PIC組)和ACOP模型采用PIC和ERK抑制劑同時處理組(PIC+ERK組),每組各25只。除NC組外,其余各組大鼠根據文獻[3]描述制備ACOP大鼠模型。將大鼠置于90 L的處理箱中,持續吸入濃度為1000 ppm的CO氣體20 min,CO濃度升高至2000 ppm,持續吸入20 min,隨后CO氣體濃度升高至3000 ppm,大鼠在箱中持續吸入氣體20 min后,轉移至箱外呼吸空氣。NC組大鼠在處理箱中持續吸入空氣60 min。制模過程中觀察大鼠的行為狀態,出箱后立即從大鼠左側股動脈抽取0.3 mL的全血,使用血氣分析儀采用微量定量法檢測血液中碳氧血紅蛋白濃度(COHb%)。

1.3.2 給藥方法

制備模型后,NC組與CO組大鼠正常飼養;PIC組大鼠給予200 mg/kg PIC灌胃,灌胃劑量2 mL,每天1次,共33 d;PIC+ERK組大鼠給予200 mg/kg PIC和0.2 mg/kg ERK抑制劑灌胃,灌胃劑量2 mL,每天1次,共33 d;NC組與CO組灌胃等量生理鹽水。

1.3.3 Morris水迷宮實驗

四組大鼠處理后于第2天進行Morris水迷宮實驗,6 d為一個實驗周期,水迷宮實驗包括定位航行和空間探索兩個階段[12-14]。定位航行實驗共進行5次,每次5 d,每天訓練4次;每次更換入水點,大鼠找到平臺后或120 s內找不到平臺,拿上平臺,休息15 s后進行下一次訓練,記錄四組大鼠逃避潛伏期,計算每組大鼠每次實驗得到逃避潛伏期的平均值。空間探索實驗在定位航行實驗結束后1 d進行,撤去原平臺,所有大鼠從同一入水點放入水中,記錄大鼠在120 s內穿越平臺次數。逃避潛伏期和穿越平臺次數取一個實驗周期內得到的平均值。

1.3.4 腦組織標本制備

制備模型后33 d,四組大鼠進行完空間探索實驗后,每組大鼠隨機取10只,其中每組5只用4%苯巴比妥鈉深度麻醉后,從左心室灌注200 mL的生理鹽水和4%多聚甲醛,取腦,放入4%多聚甲醛4℃固定48 h,脫水,石蠟包埋,冠狀位連續切片,厚度6μm,用于HE染色和TUNEL染色。剩余大鼠取腦,冰面上分離海馬區,-80℃保存,用于線粒體的提取、神經元超微結構觀察、ROS含量檢測、Western blot實驗。

1.3.5 HE染色檢測大鼠腦組織形態

將四組大鼠腦組織石蠟切片依次脫蠟,水化,經蘇木素-伊紅染色,脫水,二甲苯透明,干燥,中性樹膠封片,光學顯微鏡下觀察大鼠腦組織海馬區細胞形態并拍攝照片。

1.3.6 TUNEL染色檢測大腦細胞凋亡

將四組大鼠腦組織石蠟切片脫臘至水,加入蛋白酶K工作液,37℃孵育20 min,加入Tunel反應液濕盒37℃避光孵育1 h,PBS洗滌,DAB顯色10 min,蘇木素復染,脫水,透明,中性樹脂封片。每張切片隨機選取互不重疊的3個視野,于400倍鏡下通過Lasersharp 2000軟件進行圖像采集,顆粒狀綠色深染的細胞為TUNEL陽性細胞,觀察并記錄圖片中陽性細胞數。

1.3.7 離體神經元超微結構觀察

取四組大鼠海馬區齒狀回平面切組織塊樣本,放入4%的戊二醛溶液中固定,環氧乙烷處理,環氧樹脂包埋,包埋的組織樣本進行超薄切片,枸櫞酸鉛染液染色,水洗,通過透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)觀察切片并拍攝照片。

1.3.8 流式細胞儀檢測線粒體膜電位

用線粒體提取液分離并純化線粒體,然后添加5倍稀釋的JC-1染料工作液,陰性對照切片以PBS代替熒光染料。線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)的變化采用流式細胞儀的cflowfplus軟件分析系統。每個實驗重復10次,取每組所有樣本MMP相對值的平均值,用平均熒光強度(mean fluorescence intensity,MFI)表示。

1.3.9 活性氧試劑盒檢測四組大鼠ROS水平

取500 g腦組織的細胞勻漿液,12000 r/min離心30 min,棄上清液,加入10μmol/L的DCFH-DA,移液槍吹打混勻,使細胞懸浮于DCFH-DA中,在37℃的細胞培養箱內孵育20 min,每3 min顛倒混勻,使試劑與細胞完全接觸,無血清培養基洗滌3次后懸浮于PBS溶液中,使用流式細胞儀在488 nm激發波長,525 nm處檢測樣品的熒光強度。

1.3.10 Western blot分析Nrf-2及Bcl-2蛋白表達

將海馬區稱重后加入7 mL/g腦組織的裂解液制備腦組織勻漿液,在4℃下1200 r/min離心30 min,置于冰上裂解30 min,取上清液,采用二喹啉甲酸(bicinchonininc acid,BCA)法進行蛋白定量檢測,加入樣品得到1X蛋白上樣緩沖液,混勻,95℃下變性10 min。按Western blot法[9]檢測Nrf-2、Bcl-2蛋白表達水平,加入待測樣品進行電泳,轉膜,封閉1 h,按照抗體說明書進行一抗孵育過夜,加入二抗顯色,成像。采用Image J軟件進行灰度值分析,每一條蛋白條帶以自身β-actin作為內參進行灰度校正。

1.4 統計學方法

用Graphpad 5.0軟件分析實驗數據,定量數據用平均數±標準差(±s)表示,實驗數據進行正態性和方差性檢驗,逃避潛伏期和穿越平臺次數比較采用重復測量資料的方差分析,海馬區Nrf-2、Bcl-2的表達采用單因素方差分析進行組間比較,兩兩比較采用LSD法,P＜0.05表示差異顯著,結果具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠急性CO中毒模型制備后行為表現及血液COHb%檢測結果

處理箱內CO濃度為2000 ppm條件下,CO組、PIC組和PIC+ERK組大鼠在5~15 min內表現為興奮躁動,15 min后表現為呼吸急促。CO濃度升高至3000 ppm后,大鼠出現四肢抽搐,大小便失禁,口、鼻、耳、四肢及尾部皮膚呈現櫻桃紅色,隨后四肢無力甚至昏迷。昏迷大鼠出箱后吸入空氣,逐漸恢復活動,制模過程無大鼠退出實驗。處理后,CO組、PIC組和PIC+ERK組大鼠血液中COHb%均大于40%,NC組大鼠無上述表現,血液中COHb%小于5%,表明ACOP大鼠模型制備成功,四組大鼠COHb%的比較見圖1。

圖1 四組大鼠血液中COHb%比較(n=25)Figure 1 Comparison of COHb% in blood among four groups of rats

2.2 各組大鼠Morris水迷宮實驗觀察比較

處理后1~6 d Morris水迷宮實驗結果無顯著性差異;處理后14~33 d,隨著病程延長,CO組和PIC+ERK組平均逃避潛伏期逐漸延長,穿越平臺次數逐漸減少,與NC組比較有顯著差異(P＜0.001)。處理后14~33 d,PIC組與同期CO組和PIC+ERK組比較,平均逃避潛伏期縮短,跨越平臺次數明顯增多(P＜0.001),與NC組比較,21~28 d定位航行實驗差異顯著(P＜0.05),空間探索實驗無顯著差異(P＞0.05)。結果見表1、表2。

表1 四組大鼠定位航行實驗結果統計(n=25)Table 1 Statistics results of the place navigation experiments among four groups of rats

表2 四組大鼠空間探索實驗結果統計(n=25)Table 2 Statistics results of the spatial probe experiments among four groups of rats

2.3 PIC對大鼠腦組織形態的影響

四組大鼠海馬區腦組織HE染色觀察結果如下:NC組細胞形態結構正常;CO組細胞結構疏松;PIC組結構較緊密;PIC+ERK組細胞形態與CO組相近。PIC處理后,PIC組大鼠的腦組織細胞的形態結構沒有明顯的病理性變化(見圖2)。

圖2 四組大鼠腦組織HE染色形態觀察結果(n=25)Note.A,NC group.B,CO group.C,PIC group.D,PIC+ERK group.The same as below.Figure 2 Results of HE staining in brain tissues among four groups of rats

2.4 大鼠腦組織神經細胞超微結構觀察比較

四組大鼠腦組織神經細胞超微結構觀察結果(見圖3):NC組,大鼠腦組織的海馬區神經細胞輪廓清晰,染色質均勻分布,胞質清晰,雙層細胞核膜清晰完整,胞漿內線粒體結構完整,數量較多,未出現空泡。CO組和PIC+ERK組細胞核出現固縮,線粒體腫脹,嵴斷裂或者變少,甚至細胞水腫出現空泡化。PIC組細胞輪廓較為清晰,染色質均一,線粒體形態規則。

圖3 四組大鼠神經元細胞超微結構觀察Figure 3 Observation of ultra-structure of neuron among four groups of rats

2.5 四組大鼠腦組織細胞凋亡情況比較

TUNEL染色結果見圖4,NC組TUNEL陽性細胞數量少,而CO組和PIC+ERK組有大量綠染TUNEL陽性細胞,PIC組有少量TUNEL陽性細胞。四組陽性細胞計數結果見表,CO組和PIC+ERK組顯著高于NC組和PIC組(P＜0.001)。

圖4 TUNEL染色檢測細胞凋亡情況(n=25)Note.A,Representative images from four groups of rats.B,Comparison of apoptotic cell among four groups of rats.Compared with NC group,**P＜0.01,***P＜0.001.Compared with CO group and PIC+ERK group,###P＜0.001.Figure 4 TUNEL staining in brain of rats

2.6 四組大鼠腦組織海馬區神經細胞線粒體膜電位改變

NC組大鼠腦組織海馬區中MFI值維持較高水平,表明其神經細胞線粒體功能完整。CO組和PIC+ERK組大鼠MFI值顯著低于NC組,差異具有統計學意義(P＜0.001),說明CO組和PIC+ERK組大鼠對的神經細胞中線粒體損傷嚴重。PIC組大鼠MFI值較CO組和PIC+ERK組高,且差異顯著(P＜0.001),低于NC組,表明經過PIC對CO中毒后大鼠的神經細胞有一定程度的保護作用。見圖5。

圖5 四組大鼠腦組織神經細胞MFI值比較(n=25)Note.Compared with NC group,***P＜0.001.Compared with CO group and PIC+ERK group,###P＜0.001.Figure 5 Comparison of MFI value in neuron among four groups of rats

2.7 四組大鼠海馬區氧化應激損傷指標檢測

與NC組比較,CO組和PIC+ERK組海馬區ROS含量明顯升高,差異顯著(P＜0.01)。PIC+ERK組的ROS含量與CO組接近,差異不顯著(P＞0.05)。PIC組與CO組和PIC+ERK組比較,ROS含量下降,差異具有統計學意義(P＜0.01)。見圖6。

圖6 四組大鼠海馬區氧化應激損傷(n=25)Note.A,Fluorescence detecting results of ROS.B,Comparison of DCF-positive cells to show ROS level in hippocampus among four groups of rats.Compared with NC group,**P＜0.01.Compared with CO group and PIC+ERK group,##P＜0.01.Figure 6 Oxidative stress level detection in hippocampus among four groups of rats

2.8 Nrf-2及Bcl-2蛋白在大鼠腦組織海馬區中的表達變化

Western blot結果顯示,Nrf-2、Bcl-2蛋白的表達在四組大鼠間無顯著差異(P＞0.05),PIC組相對于NC組、CO組、PIC+ERK組,大鼠腦組織海馬區中Nrf-2、Bcl-2蛋白的表達水平上升。見圖7。

3 討論

ACOP主要是由組織持續缺氧引發的[15]。在哺乳動物的各器官系統中,以腦神經元細胞對缺氧最為敏感,缺血缺氧都易造成腦損傷甚至細胞死亡,從而引起機體出現學習、記憶機能減退等表現[16]。ACOP造成腦損傷,致死率高,治療難度大[17]。目前常用的的治療手段是高壓氧治療,能有效改善急性期中毒患者組織缺氧的情況,減輕中毒癥狀。但是該療法對重癥患者和遲發性腦病患者的治療效果有限[3]。尋找新的治療手段是目前相關學者研究的重點。已有研究認為急性CO中毒引起腦損傷的機制有:(1)血液和組織的缺氧性損傷及隨之產生的氧化應激反應[4,17-18];(2)神經炎癥反應[15];(3)線粒體介導神經細胞凋亡[4]。而腦組織中海馬區參與機體的學習和記憶過程,對空間定位起到了重要作用,并且對于組織缺氧造成的損傷十分敏感。已有研究表明,PIC對于治療神經細胞損傷有一定療效[11]。Morris水迷宮實驗是國內外常用的檢測大鼠空間學習記憶能力的實驗[14]。

本研究對CO組、PIC組和PIC+ERK組大鼠制備ACOP模型,結果顯示三組大鼠血液中COHb%均＞40%,明顯高于NC組大鼠,說明大鼠ACOP模型制備成功。隨后進行5次Morris水迷宮實驗檢測CO的毒性對于大鼠學習記憶能力的影響,結果顯示經過PIC治療14~33 d,PIC組大鼠定位航行實驗的平均逃避潛伏期明顯低于CO組大鼠(P＜0.05),與NC組間比較差異無統計學意義(P＞0.05);空間探索實驗中PIC組大鼠跨越平臺次數明顯高于CO組大鼠(P＜0.05),與NC組無顯著差異(P＞0.05),表明經過PIC處理的大鼠空間學習和記憶能力較未用藥物處理的模型大鼠有明顯恢復。王鯤宇等[17]研究結果顯示進行Morris水迷宮實驗CO中毒的模型組大鼠的逃避潛伏期較干預組和對照組明顯延長,本研究結果與之相符。在行為實驗觀察結束后,對四組大鼠的腦組織細胞形態、凋亡情況等進行觀察,比較不同處理的大鼠腦組織細胞的生理結構變化,結果顯示PIC處理的大鼠,腦細胞形態與對照組相近,無明顯的病理結構變化,凋亡細胞數目明顯少于CO組大鼠(P＜0.05),說明PIC對急性CO中毒大鼠的腦損傷情況起到了保護作用。本研究將進一步探討PIC對于由CO中毒引起的腦損傷的保護機制。

線粒體膜在細胞凋亡的起始過程中起到重要作用[3,19]。線粒體膜電位的降低導致膜孔道的開放,使內膜及外模的離子對流,造成呼吸鏈異常,進而使得線粒體功能受損[16]。線粒體功能障礙使得細胞中氧自由基增多,ROS含量增加,形成氧自由基連鎖反應,破壞生物膜及其功能,造成細胞損傷及凋亡[19]。線粒體介導的細胞凋亡在氧化應激的生理過程中發揮著重要作用。本研究對四組大鼠神經元細胞超微結構的觀察與線粒體膜電位的檢測,可以看出未經藥物處理的模型大鼠神經細胞中線粒體結構受到嚴重破壞,CO組大鼠與NC組比較,線粒體膜電位明顯下降,細胞中ROS含量顯著增加(P＜0.05),該結果與已有研究一致[3]。而采用PIC灌胃處理的大鼠,線粒體結構較為完整,與CO組比較,MMP下降程度低,對線粒體功能影響較小,細胞中ROS含量較低(P＜0.05),說明PIC可能對于CO造成的線粒體結構損傷起到了保護作用。

Bcl-2蛋白是目前最受關注的凋亡相關蛋白,分布于線粒體膜、內質網和核膜孔周圍[16,20]。已有研究報道,細胞受損情況與細胞中ERK通路的激活情況相關,通過激活ERK信號通路,能誘發下游細胞信號分子Bcl-2的表達,從而抑制細胞凋亡[5]。PIC抑制細胞凋亡,減輕腦損傷與MAPK/ERK信號通路有關[10]。通過實驗證明,激活ERK信號通路可以上調Nrf-2蛋白的表達[20-22]。根據研究報道,CO中毒后,人為誘導Nrf-2過表達能發揮其抗氧化機制[3]。Nrf-2能被多種外源物質誘導,是常用抗氧化應激治療的靶向位點。PIC已被證明通過上調Nrf-2蛋白的表達水平有助于緩解細胞的炎癥反應和氧化應激反應,對組織損傷起到保護作用[9,23]。在本研究中,與CO組大鼠相比,PIC處理的大鼠Nrf-2和Bcl-2的表達量增加(P＜0.05),同時采用PIC和ERK抑制劑處理模型大鼠相較于NC組大鼠,其學習記憶能力下降明顯,腦組織細胞形態異常,神經細胞凋亡數目較多,超微結構受到損害,MMP值顯著下降,ROS含量上升,Nrf-2和Bcl-2蛋白的表達下降(P＜0.05),說明PIC可能通過激活ERK信號通路,使Nrf-2、Bcl-2蛋白過表達,來保護線粒體結構的完整,抑制氧化應激反應。圖7 Western blot檢測Nrf-2和Bcl-2蛋白表達水平(n=25)

圖7 Western blot檢測Nrf-2和Bcl-2蛋白表達水平(n=25)Figure 7 Relative expression of Nrf-2 and Bcl-2 protein detected by Western blot in brain tissue among four groups of rats

基于以上結果推測,PIC可能通過調控MAPK/ERK信號通路,上調Nrf-2和Bcl-2蛋白的表達,有效保護了大鼠腦組織,防止急性重癥CO中毒引起的損害。