紙基微流控技術(shù)及其在食品安全檢測(cè)中的研究進(jìn)展

李 露，楊金易，徐振林，王 弘，雷紅濤，孫遠(yuǎn)明，沈玉棟

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東省食品質(zhì)量安全實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510642）

隨著生活水平的提高，人們?cè)絹碓阶⒅亟】担称钒踩珕栴}在全世界范圍內(nèi)是一個(gè)非常重要的公共健康問題。近年來，“蘇丹紅”、“三聚氰胺”、“染色饅頭”等食品安全事件不斷，引起人們的強(qiáng)烈關(guān)注。為確保食品的質(zhì)量與安全，發(fā)展高效快速評(píng)估食物產(chǎn)業(yè)鏈潛在有害因素的檢測(cè)方法至關(guān)重要。目前，我國食品安全監(jiān)測(cè)主要采用快速篩查檢測(cè)與大型儀器確證技術(shù)互補(bǔ)模式。大型檢測(cè)儀器如色譜、質(zhì)譜及其聯(lián)用技術(shù)等雖然可以滿足精準(zhǔn)檢測(cè)的要求，但其價(jià)格昂貴、檢測(cè)周期長(zhǎng)、費(fèi)用高，無法適應(yīng)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)［1－3］。快速篩查法作為大型儀器確證技術(shù)的補(bǔ)充，在我國食品安全監(jiān)控中發(fā)揮著越來越重要的作用，主要包括免疫分析技術(shù)［4］、酶抑制法［5］、傳感技術(shù)［6］、光譜檢測(cè)技術(shù)［7］等，通常具有無需大型儀器、成本低、快速、可現(xiàn)場(chǎng)、易于使用等優(yōu)點(diǎn)，已成為人們持續(xù)的研究熱點(diǎn)。然而，目前各單項(xiàng)快速檢測(cè)技術(shù)仍存在需手動(dòng)進(jìn)樣，自動(dòng)化程度低，難以普遍實(shí)現(xiàn)多重多靶標(biāo)分析，消耗試劑多等問題，與現(xiàn)階段我國快速增長(zhǎng)的食品行業(yè)亟待高通量、集成化、微型化檢測(cè)技術(shù)的需求矛盾突出。

2007年，由Martinez等［8］首次提出的微全分析系統(tǒng)（Micro－total－analysis systems，μTAS）（又稱微流控芯片技術(shù)）迅速發(fā)展，成為當(dāng)代前沿整合性平臺(tái)技術(shù)之一，具有消耗試劑少、可自動(dòng)化、多重分析等優(yōu)點(diǎn)，與目前流行的多數(shù)快速檢測(cè)方法相結(jié)合，可將樣品前處理、試劑反應(yīng)、分離檢測(cè)等繁雜的操作集中在微米尺度的芯片上，提供更準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，為食品安全快速檢測(cè)提供了新思路［9－11］。近些年，本課題組也初步開展了食品中農(nóng)獸藥的微流控芯片免疫檢測(cè)方法研究［12］，該方法具有高通量、樣品消耗少、檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。微流控芯片是μTAS的核心技術(shù)之一，為各類快速檢測(cè)技術(shù)提供了微型化和集成化的理想平臺(tái)，可由石英、玻璃、高分子聚合物、紙等多種材料構(gòu)成，其中基于紙張的微流控檢測(cè)平臺(tái)（μPADs）研究報(bào)道較多［13－14］，與通常需要外加泵來控制流體的傳統(tǒng)μTAS相比優(yōu)點(diǎn)突出：①體積小，消耗試劑少；②質(zhì)地柔軟，易與固體物質(zhì)接觸富集分析物；③氣體可透過材料，避免產(chǎn)生氣泡；④可依靠毛細(xì)作用輸送液體；⑤材料成本低，器件制作簡(jiǎn)單；⑥可儲(chǔ)存和運(yùn)輸一定體積的試劑，使用時(shí)無需添加反應(yīng)試劑。基于這些優(yōu)勢(shì)，越來越多的分析方法可在紙基平臺(tái)上實(shí)現(xiàn)，如比色法、電化學(xué)法、化學(xué)發(fā)光法、熒光法等［15］。目前開發(fā)與各種檢測(cè)方法聯(lián)用的紙基微流控設(shè)備已成為研究發(fā)展的趨勢(shì)，μPADs在生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境、臨床分析和化工等領(lǐng)域均被廣泛應(yīng)用［16－17］，其低成本、高靈敏、非專業(yè)人員可使用并快速獲得檢測(cè)結(jié)果的優(yōu)勢(shì)，使之在食品安全方面也具有巨大的發(fā)展空間和潛力，成為將傳統(tǒng)快速檢測(cè)技術(shù)集成化的理想選擇。

μPADs技術(shù)的基本工作原理（圖1）是在親水紙基上制作圖案化的疏水屏障，形成毛細(xì)管微流通道，以控制微量液體流動(dòng)。其技術(shù)要點(diǎn)在于紙芯片的制備及流量的控制，這將影響流體通道構(gòu)建、樣品前處理過程及檢測(cè)通量等問題，另外，檢測(cè)方法將決定檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度。因此，本文從技術(shù)層面對(duì)紙芯片制備、流體操控及檢測(cè)模式進(jìn)行了介紹，并綜述了μPADs在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展，提出了目前在食品行業(yè)未來面臨的挑戰(zhàn)和今后的發(fā)展趨勢(shì)。

圖1 基于紙張微流體通道示意圖［14］Fig.1 Schematic diagram of a paper-based microfluidic channel［14］

1 紙基微流控芯片的制備

1.1 紙基微流控芯片功能化改性

紙基微流控芯片以濾紙、石墨紙、色譜紙等多孔膜為材料，這類材料由純纖維組成，表面含有豐富的羥基，具有高親水性，能夠進(jìn)行功能化修飾，是運(yùn)輸流體和固定生物分子的理想材料。目前大多采用化學(xué)改性方法或物理沉積技術(shù)堵塞纖維素紙內(nèi)的孔隙來改變親水性纖維的物質(zhì)特征，從而建立疏水屏障，形成限定的親水毛細(xì)管通道，達(dá)到運(yùn)輸流體的目的，功能化改性方法包括光刻法、蠟染、噴墨打印、絲網(wǎng)印刷、柔性版印刷、3D打印、壓花、聚二甲基硅氧烷（PDMS）屏蔽法等［18－19］，Ganesan等［14］進(jìn)行了較全面的總結(jié)（圖2）。基于紙基微流控芯片的食品安全檢測(cè)分析方法，通常需在親水纖維素上固定生物傳感分子，迄今為止有物理吸附、包埋法及化學(xué)固定3種方式［20］。物理吸附主要取決于范德華力和靜電作用，將生物分子通過浸泡或涂刷的方式直接沉積在紙張表面［21］。包埋法是通過溶膠-凝膠法將生物分子包埋在特定基質(zhì)中，以凝膠中形成的二氧化硅層為媒介將傳感材料固定在紙纖維上［22］。化學(xué)固定主要依靠生物分子和纖維素之間穩(wěn)定的共價(jià)鍵，共價(jià)固定的方式大多基于纖維素羥基的化學(xué)修飾，如二乙烯砜化［23］、醛基和羧基化［24－25］、4-疊氮-1-氟-2-硝基苯化［26］、環(huán)氧化［27］等各種表面功能化。但紙基表面纖維素化學(xué)結(jié)構(gòu)具有差異性，羥基的類型和位置各有不同，將影響其可及性和反應(yīng)性，通常C3位的羥基活性最低，而C2和C6位的羥基活性最強(qiáng)。B?hm等［28］開發(fā)了一種基于光交聯(lián)聚合物涂層的方法用于纖維表面改性，不依賴于纖維表面的OH基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)了酶在紙纖維上的共價(jià)附著。

圖2 紙基微流控裝置的表面改性技術(shù)［14］Fig.2 Surface modification of paper-based microfluidic devices［14］

1.2 紙基微流控芯片的構(gòu)造

根據(jù)流體流動(dòng)的方向（水平或垂直水平方向），紙基微流控芯片可大致分為二維（2D）和三維（3D）。通過上述表面改性方法制備的平面紙基微流控芯片可視為2D μPADs，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單易得，但使用效果不佳，流體在通道中的滲透、揮發(fā)及粘滯力會(huì)導(dǎo)致傳送率降低，干擾檢測(cè)結(jié)果，無法滿足高通量現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)需求［29－31］。而三維紙基微流控裝置（3D μPADs）可使流體在垂直和水平方向上分布，將錯(cuò)綜復(fù)雜的通道網(wǎng)絡(luò)連接到統(tǒng)一測(cè)試區(qū)域，實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)多種物質(zhì)的目標(biāo)，具有低成本、簡(jiǎn)單和靈活的優(yōu)點(diǎn)。3D μPADs的制備主要通過堆疊和折紙的方法獲得，如Andres等［32］設(shè)計(jì)了一種利用紙和雙面膠帶分層制作三維微流控裝置的方法（圖3），該方法通過交叉堆疊的方式將切割成相同尺寸的紙層與膠帶層組裝成三維裝置，使得試劑可通過在紙上自驅(qū)動(dòng)相互作用實(shí)現(xiàn)多重分析。Xie等［33］開發(fā)了一種使用PDMS涂布可折疊掩膜的3D紙基微流控芯片，將色譜紙插入具有特定圖案的PDMS折疊膜形成夾層結(jié)構(gòu)，構(gòu)造清晰的通道，具有簡(jiǎn)單、省時(shí)、環(huán)保、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、材料易獲取等優(yōu)點(diǎn)。

圖3 三維紙基微流控芯片示意圖［32］Fig.3 Schematic diagram of 3D μPADs［32］

2 流體在紙基材料上的運(yùn)輸

2.1 運(yùn)輸機(jī)理

紙基微流控芯片毛細(xì)管通道孔徑小、纖維長(zhǎng)度短，雷諾數(shù)低，流體的粘性力占主要地位，使流體呈層流狀態(tài)運(yùn)動(dòng)［34－35］。

流體正處于緩慢滲透紙張的狀態(tài)為不完全浸濕階段。此時(shí)，多孔網(wǎng)絡(luò)中的流體可看作一維流體，即只有長(zhǎng)度而沒有寬度和高度，其傳輸過程遵循Washburn方程［36］：其中，L為流體滲透距離；t為時(shí)間；D為平均毛細(xì)管半徑；γ為液體的表面張力；μ為流體粘度；θ為流體和邊界壁之間的夾角。由方程可知，流體的表面張力有利于液體滲入紙層，而流體的粘性阻力與速度成正比，且隨流體移動(dòng)距離的增加而增加，導(dǎo)致流體穿過多孔介質(zhì)時(shí)流速降低。此方程忽略不計(jì)引力、蒸發(fā)效應(yīng)和疏水邊界對(duì)毛細(xì)管流的影響，具有一定的局限性，僅能用于一維流體，不適用于可變橫截面的紙條。且在潤濕過程中纖維會(huì)發(fā)生膨脹，流體在纖維內(nèi)的流動(dòng)，也將影響流體的滲透距離，因此通常情況下流體滲透距離預(yù)測(cè)結(jié)果偏大于實(shí)際值［37－38］。

流體充滿紙基材料，通過毛細(xì)作用運(yùn)輸時(shí)為完全浸濕階段。流體在等寬直紙道中流動(dòng)可用達(dá)西定律描述［39］：Q=-κWHΔP/μL，式中Q為容積流量，κ為紙張滲透性，WH為紙張垂直流動(dòng)的橫截面積，μ為動(dòng)態(tài)粘度，ΔP為沿流線在通道長(zhǎng)L處發(fā)生的壓降。在N個(gè)連通的不同寬度的直流道中，流體通過每個(gè)通道的試劑流量相同，時(shí)間t=V/Q，V為通道體積，將Q帶入可得：

假設(shè)滲透率、粘度和壓差恒定，則流體在兩個(gè)紙帶中傳輸時(shí)間由紙帶的幾何性質(zhì)決定。兩個(gè)矩形紙帶組成的通道（這兩個(gè)矩形紙帶的長(zhǎng)度分別為L(zhǎng)1和L2、寬度分別為W1和W2），流體的輸送時(shí)間為t=當(dāng)方程中L1＝L2時(shí)，W2/W1比例越大，流體的運(yùn)輸時(shí)間越長(zhǎng)。

2.2 流量控制方法

實(shí)際應(yīng)用中，對(duì)食品中有害物質(zhì)的復(fù)雜分析將會(huì)增加試劑數(shù)量和洗滌步驟，亟待開發(fā)更智能化的紙基流體操控技術(shù)，這些技術(shù)可將試劑和樣品在適當(dāng)?shù)臋z測(cè)時(shí)間內(nèi)輸送到相應(yīng)區(qū)域。根據(jù)有無外部輸入設(shè)備可將μPADs分為被動(dòng)和主動(dòng)裝置。被動(dòng)裝置依靠毛細(xì)作用輸送流體無需額外設(shè)備，簡(jiǎn)單易制造，但流量控制精度低。主動(dòng)裝置依賴于外部輸入系統(tǒng)，能夠達(dá)到多步驟精確控制流體流量的目的［40］。

被動(dòng)式流體控制裝置可通過化學(xué)處理紙張或改變紙張的形狀來控制流體。有實(shí)驗(yàn)將稀釋的蔗糖溶液鋪在紙板上做干燥處理以延遲液體流動(dòng)，不同濃度的樣品溶液溶解蔗糖能力不同，導(dǎo)致流體粘度發(fā)生變化，從而實(shí)現(xiàn)延遲效應(yīng)［41］。Houghtaling等［42］在紙通道內(nèi)建立可溶解橋，切斷流體流動(dòng)以調(diào)節(jié)流量。另外，還可通過改變紙張形狀來調(diào)整流體流量，如Fu等［43］設(shè)計(jì)了3組實(shí)驗(yàn)來說明多孔介質(zhì)中流體在紙上的滲透過程（圖4）。當(dāng)紙帶寬度不同時(shí)，流體滲透速度相同，流體輸送量與紙帶寬度成正比；當(dāng)流體滲透到由窄變寬的過渡段時(shí)，流體的滲透速度明顯增加，過渡段位置在紙片總長(zhǎng)度的二分之一處時(shí)，流體滲透時(shí)間最短；當(dāng)流體滲透到由窄變寬的過渡段時(shí)，違反了恒截面Washburn方程，流體的滲透速度明顯減慢。目前關(guān)于無閥紙基材料上的流體操縱技術(shù)已有不少研究可供參考［44－45］。

圖4 改變紙條幾何形狀制備的紙基芯片［43］Fig.4 A paper-based chip prepared by changing the strip geometry［43］

與被動(dòng)裝置相比，主動(dòng)運(yùn)輸裝置需要外部輸入和附加設(shè)備，具有可編程性、可再現(xiàn)性、多種操作的優(yōu)點(diǎn)。Koo等［46］利用電潤濕現(xiàn)象在微流控裝置中實(shí)現(xiàn)了對(duì)流體的控制，主要將聚四氟乙烯疏水導(dǎo)電電極和親水導(dǎo)電電極印刷于紙上，通過施加電壓破壞疏水電極的氟化層，使樣品試劑從親水電極透過后到疏水電極停止，直接控制流體流動(dòng)，實(shí)現(xiàn)了食源性病原體釀酒酵母的檢測(cè)。Rosenfeld等［47］則利用電滲泵（EO）通過施加電壓創(chuàng)建可逆性調(diào)節(jié)閥門來實(shí)現(xiàn)加速或延遲流體的運(yùn)輸。而Qi等［48］將熒光檢測(cè)與分子印跡技術(shù)結(jié)合在旋轉(zhuǎn)芯片上測(cè)定了4-硝基酚（4-NP）和2，4，6-三硝基酚（TNP）兩種酚類污染物，該旋轉(zhuǎn)閥可360°旋轉(zhuǎn)控制流體流動(dòng)，同時(shí)增加芯片空間利用率，實(shí)現(xiàn)了多路檢測(cè)（圖5）。另外，對(duì)于利用機(jī)械驅(qū)動(dòng)的有閥裝置，常采用可膨脹材料、電磁閥、壓力閥和可重新配置的流量開關(guān)來操縱流體。有研究利用海綿的可膨脹性使得與海綿相關(guān)聯(lián)的通道連接到另一個(gè)通道，從而控制流體的傳送［49］。Kim等［50］研究了一種依靠螺線管驅(qū)動(dòng)的壓力閥，通過向螺線管制動(dòng)器施加電壓增加對(duì)紙條的壓力，從而延遲流體流動(dòng)。壓力驅(qū)動(dòng)閥門系統(tǒng)采用Arduino微處理器實(shí)現(xiàn)了可編程可重復(fù)的流體控制。一般基于主動(dòng)運(yùn)輸?shù)挠虚y裝置具有精確控制流體流量及方向的優(yōu)點(diǎn)，但需額外的機(jī)械或外部系統(tǒng)可能導(dǎo)致成本及復(fù)雜性增加而影響實(shí)用性。

圖5 基于旋轉(zhuǎn)閥的紙基微流控裝置［48］Fig.5 μPADs based on rotary valve［48］

3 μPADs檢測(cè)技術(shù)

3.1 比色法

比色法的原理是通過毛細(xì)管作用將分析溶液運(yùn)輸?shù)皆囼?yàn)區(qū)，與精確裝載的傳感材料發(fā)生顏色反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)可視化定性或定量分析。根據(jù)分子相互作用的類型，比色傳感可被分為生物傳感和化學(xué)傳感。生物分子傳感包括酶、抗體、抗原、微生物、細(xì)胞、核酸等生物活性物的檢測(cè)，常用的傳導(dǎo)材料有酶、氧化還原指示劑和納米顆粒。例如Nouanthavong等［51］利用有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)固定化乙酰膽堿酯酶的抑制作用，開發(fā)了一種納米顆粒包裹的μPADs傳感器以提高檢測(cè)靈敏度，可用于食品中甲基對(duì)氧磷和毒死蜱殘留的比色檢測(cè)，檢測(cè)限分別為18 ng/mL和5.3 ng/mL，對(duì)加標(biāo)白菜和干貝中甲基對(duì)氧磷的回收率均在95%左右（圖6）。化學(xué)分子的傳感可分為有機(jī)化合物、重金屬離子、易爆物和有毒氣體的檢測(cè)，常用的化學(xué)反應(yīng)染料有路易斯酸/堿性染料、布隆斯特德酸/堿性染料、溶劑變色染料和金屬卟啉等，可對(duì)不同分析物顯示不同的顏色。貴金屬納米顆粒（如金、銀、銅）因其獨(dú)特的表面等離子體共振特性可被用于重金屬的檢測(cè)，主要通過納米顆粒的聚集或分解導(dǎo)致表面等離子體共振特性發(fā) 生 變 化 實(shí) 現(xiàn) 信 號(hào) 輸 出［52－53］。Chen等［54］借 助Janovsky顏色反應(yīng)原理開發(fā)了食品中常用添加劑苯甲酸的μPADs檢測(cè)平臺(tái)，并制備了一套由微型加熱儀、檢測(cè)盒和智能手機(jī)組成的便攜式檢測(cè)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了多樣品檢測(cè)目的，但有時(shí)背景紙張顏色或照明可能會(huì)導(dǎo)致自動(dòng)讀數(shù)出現(xiàn)偏差。

圖6 基于納米顆粒對(duì)有機(jī)磷殺蟲劑的紙基微流控比色檢測(cè)系統(tǒng)［51］Fig.6 Paper-based microfluidic colorimetric detection system for organophosphorus insecticides based on nanoparticles［51］

3.2 電化學(xué)法

電化學(xué)檢測(cè)需在紙基表面制造敏感電極，然后在電極上固定生物活性分子，使其具備捕獲目標(biāo)分子的能力。敏感電極可將待測(cè)物質(zhì)與固定化生物分子之間發(fā)生相互作用時(shí)所產(chǎn)生的生物化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為電流、電勢(shì)、阻抗等電信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)定性或定量檢測(cè)。通常具有氧化活性的生物分子或重金屬可使用安培法和伏安法引起電流響應(yīng)直接進(jìn)行鑒定。Shi等［55］通過方波陽極溶出伏安法（SWASV）對(duì)污染水樣中的Pb和Cd進(jìn)行直接定量測(cè)試，檢測(cè)限分別為2.0 ng/mL和2.3 ng/mL，該方法極大地增強(qiáng)了電化學(xué)信號(hào)，對(duì)蘇打水碳酸飲料和地下水等實(shí)際樣品也表現(xiàn)出優(yōu)良的分析性能。而針對(duì)多種電位相似的氧化還原活性分析物，可在工作電極中加入貴金屬類及石墨烯類納米材料，通過其不同電催化特性，將氧化作用轉(zhuǎn)移到較低的電位，促進(jìn)信號(hào)分離。例如，抗壞血酸和多巴胺的氧化峰電位經(jīng)常重疊在未修飾的電極上［56］，阻礙了兩種分析物準(zhǔn)確測(cè)定，Sun等［57］通過使用石墨烯/鉑納米復(fù)合材料修飾電極，使抗壞血酸峰向較低的氧化電位轉(zhuǎn)移，分離了抗壞血酸和多巴胺。另外，檢測(cè)抗體或核酸等這類氧化還原活性不高的分子時(shí)，可用電化學(xué)親和法，此方法基于生物識(shí)別元件與目標(biāo)分子結(jié)合產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)變化來實(shí)現(xiàn)定量分析。Jyoti等［58］開發(fā)了一種快速、低成本檢測(cè)金黃色葡萄球菌的紙基電化學(xué)免疫傳感器（圖7），實(shí)驗(yàn)將金黃色葡萄球菌抗體（Ab）－單壁碳納米管（SWCNT）生物偶聯(lián)物固定在工作電極上，通過分析抗原-抗體復(fù)合物形成后的峰電流值變化定量檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌的含量。該免疫傳感器峰電流的增加與金黃色葡萄球菌濃度對(duì)數(shù)呈良好的線性關(guān)系（r2=0.976），對(duì)加標(biāo)牛奶樣品進(jìn)行快速檢測(cè)（30 min），檢出限為13 CFU/mL。電化學(xué)檢測(cè)具有便攜、簡(jiǎn)單、選擇性高、靈敏度好、電耗低、儀器設(shè)備少等特點(diǎn)，不易受照明條件、紙的基質(zhì)效應(yīng)和樣品顏色引起的背景干擾，同時(shí)紙的粗糙度和孔隙率可使沉積材料的表面積增加，改善傳感器的響應(yīng)，靈敏度高。但也存在不足，如制備微電極增加了檢測(cè)成本，但可通過印刷技術(shù)的進(jìn)步和納米粒子或?qū)щ娪湍夹g(shù)降低成本。

圖7 電化學(xué)紙基傳感系統(tǒng)的原理圖［58］Fig.7 Schematic diagram of electrochemical paper-based sensing system［58］

3.3 化學(xué)發(fā)光法與電化學(xué)發(fā)光法

化學(xué)發(fā)光是反應(yīng)物基態(tài)分子吸收化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的能量后，躍遷到激發(fā)態(tài)，處于激發(fā)態(tài)的中間體不穩(wěn)定，將由激發(fā)態(tài)回到基態(tài)，此時(shí)會(huì)釋放等能量的光子，再對(duì)其發(fā)光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定從而實(shí)現(xiàn)定量分析，主要用發(fā)光劑標(biāo)記抗原或抗體等生物分子，再固定到紙芯片檢測(cè)區(qū)域?qū)Ψ治鑫餀z測(cè)［59］（圖8）。常用的化學(xué)發(fā)光劑有吖啶酯、三聯(lián)吡啶釕、魯米諾等，此類物質(zhì)發(fā)生氧化還原后發(fā)光，可由集光器和光電倍增管接收單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的光子，得到分析物濃度。電化學(xué)發(fā)光是化學(xué)發(fā)光過程的一種衍生［60］，其中信號(hào)是通過電化學(xué)電勢(shì)來啟動(dòng)和控制化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，與化學(xué)發(fā)光檢測(cè)相比，更容易實(shí)現(xiàn)時(shí)間控制的信號(hào)捕獲，而且檢測(cè)靈敏度高。Xu等［61］開發(fā)了一種基于比色法和電化學(xué)發(fā)光雙模式檢測(cè)Pb2+的紙基裝置，測(cè)定了加標(biāo)自來水和河水等復(fù)雜樣品基質(zhì)中的Pb2+含量，回收率分別為96.7%～97.6%和96.1%～99.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.0%～5.3%和2.2%～5.3%，方法具有良好的可靠性和準(zhǔn)確性。

圖8 制作用于H-FABP、CTnl和copeptin多重CL免疫分析的3D μPAD的示意圖［59］Fig.8 Schematically illustration for the fabrication of the 3D μPAD for multiplexed CL immunoassay of H-FABP，CTnl and copeptin［59］

3.4 熒光法

熒光法利用目標(biāo)分子和熒光劑之間的相互作用，用特定波長(zhǎng)的光源來誘導(dǎo)熒光探針發(fā)光，再將產(chǎn)生的光進(jìn)行過濾處理，將發(fā)射光子與激發(fā)光子隔離開來，對(duì)光強(qiáng)進(jìn)行量化以測(cè)量分析物濃度，傳感機(jī)制主要基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）［62］、光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET）［62］和熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）［63］等多種模式（圖9）。作為信號(hào)轉(zhuǎn)換的熒光團(tuán)，被目標(biāo)分子識(shí)別后光物理特性會(huì)發(fā)生改變，從而改變熒光信號(hào)的輸出形式。目前，報(bào)道的發(fā)光材料有金屬納米粒子、量子點(diǎn)和鑭系結(jié)合的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米顆粒［64］，可采用紫外燈實(shí)現(xiàn)可視化半定量檢測(cè)或熒光讀數(shù)儀定量檢測(cè)，靈敏穩(wěn)定，且易實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)。但使用紙張作為基底，其本身在紫外光下將產(chǎn)生額外的熒光信號(hào)，增大了背景干擾，影響檢測(cè)準(zhǔn)確率，需采用有效技術(shù)策略克服干擾，改善準(zhǔn)確性。

圖9 熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）［63］Fig.9 Fluorescence resonance energy transfer(FRET)［63］

如今，納米顆粒檢測(cè)、拉曼光譜等技術(shù)也開始應(yīng)用于μPADs平臺(tái)［65－66］。隨著技術(shù)的創(chuàng)新與發(fā)展，紙基微流控設(shè)備在食品安全領(lǐng)域有巨大潛力，并彰顯出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是一種可用于現(xiàn)場(chǎng)診斷和化學(xué)分析進(jìn)而替代傳統(tǒng)免疫分析的方法。

4 μPADs在食品安全檢測(cè)中應(yīng)用

4.1 μPADs在食品有害小分子檢測(cè)中的應(yīng)用

Ma等［67］結(jié)合比色法建立了一種快速檢測(cè)牛奶中克倫特羅的紙基微流控酶聯(lián)免疫分析方法（μPADs－ELISA）。實(shí)驗(yàn)發(fā)揮紙張的固有特性，利用纖維素纖維夾帶抗體，研究抗體固定模式，通過比色分析得到牛奶中鹽酸克侖特羅的檢出限（LOD）為0.2 ng/mL，驗(yàn)證了μPADs可作為96孔酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)微板的替代品用于食品安全監(jiān)測(cè)，彌補(bǔ)了ELISA不便用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的缺點(diǎn)。Wang等［68］合成了抗有機(jī)磷農(nóng)藥敵敵畏（DDV）的分子印跡聚合物層（MIP），并將其電聚合在金納米顆粒（AuNP）修飾的紙基芯片上，提出將MIP引入μPADs電化學(xué)檢測(cè)方法；同時(shí)，他們還基于MIP的紙張建立了多孔微流通道，進(jìn)行2，4-二氯苯氧乙酸的靈敏和特異性化學(xué)發(fā)光檢測(cè)［69］，實(shí)現(xiàn)了多重分析的目的。Liu等［70］則介紹了另一種用于檢測(cè)DDV的MIP紙基化學(xué)發(fā)光敏感芯片。分析物DDV與MIP結(jié)合可被過氧化氫（H2O2）氧化成不穩(wěn)定的過氧磷酸鹽中間體，從而與魯米諾反應(yīng)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光信號(hào)，提高檢測(cè)靈敏度及特異性，該方法已成功對(duì)蔬菜中DDV進(jìn)行了測(cè)定，檢測(cè)限達(dá)0.8 ng/mL。另外，他們還開發(fā)了可將水溶性金屬離子、蔬菜中的維生素與DDV分離的化學(xué)發(fā)光紙芯片，該方法的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是可用于真實(shí)樣品的分析，且無需復(fù)雜的前處理過程。Apilux等［71］開發(fā)了一種快速篩查有機(jī)磷酸酯（OP）和氨基甲酸酯（CM）農(nóng)藥的折紙裝置，并在復(fù)蓋片上設(shè)計(jì)了緩沖載孔，以促進(jìn)包被底物與固定化酶的相互作用，提高了傳感器分析性能，該裝置對(duì)呋喃、敵敵畏、西維因、對(duì)氧磷和吡米卡的檢測(cè)限分別為0.003、0.3、0.5、0.6和0.6 ng/mL。在食品添加劑方面，He等［72］提出一種利用疏水硅烷與紙纖維耦合，采用紫外光光刻技術(shù)制備紙基微流控器件的新方法，基于Griess顯色法對(duì)食品樣品中亞硝酸根離子進(jìn)行了定量比色分析，該方法可在幾分鐘內(nèi)建立濾紙的疏水屏障與親水通道，比傳統(tǒng)的光刻膠或蠟染的物理沉積方法更耐受有機(jī)試劑侵蝕，且親水疏水介質(zhì)均適用。

4.2 μPADs在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用

目前，基于μPADs的致病菌檢測(cè)主要依據(jù)酶活性進(jìn)行免疫分析實(shí)現(xiàn)。Bledar等［73］基于細(xì)菌與生物識(shí)別元素（通常是一種酶）之間相互作用可發(fā)生顏色反應(yīng)，使用嵌入細(xì)菌指示底物的μPAD通過比色法檢測(cè)農(nóng)業(yè)用水中的目標(biāo)細(xì)菌，成功在低至0.1 CFU/mL的水平檢出單核增生李斯特菌、O157∶H7大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌，但存在由背景微生物群產(chǎn)生的酶或比色基質(zhì)降解導(dǎo)致假陽性的風(fēng)險(xiǎn)。Park等［74］提出的另一種方法是使用抗體偶聯(lián)的聚苯乙烯納米顆粒檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌，將細(xì)菌添加到紙基設(shè)備上與聚苯乙烯珠共軛的抗體特異性結(jié)合，引起免疫凝集增加，改變光強(qiáng)，使用便攜式手機(jī)測(cè)定測(cè)量光散射強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。該方法可通過改變抗體和重新優(yōu)化流體的物理及化學(xué)參數(shù)實(shí)現(xiàn)食品中多種病原體的檢測(cè)。Ma等［75］采用絲網(wǎng)印刷法制備了紙芯片，通過銀增強(qiáng)技術(shù)放大可視化免疫分析結(jié)果，對(duì)水樣中的細(xì)菌（大腸桿菌）進(jìn)行了現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，通過校正銀斑的灰度值與細(xì)菌數(shù)的對(duì)數(shù)值，定量測(cè)定了水樣中大腸桿菌的密度。Saravanan等［76］將紙張基板的疏水性與電極的電化學(xué)功能化相結(jié)合用于檢測(cè)水中致病菌，在疏水性紙張上利用絲網(wǎng)印刷技術(shù)構(gòu)建碳電極，然后將Concanavalin A（Con A）生物識(shí)別元件修飾電極作為探針，通過選擇性地與細(xì)菌細(xì)胞上的單糖和寡糖相互作用，實(shí)現(xiàn)了基于阻抗傳感模式的活細(xì)菌數(shù)檢測(cè)，靈敏度達(dá)1.9×103CFU/mL。

4.3 μPADs在重金屬檢測(cè)中的應(yīng)用

近年來，水和土壤污染嚴(yán)重，并遷移至食物鏈而蓄積于人和動(dòng)物體內(nèi)，與蛋白質(zhì)結(jié)合使其失活，產(chǎn)生毒害作用。因此，開發(fā)有效靈敏的重金屬檢測(cè)方法至關(guān)重要［77］。Sun等［78］發(fā)明了一種旋轉(zhuǎn)裝置安裝到紙基設(shè)備中以控制流體流動(dòng)，有效避免了比色劑的隨機(jī)擴(kuò)散，實(shí)現(xiàn)了對(duì)水中Ni2+、Cu2+和Cr6+的多重比色檢測(cè)，檢測(cè)限分別為4.8、1.6、0.18 mg/L。Liu等［79］設(shè)計(jì)了T型紙張流道，將帶正電的聚乙烯亞胺（PEI）和Cu2+分別在兩個(gè)通道驅(qū)動(dòng)，在電場(chǎng)作用下，最終在同一張紙上的射流通道相遇，形成深藍(lán)色的正電絡(luò)合物，實(shí)現(xiàn)了PEI與Cu2+的在線復(fù)合反應(yīng)；并利用電場(chǎng)放大效應(yīng)增強(qiáng)色帶，通過智能手機(jī)對(duì)飲用水中的Cu2+進(jìn)行比色檢測(cè)，檢測(cè)限達(dá)30 μmol/L。另外，利用納米材料的熒光和比色特性，將納米材料導(dǎo)入傳感平臺(tái)，與金屬離子結(jié)合增強(qiáng)發(fā)光效應(yīng)，也是一個(gè)不錯(cuò)的思路。Zhang等［80］開發(fā)了熒光標(biāo)記功能單鏈DNA（ssDNA）的氧化石墨烯紙基微流控傳感器，在紙基材料上通過物理吸收促進(jìn)了傳感器的集成，避免了復(fù)雜的表面處理和探針固定化。該裝置利用易于合成和修飾的功能性核酸，擴(kuò)大了化學(xué)兼容性，可直接檢測(cè)抗體等化學(xué)污染物，實(shí)驗(yàn)對(duì)食品中的Hg2+、Ag+和氨基糖苷類抗生素殘留進(jìn)行了多重檢測(cè)，平均回收率為87.5%～116%，符合復(fù)雜基質(zhì)樣品中痕量物質(zhì)的檢測(cè)要求。Ji等［81］利用量子點(diǎn)（QDs）的光學(xué)特性，并結(jié)合離子印跡技術(shù)（IIP）制備了一款3D μPAD，實(shí)現(xiàn)了QDs＠IIPs從液相檢測(cè)模式到固相檢測(cè)的轉(zhuǎn)變，提高了裝置的便攜性。該平臺(tái)可同時(shí)定量檢測(cè)Cu2+和Hg2+，Cu2+印跡熒光傳感器線性范圍為0.11～58.0 μg/L，檢測(cè)限為0.035 μg/L，Hg2+線性范圍為0.26～34.0 μg/L，檢測(cè)限為0.056 μg/L。

5 總結(jié)與展望

近十年來，紙基微流控技術(shù)被科研人員大量研究，廣泛應(yīng)用于生化分析、醫(yī)療診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域，其成本低廉、反應(yīng)靈敏、非專業(yè)人員可使用并快速獲得檢測(cè)結(jié)果的優(yōu)勢(shì)，也使之成為食品安全快速檢測(cè)方面的研究熱點(diǎn)。但紙基微流控技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，仍存在一些問題亟待解決：①紙張潤濕條件和液體輸送速度，會(huì)使樣品蒸發(fā)或殘留導(dǎo)致輸送量降低；②紙基芯片結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)關(guān)系到檢測(cè)效率、靈敏度及特異性；③大多數(shù)研究仍停留在實(shí)驗(yàn)室階段，缺乏市場(chǎng)化應(yīng)用；④針對(duì)μPADs自動(dòng)進(jìn)樣的研究較少，多數(shù)報(bào)道的是紙基微流控芯片的制備方法和測(cè)定方法。因此，實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單、低成本、實(shí)用的紙基微流控芯片的制造仍具挑戰(zhàn)性。

未來紙基微流控技術(shù)擁有成熟的技術(shù)后，有望為食品安全分析提供一個(gè)具有多種新功能的平臺(tái)，具備多重分析的能力；樣品預(yù)處理能力；儲(chǔ)存、組合試劑的能力；能夠從未知的樣品量出發(fā)，自動(dòng)分析控制進(jìn)樣量的能力。雖然μPADs技術(shù)不夠成熟，但仍在不斷改進(jìn)，隨著新型紙基材料的開發(fā)和各項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，其在食品安全領(lǐng)域?qū)⒂芯薮鬂摿Α?/p>