生物信息學(xué)分析骨肉瘤中關(guān)鍵基因及其潛在調(diào)控miRNA

黃漢記 鄭明軍 徐偉華

摘要：目的 篩選出骨肉瘤中關(guān)鍵基因，并進(jìn)一步分析其調(diào)控miRNA，分析其可能的機(jī)制及臨床意義。方法 采用的R語言limma軟件包對miRNA芯片進(jìn)行差異分析，并利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測可能結(jié)合調(diào)控的miRNA。最終利用R語言Upset取各數(shù)據(jù)庫預(yù)測到的miRNA和差異性表達(dá)的miRNA得到的交集作為關(guān)鍵miRNA。結(jié)果 生物信息學(xué)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)EFNA1在骨肉瘤對比成骨細(xì)胞組中顯著高表達(dá)。進(jìn)一步七個不同的數(shù)據(jù)庫預(yù)測EFNA1的上游調(diào)控miRNA，得到唯一的交集為hsa-miR-1915-3p。結(jié)論 EFNA1的高表達(dá)會促進(jìn)骨肉瘤的發(fā)展，而hsa-miR-1915-3p可能是EFNA1的潛在調(diào)控靶點。

【中圖分類號】R730.4 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1673-9026（2021）08-018-01

人骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤之一，其發(fā)病率，死亡率較高和易發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移[1]。?盡管在過去幾十年中，針對OS的治療策略取得了重大進(jìn)展，但由于診斷和轉(zhuǎn)移的發(fā)展延遲，其預(yù)后仍然很差[2]。因此，需要尋找新的生物標(biāo)志物，并確保骨肉瘤患者的有效治療。近幾十年來，研究發(fā)現(xiàn)了一類新的非編碼RNA （ncRNA），如microRNAs （miRNAs）等非編碼RNA[3]。它們都具有不同的調(diào)節(jié)功能，有效地調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的基本蛋白效應(yīng)器，并在骨肉瘤的發(fā)展和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。其中miRNA是非編碼基因中重要的家族，在腫瘤的發(fā)生和OS的發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[4]因此，本文中我們主要探討篩選出關(guān)鍵的靶基因，并進(jìn)一步預(yù)測其可能調(diào)控的miRNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為骨肉瘤的分子標(biāo)志物和臨床治療提供新的視角。

1.方法

1.1數(shù)據(jù)收集

登錄 GEO 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/） ，找出已經(jīng)公布的骨肉瘤基因芯片數(shù)據(jù)集GSE14359（平臺為：GPL96 [HG-U133A] Affymetrix Human Genome U133A Array）。對芯片進(jìn)行整理，共獲得20個數(shù)據(jù)集，18個為骨肉瘤細(xì)胞系數(shù)據(jù)，2個為非腫瘤性成骨細(xì)胞的原代細(xì)胞數(shù)據(jù)。TARGET數(shù)據(jù)庫（https//ocg.cancer.gov/programs/target）是一個兒童腫瘤數(shù)據(jù)庫，從其中下載得到86例具有完整臨床生存信息的表達(dá)譜和臨床信息。GEO與TARGET均為公開的數(shù)據(jù)庫，所以不需要道德委員會批準(zhǔn)。

1.2差異分析

利用R語言軟件包“l(fā)imma”，對數(shù)據(jù)進(jìn)行對比差異分析篩選差異基因。篩選條件為P<0.05，|log2（FoldChange）|>1，隨后得到的差異基因使用火山圖進(jìn)行展示。

1.3差異基因KEGG通路富集

利用R語言軟件包“clusterProfiler”，對得到的差異基因進(jìn)行KEGG通路富集分析。利用R軟件包“org.Hs.eg.db”，“enrichplot”，“ggplot2 “等對基因進(jìn)行注釋，制作氣泡圖進(jìn)行展示。

1.4生存分析

對KEGG通路富集分析中最富集的通路基因，利用TARGET構(gòu)建的生存模型進(jìn)行生存分析。生存分析分組基于對單基因的表達(dá)，以中位數(shù)作為分組依據(jù)分成高表達(dá)組和低表達(dá)組。

1.5基因預(yù)測可能潛在結(jié)合的miRNA

利用miRWalk（http：//zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/index.html），Microt4，miRanda，mirbridge，miRMap，RNAhybrid，Targetscan七個預(yù)測數(shù)據(jù)庫對篩選出的關(guān)鍵基因進(jìn)行預(yù)測可能結(jié)合miRNA。利用R軟件包“UpSet”對七個數(shù)據(jù)庫預(yù)測到的miRNAs進(jìn)行取交集。

2.結(jié)果

2.1篩選差異基因

如圖1所示，結(jié)果差異基因分析，共得到差異基因848個，其中上調(diào)差異基因514，下調(diào)基因334個。

2.2KEGG通路富集分析

利用差異分析得到的848個差異基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果如圖2中A所示。KEGG富集分析結(jié)果顯示，最富集的通路是PI3K-Akt信號通路，共有35個基因富集于此。

2.3生存分析

利用TARGET構(gòu)建的生存模型對富集于PI3K-Akt信號通路的35個基因進(jìn)行生存分析，結(jié)果顯示僅只有一個基因具有顯著性意義（P<0.05）。如圖2中B顯示，EFNA1基因表達(dá)分成高低兩組，其中高表達(dá)組的預(yù)后不良，并且EFNA1屬于上調(diào)差異基因。

2.4靶基因預(yù)測調(diào)控miRNA

通過七個不同的數(shù)據(jù)庫對EFNA1，進(jìn)行預(yù)測可能發(fā)生結(jié)合的miRNA，并且取七者的交集得到一個唯一的miRNA是has-miR-1915-3p，如圖2中C所示。

3.討論

近些年來，隨著高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，生物信息學(xué)被廣泛應(yīng)用于揭示多種癌癥的基因組水平的腫瘤進(jìn)展和癌變的內(nèi)在機(jī)制[5]。值得關(guān)注的是有許多生物信息學(xué)網(wǎng)絡(luò)工具可以幫助我們分析相關(guān)數(shù)據(jù)，并提供標(biāo)準(zhǔn)化和可視化的結(jié)果。現(xiàn)階段，骨肉瘤的微陣列數(shù)據(jù)仍然有限，但可以發(fā)現(xiàn)一些隱藏的、有趣的信息，如骨肉瘤關(guān)鍵基因的表達(dá)[6]、骨肉瘤中的miRNA[7]。

在本研究中，我們從公開的表達(dá)譜數(shù)據(jù)中鑒定了差異表達(dá)的mRNA，并對差異基因進(jìn)行KEGG通路富集分析。PI3K-Akt信號通路被認(rèn)為是人類癌癥中最重要的致癌途徑之一，同時影響著骨肉瘤細(xì)胞的凋亡等進(jìn)程[8，9]。根據(jù)TARGET數(shù)據(jù)庫確定了預(yù)后相關(guān)的差異基因為EFNA1。最近，有研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)EFNA1在乳腺癌對比癌旁中的高表達(dá)于乳腺癌，并對預(yù)后有影響[10]。有研究表明，EphA2 /EFNA1高表達(dá)于肝癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌、前列腺癌、胃腺癌、腦膠質(zhì)瘤、膀胱癌、成骨肉瘤及惡性黑色素瘤等[11] 20種細(xì)胞系中，這于我們的分析結(jié)果所一致。

隨后，進(jìn)一步預(yù)測了可能結(jié)合的miRNA發(fā)現(xiàn)has-miR-1915-3p可能與EFNA1結(jié)合。肺癌細(xì)胞中 miR-1915-3p 的過度表達(dá)可防止細(xì)胞的凋亡[12]。不過在另外一項研究中發(fā)現(xiàn)，與健康志愿者相比，miR-1915-3p的血清水平被調(diào)高，乳腺癌患者的血清水平顯著下降[10]。這兩者之間有不同的結(jié)果，遺憾的是還未見has-miR-1915-3p在骨肉瘤中的表達(dá)是否升高的研究報道，因此有待進(jìn)一步研究。總而言之，本研究的發(fā)現(xiàn)可能為骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制提供新的見解，并提出了值得進(jìn)一步研究的潛在治療靶點。

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基金項目：廣西研究生教育創(chuàng)新計劃項目（編號：YCSW2021138）;