微生物法測定嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量不確定度評估

吳思敏，嚴家俊，黃鐘標

廣東產品質量監督檢驗研究院，廣東佛山 528300

0 引言

葉酸（Folic Acid），又名蝶酰谷氨酸，是人體必需的營養物質之一。葉酸不能在體內合成，需要通過日常飲食攝入，葉酸的缺乏或過量攝入都會對人體造成傷害[1～3]。因此，通過有效方法對含葉酸產品進行定量檢測，確保人體葉酸的攝入在合理的水平具有顯要的意義[4，5]。

目前，嬰幼兒配方乳粉中葉酸的檢測方法包括儀器法[6～10]、化學發光分析法[11～13]、酶聯免疫法[14，15]和微生物法[16～19]等。相對于其他檢測方法，微生物法具有較高的靈敏度及精確度，可以滿足對于葉酸含量較低、基質復雜樣品的檢測需求。美國官方分析家協會手冊及《GB 5009.211—2014 食品安全國家標準 食品中葉酸的測定》都將微生物法作為葉酸檢測的首選方法和仲裁方法。但微生物法操作較為繁瑣，并且試驗過程有諸多不確定因素，以致檢測結果存在一定的誤差。為了更加客觀公允的表示分析結果，保證葉酸測定結果的準確性，本研究依據《GB 5009.211—2014 食品安全國家標準 食品中葉酸的測定》及相關不確定度評估標準及統計學方法，對影響嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量測定結果的不確定度分量進行研究，以此確保檢測結果的權威與公正，從而更好地保障食品質量與安全。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

葉酸標準品（純度≥99%）；鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus Caseispp.rhamnosus）（ATCC 7469）；乳酸桿菌瓊脂培養基、乳酸桿菌肉湯培養基、葉酸測定用培養基。

1.2 儀器與設備

CL-40M高壓滅菌鍋，GHP-9160隔水式恒溫培養箱，HH-4數顯恒溫水浴鍋，1-14K離心機，ML204電子天平，CP225D分析天平，UV-1900分光光度計，Vortex-Genie 2渦旋混合器。

1.3 試驗方法

1.3.1 試樣的提取

準確稱取1.000 g樣品，精確至0.001 g，轉入含80.0000 mL氫氧化鈉乙醇溶液的100.0000 mL容量瓶中，超聲振蕩2～4 h后，用水定容至刻度，搖勻。用水進行適當稀釋。

1.3.2 培養管配制

標準曲線系列管：取試管分別加入葉酸標準工作液0.0000 mL、0.2500 mL、0.5000 mL、1.0000 mL、1.5000 mL、2.0000 mL、2.5000 mL、3.0000 mL、3.5000 mL、4.0000 mL和5.0000 mL，加水至5.0000 mL后，添加5.0000 mL葉酸測定用培養液。每個梯度做3 次平行。

樣品系列管：取空試管分別加入0.5000 mL、1.0000 mL、2.0000 mL3 個含量的試樣稀釋液，加水至5.0000 mL后，添加5.0000 mL葉酸測定用培養液。每個梯度做3 次平行。

1.3.3 滅菌與培養

將所有試管塞好試管塞，于121 ℃滅菌5 min，快速冷卻至室溫。在無菌條件下向每只試管加入20 μL接種液，另取一只標準管不接種，作為0對照管，混勻。置于（37±1）℃恒溫培養箱中培養40 h。

1.3.4 測定與結果計算

使用混勻振蕩器將培養好的試管混勻，于540 nm處，以0對照管調節吸光度值為0，依次測定各試管培養液。以標準系列管中葉酸的含量為橫坐標，各個標準點吸光度值的平均值為縱坐標，繪制標準曲線。通過標準曲線換算試樣系列管中葉酸的相應含量，以此計算樣品中葉酸的含量。

1.4 建立數學模型及識別不確定的來源

試驗中葉酸含量為下式：

其中，X為試樣中葉酸含量（μg/100 g）；C為試樣稀釋液中葉酸濃度的平均值（ng/mL）；V為試樣提取液的定容體積（mL）；m為試樣的質量（g）；f為稀釋倍數；為由ng/g換算為μg/100 g的系數。

通過分析不確定度數學模型可知，葉酸的測量不確定度主要由標準溶液的配制過程、樣液配制過程、儀器測量偏差、重復性以及檢測方法等幾方面引入。

2 結果與分析

2.1 標準溶液的配制過程

標準溶液配制過程引入的不確定度來源主要有：標準物質的純度、標準品的稱量、標準工作液的配制以及標準系列管的配制等。

2.1.1 標準品的純度引入的不確定度

葉酸標準品的檢定證書給出其純度≥99.00%，假設該標準品純度在99.00%～100.00%的范圍內服從矩形分布，其中位值為99.50%，則相對標準不確定度為：

2.1.2 標準品稱量引入的不確定度

根據分析天平的檢定證書可知，天平的允差范圍為±0.1 mg，采用矩形分布，包含因子為，本試驗使用減重法稱取葉酸標準品20.0 mg，共稱重2次，即1 次為空盤質量，1 次為總質量。則標準品稱量引入的相對不確定度為

2.1.3 標準工作液配制過程中量具引入的不確定度

稱取20.0 mg葉酸標準品后，使用1000.0000 mL容量瓶，定容至刻度，配制成標準儲備液。移取1.0000 mL標準儲備液至100.0000 mL容量瓶，定容至刻度，配制成標準中間液。移取1.0000 mL標準中間液至1000.0000 mL容量瓶，定容至刻度，配制成標準工作液。該過程中用到1000.0000 mL容量瓶2 次，100.0000 mL容量瓶1次，1.0000 mL移液槍2 次。根據《JJG 646 移液器檢定規程》及《JJG 196 常用玻璃量器檢定規程》，查得所使用量具的最大允許誤差。選用矩形分布，包含因子為，則移液管和容量瓶的不確定度見表1。

表1 標準工作液的配制過程中量具引入的不確定度

根據不確定度的合成公式，標準工作液的配制過程中，由量具所引入的相對標準不確定度為：

環境溫度的變化對標準工作液的配制產生一定的影響，試驗所用量具校準的溫度為20 ℃。在實際試驗過程中，環境的溫度波動范圍為（20±5）℃，水的體積膨脹系數約為2.1×10-4。因此，假設溫度波動均勻分布，包含的因子為 3，則由溫度所引入的各量具相對不確定度均是0.06%，標準工作液的配制過程中，由環境溫度所引入的相對標準不確定度為：

標準工作液的配制所引入的相對標準不確定度為：

2.1.4 標準系列管的配制引入的不確定度

標準系列管的配制過程中使用1.0000 mL的移液槍吸取了0.2500 mL、0.5000 mL、1.0000 mL，使用5.0000 mL的移液槍吸取了1.5000 mL、2.0000 mL、2.5000 mL、3.0000 mL、4.0000 mL、5.0000 mL。采用矩形分布，包含因子為，則由吸取標準工作液體積的移液槍引入的不確定度見表2。標準系列管配制引入的相對標準不確定度為：

表2 吸取標準工作液體積的移液槍引入的不確定度

其中，Urel(Qi)為移液槍移取標準工作液體積導致的相對不確定度。

標準溶液的配制過程引入的合成相對標準不確定度為：

2.2 樣液的配制過程引入的不確定度

樣液的配制過程所引入的不確定度來源主要有：樣品的稱量、樣品稀釋液的配制以及樣品系列管的配制等。

2.2.1 樣品稱量引入的不確定度

根據分析天平的檢定證書可知，天平的允差范圍為±0.001 g，采用矩形分布，包含因子為，本試驗使用減重法稱取樣品0.500 g，共稱重2 次，即一次為空盤質量，一次為總質量。則樣品稱量引入的相對不確定度為：

2.2.2 樣品稀釋液配制過程中引入的不確定度

稱取0.500 g樣品后，使用100.0000 mL容量瓶定容至刻度，從中移取5.0000～100.0000 mL容量瓶，定容至刻度，配制成樣品稀釋液。該過程中用到100.0000 mL容量瓶2 次，5.0000 mL移液槍1 次。根據《JJG 646 移液器檢定規程》及《JJG 196 常用玻璃量器檢定規程》可知所用量具的最大允許誤差。采用矩形分布，包含因子為，則移液管和容量瓶的相對標準不確定見表3。

表3 樣品稀釋液液配制過程量具引入的不確定度

根據不確定度的合成公式，樣品稀釋液的配制過程中量具所引入的相對標準不確定度為：

環境溫度的變化對樣品稀釋液配制產生一定的影響，試驗所用量具的校準溫度為20 ℃。在實際試驗過程中，環境溫度的波動范圍為（20±5）℃，水的體積膨脹系數約為2.1×10-4。因此，假設溫度波動均勻分布，包含的因子為，則由溫度所引入的各量具相對不確定度均為0.06%，樣品稀釋液的配制過程中環境溫度所引入的相對標準不確定度為：

樣品稀釋液的配制所引入的相對標準不確定度為：

2.2.3 樣品系列管配制引入的相對標準不確定度

樣品系列管的配制過程中使用了1.0000 mL的移液槍吸取了0.5000、1.0000 mL，使用5.0000 mL的移液槍吸取了2.0000 mL。采用矩形分布，包含因子為，則由吸取樣品稀釋液液體積的移液槍引入的相對標準不確定度見表4。

表4 吸取樣品稀釋液體積的移液槍所引入的相對標準不確定度

樣品系列管配制引入的相對標準不確定度為：

其中，Urel（xi）為移液槍移取樣品稀釋液體積引入的相對不確定度。

樣品的配制引入的合成相對標準不確定度為：

2.3 儀器測量的偏差引入的不確定度

使用紫外分光光度計讀取培養后各系列管吸光度值，儀器測量誤差主要為透射比的示值誤差。由校準報告可得，該儀器透射比最大的允許誤差為1.00%，采用矩形分布，包含的因子為，因此儀器測量的偏差所引入的相對不確定度為：

2.4 測量重復性的不確定度

取同一樣品進行6 次葉酸含量檢測，結果見表5。

表5 樣品重復測定結果（n=6）

重復測定所產生的不確定度屬A類不確定度[16]，依據貝塞爾公式計算由隨機效應導致的標準不確定度：

在日常檢驗過程中，報告結果一般以2 次測量結果平均值表示，則2 次測量的結果平均值的相對標準不確定度為：

2.5 檢測方法引入的不確定度

選擇同一樣品進行6 次加標回收試驗，回收率測定結果見表6。

表6 加標回收試驗結果（n=6）

假設分布的類型為三角分布，則由檢測的方法所引入的相對不確定度為：

2.6 合成不確定度和擴展不確定度

本研究的主要不確定度由表7所示。

表7 不確定度分量的匯總

故微生物法測定嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量的合成相對不確定度為：

3 結論與討論

本研究采用微生物法測定嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量，實驗試驗所測得的樣品葉酸的質量分數為（148.49±7.37）μg/100g，k=2。通過不確定度分量研究可得，影響嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量檢測的主要因素是標準溶液的配制過程和樣液配制過程，其他因素為儀器測量偏差、重復性以及檢測方法。從研究結果可以看出，標液和樣液的配制過程使用到了大量的量具，包括容量瓶、移液槍等，由量具引入的不確定度較大。因此，試驗過程中應盡量降低量具使用的誤差，嚴格按照實驗試驗操作規范操作，對試驗用量具進行定期校準和維護。