牦牛源正呼腸孤病毒2型的檢測和分離鑒定

呂 珽，陳虹吟，湯 承,2，岳 華,2*

(1.西南民族大學畜牧獸醫學院，成都 610041； 2.動物醫學四川省高校重點實驗室，成都 610041)

哺乳動物正呼腸孤病毒(mammalian orthoreovirus，MRV)屬于呼腸病毒科(Reoviridae)棘突呼腸病毒亞科(Spinareovirinae)正呼腸孤病毒屬(Orthoreovirus)，是一種雙鏈RNA病毒，其宿主譜極為廣泛，可感染豬、牛、綿羊、貓、犬、猴、狒狒、水貂、小鼠與蝙蝠以及人在內的多種哺乳動物，呼吸道和腸道是病毒的主要感染部位[1]。MRV基因組大小約23 500 bp，分10個節段(L1～L3，M1～M3，S1～S4)。S1基因編碼σ1和σ1 s兩個蛋白，σ1為結構蛋白，可決定MRV的血清型，與受體結合、組織嗜性以及血凝反應密切相關[2-3]。根據中和試驗和血凝抑制試驗的結果，MRV可分為4種血清型，其代表株分別為Lang-T1L(MRV-1)、Jones-T2 J(MRV-2)、Dearing-T3D (MRV-3)與Ndelle-T4 N (MRV-4)。由于不同血清型的MRV在S1基因編碼的σ1蛋白中包含特定的氨基酸插入和缺失，導致不同血清型的MRV S1序列相似性較低，因此也可采用S1基因序列的進化分析進行基因分型，其結果與中和試驗和血凝抑制試驗分型結果是一致的[4-7]。

迄今為止，MRV-2已在人、蝙蝠、田鼠、獅子、白尾鹿、豬等多種宿主上發現并分離，具有廣泛的地域分布，包括中國、意大利、斯洛文尼亞等國家[8-12]。MRV-2與多種人類疾病相關，包括呼吸道感染、腦炎和腹瀉[13-14]。2003年，SARS疫情期間，在北京某醫院4例SARS患者的鼻咽拭子中也檢測到MRV-2陽性，這些毒株可能起源于國內的蝙蝠，并可引起獼猴和豚鼠嚴重呼吸道疾病[10-11,15-16]。最近，本實驗室在腹瀉仔豬中分離到MRV-2，分離毒株能引起仔豬嚴重腹瀉[17]。綜上表明，MRV-2毒株可能對人和動物有較強的致病性，其對公共衛生的危害值得關注。

目前，已經有很多牛源MRV病毒株分離的報道，分離毒株均為1型[18-21]。但是還未見MRV-2在牛上的分離報道。牦牛是青藏高原農牧民不可或缺的生產生活資料，由于MRV在牛上的感染普遍，但對牛的危害尚不清楚，因此需要進一步研究。本研究旨在是調查MRV在川西北牦牛上的感染情況，并對病毒進行分離鑒定。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本與細胞系

72份牦牛犢牛腹瀉樣本于2018年6—8月采自川西北15個牧場(若爾蓋縣35份、紅原縣34份、阿壩縣13份)；15份血清樣本為2018年6月采自若爾蓋縣(7份)和紅原縣(8份)的腹瀉牦牛。所有樣本于-80 ℃保存備用。用于分離病毒的Vero細胞系由西南民族大學動物醫學實驗室保存。

1.2 核酸提取

300 μL處理好的樣本按照Trizol試劑說明書提取總RNA，并反轉錄合成cDNA，于-20 ℃保存。

1.3 樣本MRV RT-PCR檢測

采用文獻[22]報道的檢測MRV核酸的RT-PCR方法對提取的核酸樣本進行檢測，靶基因為L1，引物序列：5′-TTCACTCAGGCATTATCCGA-3′(上游引物)；5′-TCCGCTTCTGACTCCTGA-3′(下游引物)，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。陽性PCR產物進行雙向測序。

1.4 陽性樣本血清型鑒定

采用本實驗室建立的RT-PCR方法對MRV核酸陽性樣本進行血清型鑒定：5′-GGTCAAGGATTGGAAAAGACGG-3′(上游引物)，5′-CGAACTTACCAGATGCGAGGA-3′(下游引物)目的片段為601 bp。陽性PCR產物進行雙向測序。

1.5 病毒的分離純化和TCID50測定

將處理好的陽性糞便樣本接種到Vero細胞上，按照本實驗室報道的方法[17]進行病毒的分離純化和TCID50測定。

1.6 病毒鑒定

1.6.1 分離株的RT-PCR鑒定 純化后的病毒液按照“1.3”的方法進行核酸提取，按照“1.4”和“1.5”的方法進行檢測，將PCR產物雙向測序，測序結果進行BLAST比對。

1.6.2 病毒分離株電鏡觀察 收集病毒感染的細胞，1 500 r·min-1離心10 min，棄上清液，加入0.5%戊二醛固定，4 ℃靜置10 min，12 000 r·min-1離心13 min，棄上清，加入3%戊二醛固定液，送至成都里來醫學實驗中心進行透射電子顯微鏡觀察。

1.7 MRV2分離株基因組的擴增

設計29對引物(表1)，對分離株基因組進行分段擴增，對擴增產物進行克隆轉化后交由生工生物工程有限公司測序。用DNAStar 7.0分析序列，ORF Finder工具預測開放閱讀框。

表1 擴增MRV2基因組的引物信息

(轉下頁 Carried forward)

1.8 序列比對和進化分析

利用DNAStar 7.0軟件拼接序列并分析同源性。使用MEGA7.0對S1進行多序列比對，并選取GenBank中登錄的MRV-1、MRV-2、MRV-3代表毒株的S1完整序列，采用最大似然法構建系統發育樹，Bootstrap值為1 000。

2 結 果

2.1 牦牛樣本中MRV的檢測

72份牦牛腹瀉糞便樣本檢測出MRV陽性樣本15份，陽性率為20.83%；15份血清樣本檢出6份陽性，檢出率為40%。6份血清陽性樣本對應的腹瀉糞便樣本中MRV均為陽性。

2.2 臨床樣本中MRV血清型鑒定

采用本實驗室特異性檢測MRV-2的RT-PCR方法，從15份MRV核酸陽性樣本中擴增出9個S1基因片段，來自6個牧場，測序結果經BLAST比對分析，顯示為MRV-2的S1基因片段。6份陽性血清核酸樣本中擴增出的5個S1基因片段，來自3個牧場，測序結果也證實為MRV-2的S1基因片段。

本試驗獲得的14條S1片段核苷酸長度為601 bp(GenBank登錄號：MW149466-MW149479)，序列相似性為89.68%～100.00%，采用最大似然法構建系統發育樹，可見本試驗獲得的14份的陽性樣本S1片段核苷酸與MRV-2毒株聚為一支(圖1)，表明這14個 陽性樣本為MRV-2。

2.3 病毒的分離和純化

陽性樣本接毒24 h后出現細胞死亡，連續傳至第3代后，感染細胞于接毒12 h后出現穩定病變，表現為細胞變形、固縮、聚集、脫落。連續傳至第6代時，收獲病毒液進行噬斑純化獲得1株純化毒株，命名為Yak/AB14/2018，病毒滴度為4×10-8.56TCID50·mL-1。

2.4 病毒分離株的鑒定

2.4.1 RT-PCR鑒定 采用“1.4”和“1.5”的方法檢測分離株，將PCR產物測序，測序結果經BLAST比對分析顯示為MRVL1基因和MRV-2S1基因的目的片段，證明分離獲得了牦牛源MRV-2病毒。

圖1 S1基因片段系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on S1 gene fragment

2.4.2 電鏡觀察 病毒培養物電鏡觀察可見病毒粒子在感染細胞的細胞質內呈典型的晶格狀排列，該病毒無囊膜，直徑約70 nm，與正呼腸孤病毒科病毒的電鏡特征一致(圖2)。

圖2 透射電鏡觀察病毒粒子Fig.2 Particles observed by transmission electron microscope

2.5 MRV-2分離株基因組的擴增和序列分析

使用29對引物分段擴增獲得牦牛源MRV2分離株Yak/AB14/2018基因組，全長23 587 bp，分為10個節段(L1～L3、M1～M3、S1～S4)(GenBank登錄號：MW652775-MW652783，MW149479)，所有病毒基因組中的片段均未檢測到重組事件。10個節段的長度：L1 3 854 bp (1 267 aa)、L2 3 915 bp (1 289 aa)、L3 3902 bp (1 275 aa)、M1 2 304 bp (736 aa)、M2 2 206 bp (708 aa)、M3 2 241 bp (721 aa)、S1 1 434 bp(460 aa)、S2 1 331 bp(418 aa)、S3 1 198 bp (366 aa)、S4 1 196 bp (365 aa)；與4種血清型代表株的核苷酸相似度分別為88.1%～99.9%、74.6～99.6%、83.0%～100.0%、71.1%～99.9%、74.7%～100.0%、83.6～100.0%、38.2～98.8%、82.5～100.0%、84.9～100.0%、76.5%～99.2%；氨基酸相似度分別為96.7%～99.9%，90.6%～99.3%，97.5%～99.9%、79.2%～99.7%、93.9%～100.0%、94.9%～100.0%、16.8%～98.8%、97.1%～100.0%、96.4%～100.0%、96.4%～100.0%。每個基因節段與中國豬源毒株遺傳關系最近，證明本毒株與中國豬源毒株同源。

2.6 MRV-2分離株S1基因的分子特征

Yak/AB14/2018毒株的S1基因與MRV-2毒株的核苷酸相似性59.6%～98.8%，氨基酸相似性54.7%～98.8%，與國內豬源MRV-2分離株(GenBanK登錄號：MN582426)的核苷酸和氨基酸相似性最高，而與其余國內MRV-2毒株的核苷酸相似性為62.2%～65.1%，氨基酸相似性為55.8%～62.0%。與MRV-1毒株的核苷酸相似性為53.5%～54.4%，氨基酸相似性為28.9%～30.7%；與MRV-3的核苷酸相似性為38.2%～39.8%，氨基酸相似性為16.8%～17.3%。

Yak/AB14/2018毒株的S1基因(MW149479)編碼的σ1蛋白和國內豬源MRV-2(MN582426)相比有8個氨基酸突變(R5V、R104G、L142S、A143G、S144F、R217K、P312S、I417V)；這兩個毒株與共同聚為一大支的其余4株MRV-2毒株(AY862138、AY862137、JN799419、KU195673)相比有9個共同的氨基酸突變(N40D、D90 N、D106 N、S154E、K246R、G251R、V301M、D314 N、Q340R)；這一大支的6個毒株與其他MRV-2毒株相比，有43個共同的氨基酸突變。

3 討 論

由于L1在不同血清型的MRV之間最為保守，常用作MRV的分子檢測靶標[23]，本研究采用靶向L1基因的PCR方法，對牦牛腹瀉糞便和血清樣本進行MRV檢測，檢出率為20.83%和40.00%，為當地犢牛腹瀉防控提供參考。同時采用靶向S1的RT-PCR方法對MRV陽性核酸進行血清型分型，但由于S1基因的變異較大，目前，還沒有通用的分型引物，所以采用文獻[21]報道的方法定型失敗，因此自行設計引物進行定型。本試驗從牦牛腹瀉糞便中MRV2的檢出率為12.5%，占MRV陽性樣本的60%，其余陽性樣本定型失敗可能是由于序列變異大，綜上表明，MRV2是當地牦牛MRV的優勢流行株，其生物學意義還需進一步研究。這些牦牛源MRV-2毒株S1基因與國內豬源MRV2毒株(MN582426)、荷蘭人源(AY862138、AY862137)、奧地利豬源(JN799419)、加拿大人源(KU195673)MRV2毒株毒株(圖1)有共同區別于其它MRV-2毒株的氨基酸突變，表明進化樹上這一大支的MRV2毒株具有廣泛的地理分布，其流行和公共衛生意義需要進一步關注。

本試驗從牦牛腹瀉糞便中成功分離到1株MRV-2毒株，這是首次分離到牦牛源MRV-2毒株，為進一步研究其生物學特性奠定了基礎。并成功獲得牦牛源MRV-2毒株的完整基因組，且每個基因節段的序列相似度結果顯示該分離株與國內豬源毒株同源?，F有的資料表明，MRV-2與人的呼吸道疾病、腦炎和腹瀉等有關[13-14]，國內也報道了從兒童的腹瀉糞便樣本和重癥呼吸道病人口咽拭子中分離到MRV-2[9,11,13]，而與Yak/AB14/2018同源的豬源毒株是重配毒株，其L2、S1、S4 3個基因節段與人源毒株同源，所以Yak/AB14/2018是否可感染人進一步研究。該豬源毒株的S3基因來自國內蝙蝠源，這與已有的研究報道蝙蝠可作為移動病毒庫參與MRV在不同物種間循環的推測相符[24]。本分離株在牦牛和豬之間循環時蝙蝠可能起到了一定作用，但其具體方式不清楚，需要在牦牛和豬密度較大的地方開展更多監測活動。

MRVS1基因編碼的結構蛋白σ1具有獨立的宿主細胞結合能力，σ1的結構域介導病毒與細胞表面受體的結合[25]。σ1蛋白尾部插入到病毒衣殼中，起到錨定作用，而頭部和中間部分主要在與受體結合、吸附過程中發揮作用[26,27]。不同血清型的σ1蛋白頭部、體部與頭部結合區域內有42個保守氨基酸位點[28]。與其他MRV-2毒株相比，Yak/AB14/2018有4個獨特的氨基酸突變(G104R、S142L、F144S、S312P)，其中1個(S312P)位于σ1蛋白受體結合區域。這些獨特的氨基酸突變是否與牦牛宿主和青藏高原獨特自然地理環境有關還需要進一步研究。和Yak/AB14/2018聚為同一進化分支的5株毒株(圖1)均為病人和患病動物中分離到，并且這5個毒株氨基酸序列與其他MRV-2毒株相比，在σ1可能的受體結合區域有12個等同的氨基酸突變，其對σ1蛋白功能的影響需要進一步研究證實。

4 結 論

首次從牦牛腹瀉糞便和腹瀉牦牛血清中檢測到MRV，其中MRV-2是優勢毒株，證明MRV可感染牦牛。從腹瀉糞便中成功地分離到1株MRV-2毒株，并成功獲得該毒株完整基因組，其S1基因編碼的蛋白有獨特的氨基酸突變，為進一步研究牛源MRV-2的生物學特性奠定了基礎。本研究結果為深入了解MRV-2的流行病學和遺傳進化提供了參考。