凝血級聯活化與大氣顆粒物引發心血管疾病關聯的研究進展

薛凱兵， 李志剛， 魏永杰

中國環境科學研究院， 環境基準與風險評估國家重點實驗室， 北京 100012

空氣污染被認為是導致心血管疾病的主要影響因素之一，并與多種心血管疾病風險相關[1]. 研究[2-6]指出，大氣顆粒物是空氣污染誘發不良健康效應(尤其是對心血管系統的影響)的主要原因. 流行病學研究[7-8]提示，大氣顆粒物的短期、長期暴露均與缺血性心臟病、心力衰竭、缺血性/血栓性腦卒中等心血管疾病的死亡風險增加有關聯. 毒理學研究[9-10]表明，大氣顆粒物對心血管影響的主要生物學機制有3種：①肺部產生的促炎癥或氧化應激介質溢出到全身循環；②促進自主神經系統失衡；③大氣顆粒物組分直接滲透到心血管組織中發生反應. 大氣顆粒物暴露后通過這3種機制介導的血液凝結被認為可能是導致心血管疾病風險增加的主要原因之一. 凝血級聯活化作為機體血液凝結最基礎的部分，必然參與到大氣顆粒物暴露后的血液凝結過程中. 為了明確大氣顆粒物對心血管疾病的作用過程，預防和最大限度地減少大氣顆粒物暴露對健康的危害，有必要深入了解大氣顆粒物如何誘導血液凝結. 該文綜述了凝血級聯活化在大氣顆粒物誘導血液凝結中的關鍵作用，主要討論了大氣顆粒物暴露對外源性和內源性凝血級聯通路的影響，以期為凝血級聯活化與大氣顆粒物引發心血管疾病的關聯提供理論基礎.

1 凝血級聯在大氣顆粒物促凝效應中的重要性

在高等生物體內，凝血級聯被激活以形成纖維蛋白凝塊來制止血管損傷后的失血. 凝血級聯是指凝血因子的裂解活化并激活通路中的后續蛋白酶，逐級反應最終產生纖維蛋白的過程[11]. 在早期模型中，凝血級聯反應分為外源性通路和內源性通路. 在外源性通路中，組織因子(tissue factor, TF)作為啟動因子與因子Ⅶ (FⅦ)結合形成TF-Ⅶa復合物，進一步激活因子Ⅹ (FⅩ). 在內源性通路中，因子Ⅻ (FⅫ)與帶負電荷的表面接觸后，轉化為活化的FⅫa，再依次激活因子Ⅺ、因子Ⅸ和因子Ⅹ[12]. 然后，二者匯合成共同通路，FⅩa、凝血酶原(prothrombin, FⅡ)和輔助因子Ⅴa組裝成凝血酶激活劑復合物，該激活劑激活凝血酶，最終將纖維蛋白原轉化為纖維蛋白[12]. 然而，隨著早期模型無法解釋新出現的問題，Hoffman等[11,13]重塑了凝血級聯，新的凝血理論指出機體止血過程包含發生在不同細胞表面的3個重疊階段：①凝血在攜帶組織因子的細胞上啟動；②產生的少量凝血酶激活血小板；③凝血過程在激活的血小板表面延伸，產生大量凝血酶. 基于細胞的凝血級聯理論[13]表明，內源性通路和外源性通路其實并不是兩條完全獨立的凝血路徑，二者同時在不同的細胞表面平行運行，因此血液正常流動平衡過程涉及多種循環血細胞、各種凝血因子、血小板、纖維蛋白溶解因子、血管壁以及內皮細胞衍生介質之間的相互作用. 研究[14-16]表明，大氣顆粒物暴露會影響這些保持血液正常流動平衡的各種因子，進而打破機體血液流動平衡. 已有研究中大氣顆粒物暴露后主要影響的凝血蛋白或指標如表1所示，具體包括：①凝血因子表達變化，如TF[14-19]、凝血酶(thrombin，FⅡa)[20]、FⅩa[19]、纖維蛋白原(fibrinogen，FⅠ)表達增加[21-24]，FⅧ、FⅩ、FⅡ活性增加[20]以及組織因子通路抑制劑(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)表達減少[25]. ②纖維蛋白溶解調控蛋白表達變化，如組織纖溶酶原激活物(tissue plasminogen activator，t-PA)表達減少[26-28]，纖溶酶原激活物抑制劑(plasminogen activator inhibitor1，PAI-1)表達增加[29-30]. ③血小板活化標志物表達增加，包括可溶性CD40配體(soluble CD40 ligand，sCD40)[31-33]、可溶性P選擇素(soluble P-selectin，CD62p)[34-35]和血管性假血友病因子(von willebrand factor，vWF)[29]. 該文歸納了大氣顆粒物暴露誘發的凝血效應，主要包括凝血結形成、纖維蛋白溶解抑制和血小板活化，且這3種凝血效應均與凝血級聯活化有關[36]. 凝血級聯是凝血結形成的一個組成部分. 大氣顆粒物暴露誘導凝血因子表達增加，通過凝血級聯反應生成纖維蛋白，纖維蛋白集聚，從而形成凝血結. 纖維蛋白溶解主要受組織纖溶酶原激活物調控. 大氣顆粒物暴露后，通過凝血級聯反應誘導生成的凝血酶能夠促進纖溶酶原激活物抑制劑表達的增加，進而抑制了纖維蛋白溶解[36]. 此外，大氣顆粒物暴露后通過凝血級聯產生的凝血酶可以促進血小板聚集，使血小板活化. 綜上，凝血級聯的活化在大氣顆粒物暴露誘導的血液凝結中可能發揮了關鍵作用，從而與大氣顆粒物暴露后心血管疾病的發病密切相關.

表1 大氣顆粒物暴露誘發的凝血效應

凝血級聯活化在大氣顆粒物暴露誘導血液凝結中發揮關鍵作用，因此有必要探究大氣顆粒物暴露對凝血級聯活化的影響. 區分大氣顆粒物暴露激活的凝血級聯與人體正常止血過程中凝血級聯活化過程的異同，明確大氣顆粒物暴露激活凝血級聯反應的機制，是亟待厘清的科學問題.

2 PM暴露對凝血級聯通路的影響

目前，科學家們已經開展了一些關于大氣顆粒物暴露激活凝血級聯的研究，該文綜述了大氣顆粒物暴露對外源性或內源性凝血級聯通路的影響.

2.1 PM暴露對外源性凝血通路的影響

TF作為外源性通路的啟動因子，成為首要的研究對象. 在健康的機體中，TF在器官和體表的血管周圍細胞和上皮細胞內表達. 內皮屏障的破壞使血管外TF暴露于血液中，進而激活凝血通路[37]. 然而，體內和體外研究均表明，大氣顆粒物暴露也會增加TF的表達，進而激活外源性凝血通路[17-18]. 暴露于PM2.5后，小鼠血液中TF和凝血因子FⅩ的水平均明顯升高，并在肺組織中觀察到纖維蛋白沉積[19]. 近期研究[16]發現，納米級顆粒暴露導致內皮細胞中調控凝血級聯反應的蛋白(TF和t-PA)表達異常，產生促凝效應. 研究已經明確大氣顆粒物暴露誘導TF表達上調，但介導TF表達增加的機制尚不清楚.

作為大氣顆粒物對心血管系統損害的主要機制，炎癥反應也是大氣顆粒物暴露后產生促凝效應的關鍵原因. 炎癥反應對外源性凝血級聯通路活化的貢獻在于各種炎性因子可誘導內皮細胞和血細胞表達TF[38]. Seaton等[39]在1995年假設大氣顆粒物污染與心肺疾病高危人群死亡的關聯可能是由沉積在肺泡中的超細顆粒引發肺泡炎癥，從而激活凝血級聯所致. 直到2005年，Gilmour等[40]證實了這一假說的可能性，其發現可吸入顆粒物暴露后巨噬細胞中炎癥因子白細胞介素-8和TF的表達均增加，從而激活了外源性凝血通路，顯著縮短了凝血時間. 研究[40]認為，大氣顆粒物暴露會引起炎癥，促成外源性凝血通路的活化. 近期研究[16,19]表明，PM2.5可引發炎癥反應進而激活TF調控的外源性凝血級聯，從而誘導血液凝結. Liang等[19]研究發現，暴露于PM2.5后，小鼠血液中促炎因子和黏附分子白細胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、白細胞介素-1β、CRP、TF和凝血因子FⅩ的表達水平均明顯升高，并在肺組織中觀察到纖維蛋白沉積. Li等[16]研究表明，空氣中的納米級顆粒可通過活性氧誘導的炎癥激活內皮細胞，并進一步導致參與凝血級聯的凝血相關蛋白(TF和t-PA)表達的異常. 在眾多可能誘發大氣顆粒物促凝效應的炎癥反應物種中，對炎癥因子IL-6的研究較多. Mutlu等[20]研究發現，敲除IL-6基因的小鼠可免受可吸入顆粒物誘導的血管內凝血酶的形成以及動脈血栓形成加速的影響，證實小鼠暴露于可吸入顆粒物后促血栓狀態的形成需要肺泡巨噬細胞釋放IL-6. 此外，有研究[41]指出，IL-6的促凝機制包括增加促凝蛋白(包括FⅠ、TF、FⅧ和von Willebrand因子)的轉錄表達以及減少抗凝蛋白(蛋白S和抗凝血酶)的轉錄.

然而，TF抗原的測定并不一定能反映TF的功能和反應活性，因為血液中存在微量的血源性TF[42-43]. 血源性TF由細胞活化和凋亡脫落形成的微泡(microparticles，MPs)所攜帶[44]. MPs因包含磷脂表面和攜帶促凝蛋白TF具有極高促凝活性[45]. 磷脂表面可為凝血酶激活復合物的組裝提供條件[46]. 健康捐獻者血液中的血源性TF水平極低，而在各種疾病患者中血源性TF水平升高[47]. 此外，部分血源性TF的非活性前體在受到刺激后發生構象變化，使TF與活化的FⅦ結合并激活FⅩ[48]. 鑒于此，科學家探索了大氣顆粒物的促凝效應與循環MPs的關聯性. Vermylen等[49]于2006年提出吸入空氣污染物可能會誘導骨髓中攜帶TF的造血細胞進入血液循環系統. Bonzini等[50]研究發現，高濃度大氣顆粒物暴露會導致凝血酶原時間縮短、內源性凝血酶生成潛能增加，但凝血和纖溶標志物無顯著變化. 筆者推測循環血小板活化單核細胞產生的MPs可能介導了這種凝血效應. 此外，有研究[51]指出，在非吸煙的糖尿病患者中，機體循環MPs的增加與大氣顆粒物暴露有關. 同時，富含MP的血漿中纖維蛋白原和凝血酶的升高也與大氣顆粒物暴露有關. 近期研究[52]證實，單核細胞和內皮細胞暴露于大氣顆粒物后，可增加MPs的產生. 這些MPs攜帶具有功能活性的TF，因此可以觸發外源性凝血級聯通路的活化，從而導致血栓性疾病. 因此，大氣顆粒物暴露后MP數量和促凝血潛能的增加可能是誘導凝血效應的原因之一.

綜上，大氣顆粒物暴露可以誘導血液中TF含量的增加，進而活化外源性凝血級聯通路. TF增加的機制主要包括炎癥反應介導的TF表達，以及源自循環MPs的血源性TF的增加. 但相關研究仍需從以下幾個方面加強：①目前外源性通路的活化主要根據大氣顆粒物暴露后TF的上調來推測，已有研究鮮有關注凝血通路中所有凝血因子的變化以及凝血因子之間的調控關系，尚未確切證實大氣顆粒物暴露后外源性凝血通路的活化. ②多數研究表明，炎癥反應可能介導了大氣顆粒物暴露后TF表達的增加，但TF的來源和完整的炎癥調控機制尚不清楚. 深入探索炎癥反應介導凝血級聯活化的機制有助于干預大氣顆粒物引發的心血管疾病. ③為明確大氣顆粒物暴露激活外源性凝血級聯通路的機制，仍需探索炎癥反應介導的TF表達與血源性TF增加對激活外源性凝血級聯通路的貢獻.

2.2 PM暴露對內源性凝血通路的影響

傳統理論認為，外源性凝血通路在機體的止血平衡中起主要作用[53]. 然而，FⅦ激活FⅨ以及FⅠa激活FⅪ的認識打破了原有的止血理論[54-55]. 在機體的止血平衡中，外源性通路和內源性通路并非完全獨立. 但FⅫ作為機體內源性通路的啟動因子，其作用仍存在爭論[56]，主要原因有2個：① FⅫ的先天性缺乏與人類或小鼠的出血無關；②體內缺乏合適的表面來支持FⅫ的活化[57]. 最初認為FⅫ激活內源性凝血通路可以由人工表面(如玻璃、高嶺土、碳酸鋇等)介導[58]，但一些天然或生理表面，如血小板聚磷酸鹽、錯誤折疊的蛋白質和膠原蛋白等，也被證實支持FⅫ的活化[59]. 研究[60-62]表明，包含復雜成分的大氣顆粒物同樣能夠接觸激活FⅫ，進而激活內源性凝血通路產生凝血效應.

與外源性通路相比，大氣顆粒物暴露對內源性凝血級聯通路的影響研究起步較晚. Kilinc等[60]于2011年報道了FⅫ和內源性激活通路在大氣顆粒物持續促凝反應中的作用. 與正常血漿比，體外暴露于大氣超細顆粒物的人先天性FⅫ缺陷血漿的凝血酶生成潛能被抑制，氣管內灌注大氣超細顆粒物的FⅫ基因敲除(FⅫ-/-)小鼠血漿的凝血酶生成潛能同樣受到抑制，表明人類長期暴露于大氣超細顆粒物后血液凝結風險的增加可能與FⅫ調控的凝血酶形成有關[60]. 一項更有說服力的研究[61]表明，高濃度大氣細顆粒物通過激活激肽釋放酶激肽系統(kallikrein-kinin system，KKS)來調節內源性的凝血通路，具體為KKS的初始因子FⅫ與大氣顆粒物樣品的結合實現了FⅫ的自我活化，使血漿激肽前體(plasma prekallikrein，PPK)轉化為血漿激肽(plasma kallikrein，PK)，然后裂解高分子量激肽原(high molecular-weight kininogen, HK)，釋放出具有生物活性的多肽緩激肽. PK對FⅫ的激活產生正反饋調節作用，從而放大KKS系統的激活作用[63]. 大量FⅫa會將FⅪ活化，從而引發一系列級聯反應事件，最終導致凝血酶生成. 此外，Wang等[62]進一步證實了KKS系統在大氣細顆粒物誘導內源性凝血系統活化中的作用. 大氣細顆粒物暴露后，PK基因敲除小鼠血漿中凝血酶-抗凝血酶復合物的水平以及凝血酶生成潛勢均較正常小鼠顯著降低；同時，添加前激肽釋放酶抗體可消除PM2.5誘導的正常人血漿中凝血酶的生成[63]. 綜上，大氣細顆粒物能激活KKS系統進而活化內源性凝血通路，介導凝血酶生成. 目前大氣顆粒物對內源性凝血通路的影響研究尚有不足，在未來流行病學和毒理學研究中需側重關注大氣顆粒物暴露誘導機體FⅫ和FⅫa的表達變化，以期更全面地掌握大氣顆粒物對內源性凝血路徑的影響.

上述研究多是基于大氣顆粒物處理后的離體試驗或體外試驗. 這些研究的基礎是假設血液循環中存在大氣顆粒物，對于大氣顆粒物是否進入血液以及哪些組分誘導了血液凝結效應，科學家們一直在不斷探索. Nemmar等[64]證明，作為空氣超細顆粒的替代品，小鼠氣管內灌注的放射性標記白蛋白納米膠體顆粒能迅速從肺部擴散到全身循環. 近期有研究[65]發現，金納米顆粒可以進入人和小鼠的血液循環系統. 盡管是超細顆粒的替代品，這些顆粒在體內的可觀察性表明,大氣顆粒物可能進入血液. 在未來研究中，深入探索大氣顆粒物在血液中的遷移情況是非常有必要的. 此外，目前僅有個別研究探討大氣顆粒物中單個組分對FⅫ的激活作用. Jin等[61]研究發現，帶負電荷的二氧化硅顆粒和脂多糖處理可導致血漿激肽釋放酶的形成，并證實大氣顆粒物中的顆粒態物質和內毒素是誘導KKS活化的原因. Mutch等[66]研究發現，固定化的Ni2 +和Cu2 +以高親和力結合FⅫ、FⅪ和HK，從而刺激KKS的活化，激活FⅫ介導的凝血通路. 大氣顆粒物中包含的過渡金屬對內源性通路的活化可能是大氣顆粒物暴露激活內源性凝血通路的機制之一.

研究大氣顆粒物暴露對內源性凝血級聯通路的影響，不僅有助于全面理解大氣顆粒物暴露對凝血級聯通路的影響，也為研究FⅫ介導的內源性凝血通路在健康機體中的作用提供了契機. 目前體外和體內研究表明，大氣顆粒物暴露激活FⅫ，然后通過KKS系統放大信號，進而激活內源性凝血級聯通路，從而調控下游凝血酶形成；同時，內源性凝血通路研究[67]發現，FⅫ的缺失與人類和動物止血異常無關，但在動脈損傷模型中FⅫ的缺失會損害閉塞性血栓的形成. 抑制FⅫ是一項可選擇且安全的預防腦卒中和其他血栓栓塞性疾病的策略[68]. 根據大氣顆粒物暴露研究和內源性凝血通路研究的結論，筆者推測 FⅫ 誘導的內源性凝血通路的活化在大氣顆粒物誘發血栓類心血管疾病中發揮作用. 在今后的研究中，大氣顆粒物引發心血管疾病發病風險在FⅫ缺乏人群與正常人群之間的區別值得關注. 研究敲除FⅫ基因或 FⅫ 表達抑制對大氣顆粒物調控內源性凝血級聯通路的影響,可為未來衛生干預措施提供依據.

3 結論與展望

a) 血液凝結是大氣顆粒物暴露引發心血管疾病的重要機制. 大氣顆粒物暴露誘發的凝血效應包括凝血結形成、纖維蛋白溶解抑制及血小板活化，三者均與凝血級聯密切相關. 因此，闡明大氣顆粒物暴露誘發凝血級聯活化機制有助于理解凝血效應的產生，進而為未來干預大氣顆粒物引發的心血管疾病提供基礎.

b) 大氣顆粒物暴露可激活凝血級聯通路. 對外源性路徑的影響主要表現為大氣顆粒物誘導起始因子TF表達上調，其主要機制包括炎性反應介導的TF表達增加以及源自循環MPs的血源性TF增加. 對內源性路徑的影響主要表現為大氣顆粒物接觸激活起始因子FⅫ，活化KKS系統，促進凝血酶生成.

c) 盡管已有證據表明大氣顆粒物暴露誘發凝血級聯活化，但相關研究仍需從以下幾個方面加強：①目前多數研究指出，大氣顆粒物暴露后，外源性或內源性凝血級聯通路中少數凝血因子上調，尚需對凝血級聯通路上所有凝血因子分析并展開級聯調控關系驗證. ②大氣顆粒物暴露誘發的凝血級聯是否與正常機體的凝血級聯有所區別，外源性通路與內源性通路之間是否存在聯系，均有待分析研究. ③目前研究結果主要來自動物暴露模型、細胞暴露模型以及體外試驗，而大氣顆粒物暴露誘發凝血因子表達變化的人群流行病學研究仍需加強.