香稻Badh2 基因單倍型及香氣成分2-乙酰-1-吡咯啉代謝通路的研究進展

潘陽陽，黃道強，王重榮，李 宏，周德貴，王志東，陳宜波，趙 雷，龔 蓉，周少川

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所/廣東省水稻育種新技術(shù)重點實驗室，廣東 廣州 510640）

香米在蒸煮過程中會散發(fā)出令人愉悅的獨特香味，被譽為水稻中的珍品，具有較高的經(jīng)濟價值。而稻米香味是國際市場上決定香米價格的重要因素之一［1］，優(yōu)質(zhì)香米價格是非香稻的3 倍之多［2］。傳統(tǒng)香稻品種具有很強的地域特性，泰國的茉莉香米、印度與巴基斯坦的巴斯馬蒂香米長期占據(jù)國際香米市場主要份額，近年來越南、柬埔寨等國的優(yōu)質(zhì)香米出口量也在不斷加大。我國作為全球最大的稻米生產(chǎn)國和消費國［3］，市場供需不平衡，每年需進口一定數(shù)量的優(yōu)質(zhì)香米以滿足國內(nèi)高端市場需求。因此，加強香稻品種選育，打造我國香米品牌以取代泰國香米，對于提升我國香米國際影響力具有重要的經(jīng)濟和社會效益。

我國具有豐富的香稻資源，香稻種植歷史可以上溯到3 000 多年前。由于香稻多為地方性品種，兼受產(chǎn)量、抗性和改良技術(shù)等條件限制，導(dǎo)致我國香稻生產(chǎn)長期不被重視［4-5］。當(dāng)前，我國稻米消費市場面臨轉(zhuǎn)型升級，優(yōu)質(zhì)且具有香味的大米深受市場青睞，水稻育種由注重產(chǎn)量向產(chǎn)量品質(zhì)并重的方向轉(zhuǎn)型。2018—2020 年，全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心連續(xù)3 年舉辦全國優(yōu)質(zhì)稻品種食味品質(zhì)鑒評會，有力推動我國水稻育種向優(yōu)質(zhì)稻育種方向轉(zhuǎn)型。

香味物質(zhì)的挖掘和香味基因的遺傳調(diào)控是香稻育種的兩個根本問題，長期以來備受關(guān)注。前人在稻米中發(fā)現(xiàn)了上百種揮發(fā)性香味化合物［6-9］，隨著檢測技術(shù)水平的提高和研究的不斷深入，1983 年2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline，2AP）被確認(rèn)為稻米特征香氣成分［10］。水稻香味基因的遺傳研究起始于20 世紀(jì)70 年代，早期研究推斷香味基因可能由單個［11］、2 個［12］或3 個［13］隱性基因控制。隨著分子標(biāo)記技術(shù)和水稻功能基因組學(xué)的發(fā)展，Ahn 等［14］利用分子標(biāo)記技術(shù)將香味基因定位在第8 號染色體上，Bradbury 等［15］圖位克隆到香味主效基因Badh2（LOC_Os08g32870），該基因第7 外顯子8 bp 的缺失和3 個堿基的突變致使基因功能失活，最終引起2AP 積累。

隨著基因組測序技術(shù)快速發(fā)展，研究者們在香稻資源中挖掘出了更多功能性突變的Badh2單倍型［16-17］，這為香稻育種提供了豐富的香稻基因資源；同時，對香味基因的生化基礎(chǔ)和2AP 生物合成途徑開展了細(xì)致研究［18-19］，初步揭示了2AP 的生物合成通路［20］。但香味遺傳性狀十分復(fù)雜，不同品種稻米的2AP 含量存在明顯差異、相同品種在不同種植條件下的2AP 含量也不相同［2,21-23］，而如何特異提高精米2AP 含量也是香米產(chǎn)業(yè)發(fā)展面臨的關(guān)鍵問題［1］，這些問題的解決需要進一步解析2AP 生物合成機制，尤其要深入認(rèn)識籽粒發(fā)育過程中2AP 積累機制。本文對已發(fā)現(xiàn)的香稻Badh2基因單倍型及不同單倍型香稻中2AP 含量等的研究進行綜述，重點闡述2AP 生物合成通路的研究進展，提出從籽粒發(fā)育動態(tài)角度研究2AP 積累機制，為香稻資源相關(guān)基因利用、籽粒特異富集2AP 的香稻品種研發(fā)提供依據(jù)。

1 香稻Badh2 基因的單倍型

1.1 香味基因Badh2 的功能研究及利用

水稻Badh2基因編碼甜菜堿醛脫氫酶，該蛋白能夠催化甜菜堿醛合成甜菜堿，從而在抗鹽害、冷害和熱害等逆境脅迫中發(fā)揮重要作用［15,24］。研究發(fā)現(xiàn)，水稻中存在1 個BADH2 同源蛋白BADH1，且兩個蛋白功能可能發(fā)生了明顯分化：Fitzgerald 等［25］發(fā)現(xiàn)非香稻中這兩個蛋白均發(fā)揮功能，香稻和非香稻品種中BADH1 的轉(zhuǎn)錄本并不存在差異，BADH1 在響應(yīng)鹽脅迫中發(fā)揮主要作用；He 等［26］發(fā)現(xiàn)BADH1 與苗期水稻耐鹽性顯著相關(guān)，而BADH2 只與稻米香味性狀密切關(guān)聯(lián)；BADH2 在pH 10 的堿性條件下具有最大催化活性，催化底物主要為4-氨基丁醛，而BADH1 在pH 9.5 條件下具有催化活性，且對4-氨基丁醛催化活性極低［18］。

表達(dá)模式分析表明，Badh2在水稻的地上部分均能表達(dá)，亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)BADH2 蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)［19］。Baicharoen 等［27］深入解析了BADH2 蛋白的3D 結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該蛋白包含NAD+結(jié)合域、底物結(jié)合域和寡聚化結(jié)合域，揭示了關(guān)鍵氨基酸殘基如N162、C294、E260 在催化反應(yīng)中的關(guān)鍵作用，為優(yōu)質(zhì)香稻改良提供了理論基礎(chǔ)。

隨著分子標(biāo)記輔助育種、基因編輯育種等技術(shù)的發(fā)展，通過RNAi、TALEN 等生物技術(shù)對Badh2進行敲減或敲除，已成功獲得轉(zhuǎn)基因香稻材料［28-30］，隨著CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)在作物育種中的廣泛應(yīng)用，該技術(shù)已成為快速獲得香稻材料的重要方法［31-32］。

1.2 香稻資源中Badh2 單倍型的挖掘

基于轉(zhuǎn)基因存在的潛在風(fēng)險挑戰(zhàn)，挖掘更多自然變異的香味基因單倍型對于豐富優(yōu)質(zhì)香稻育種多樣性具有重要意義。通過對香稻資源的序列分析，目前在Badh2基因編碼區(qū)共發(fā)現(xiàn)15 種功能性突變的單倍型（表1），這些變化的核苷酸位點分布在第1、2、4、7、8、10、12、13、14外顯子，以小片段序列插入或刪除（Indel）和單核苷酸變異（SNP）為主［16-17,33-35］。

從Badh2基因型分布和基因頻率分析，badh2-E7（第7 外顯子8 bp 的缺失和3 個堿基的突變）是最常見的突變類型，廣泛分布在世界主要稻米生產(chǎn)國，如著名香秈稻KDML105 和Basmati370、美國香粳稻Della、我國優(yōu)質(zhì)稻花香2 號、廣東絲苗米代表品種美香占2 號和象牙香占等均為這種單倍型，表明在較早的香稻育種過程中，這種單倍型被育種家無意識選擇并廣泛應(yīng)用。其余14 種單倍型具有較強的地域分布特性，相應(yīng)的香稻品種數(shù)量較少，且多在粳稻中被發(fā)現(xiàn)，如江蘇的南粳系列均為badh2-E2.1單倍型，浙江和廣西的香糯稻為badh2-E4-5單倍型，這些香味基因型可能受特殊地理限制，形成了特色香稻品種。此外，多項研究發(fā)現(xiàn)Badh2基因啟動子區(qū)域變異也能夠?qū)е?AP 積累（表1），目前共發(fā)現(xiàn)4種單倍型［36-39］，主要表現(xiàn)為Badh2基因5′ UTR相應(yīng)序列缺失。分子功能研究表明，這些材料中2AP 的積累是由于BADH2 蛋白含量顯著下降引起的。

充分利用香稻資源中豐富多樣的Badh2單倍型進行常規(guī)雜交育種，一方面能規(guī)避轉(zhuǎn)基因風(fēng)險，另一方面可能創(chuàng)制出不同香味類型的香稻品種。當(dāng)前，對大多數(shù)Badh2單倍型已開發(fā)出特定的分子標(biāo)記，不僅可以用于篩選香稻基因型，而且在香稻的分子輔助育種進程中發(fā)揮重要作用［34-35］。

1.3 不同Badh2 單倍型香稻的2AP 含量分布特征

不同Badh2突變類型材料中的2AP 含量不同（表1），BADH2 蛋白活性是影響2AP 積累的重要因素之一。通過對Badh2基因啟動子變異的香稻材料、RNAi 轉(zhuǎn)基因香稻材料的分析，發(fā)現(xiàn)BADH2 蛋白水平顯著降低［28,40］；Kovach等［16］研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生1 個或2 個堿基插入或缺失的單倍型材料（如badh2-E1、badh2-E10.1、badh2-E14.1）的2AP 含量整體高于單堿基替換或3 bp 插入的單倍型材料（如badh2-E10.3、badh2-E13.1、badh2-E14.2），表明2AP 含量與BADH2 蛋白活性密切相關(guān)，但對于BADH2 蛋白活性下降到何種程度才能導(dǎo)致2AP 積累這個問題尚未研究。另外，相同Badh2 單倍型材料之間，2AP 含量仍然存在較大差異，這與遺傳背景不同直接相關(guān)。

表1 香稻Badh2 基因突變類型Table 1 Type of alleles of Badh2 in aromcotic rice

目前，研究Badh2單倍型與2AP 含量關(guān)系最大的障礙在于缺乏遺傳背景相同、Badh2變異類型不同的遺傳材料，而利用CRISPR/Cas9 對非香稻Badh2的不同外顯子、啟動子區(qū)段設(shè)計靶點，獲得不同變異類型的香稻材料，能有效解釋Badh2單倍型與2AP 含量之間的關(guān)系，同時也是對高積累2AP 香稻創(chuàng)制的有益探索。

2 2AP 生物合成通路及其在香稻籽粒中的分布特征

2.1 2AP 代謝通路相關(guān)研究

不同香稻品種、不同栽培條件均導(dǎo)致2AP 含量差異，這與2AP 生物合成通路相關(guān)代謝物的變化密切相關(guān)。BADH2 能夠催化4-氨基丁醛氧化，從而生成4-氨基丁酸，而香味基因失活時，4-氨基丁醛能夠直接環(huán)化生成1-吡咯啉，1-吡咯啉再與乙酰基團結(jié)合，無需酶促反應(yīng)即可合成2AP［41-42］，研究發(fā)現(xiàn)，1-吡咯啉是2AP 合成中重要的限制性底物［43］。根據(jù)1-吡咯啉的來源不同，2AP 生物合成途徑主要分為谷氨酸-脯氨酸代謝和多胺代謝兩種途徑［18,20,44］，如圖1 所示，谷氨酸和脯氨酸分別在脯氨酸脫氫酶（ProDH）和1-吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）的作用下，生成中間產(chǎn)物1-吡咯啉-5-羧酸（P5C），P5C 繼而轉(zhuǎn)化為1-吡咯啉；多胺代謝能夠生成中間產(chǎn)物4-氨基丁醛，4-氨基丁醛在BADH2 酶失活的情況下環(huán)化為1-吡咯啉。

圖1 2AP 生物合成通路示意圖Fig.1 Schematic diagram of the 2AP biosynthetic pathway

當(dāng)前，對谷氨酸-脯氨酸代謝途徑的研究主要集中在脯氨酸含量以及P5CS、ProDH兩個關(guān)鍵基因表達(dá)變化對2AP 積累的影響方面。Huang等［45］研究發(fā)現(xiàn)，香稻中P5CS 酶活顯著高于非香稻；在Badh2啟動子區(qū)段變異的香稻“Velchi”中脯氨酸含量、P5CS 轉(zhuǎn)錄水平和酶活均高于非香稻［39］；在香稻中過表達(dá)P5CS，籽粒中2AP 含量可提高2 倍［46］。同時，增香栽培研究大多關(guān)注谷氨酸-脯氨酸通路對2AP 含量的影響：Mo 等［47］對香稻遮光處理后，脯氨酸含量顯著提高，2AP含量提高59%；Bao 等［48］對抽穗期香稻進行水分干濕灌溉處理，相關(guān)籽粒中ProDH、P5CS 和二胺氧化酶（DAO）活性顯著提高，2AP 含量提高了45%；適當(dāng)?shù)乃{(diào)控及鋅、硒等處理［49-51］均可提高谷氨酸-脯氨酸代謝途徑活性從而提高2AP 含量。但目前的關(guān)鍵問題在于尚無直接證據(jù)證實植物體內(nèi)P5C 能夠轉(zhuǎn)化為1-吡咯啉，從而制約了對籽粒2AP 含量的精準(zhǔn)調(diào)控。

多胺在植物生長和發(fā)育過程中起重要的調(diào)控作用［52-53］，同時在多種逆境脅迫中發(fā)揮重要作用，如冷害、熱害、鹽脅迫和病蟲害等［54-57］；已有研究表明，多胺參與水稻籽粒灌漿的調(diào)控，對籽粒充實度、稻米品質(zhì)、種子活力等均有影響［58-60］，腐胺、精胺和亞精胺等多胺物質(zhì)經(jīng)酶催化最終能夠生成4-氨基丁醛［61-62］，但多胺物質(zhì)與籽粒2AP 積累的相關(guān)性研究未見報道。因此，加強香稻籽粒發(fā)育過程中多胺代謝對2AP 含量的影響機制研究，挖掘多胺途徑中調(diào)控2AP 含量的關(guān)鍵代謝物和關(guān)鍵基因，將有助于實現(xiàn)籽粒2AP 含量的定向提高。

2.2 香稻籽粒中2AP 分布特征及積累機制研究

精米中2AP 含量一般明顯低于糙米，但不同品種籽粒精米中2AP 分布特征差異較大。Buttery等［63］發(fā)現(xiàn)巴斯馬蒂香米、KDML105 籽粒中約35%的2AP 分布于精米；應(yīng)興華等［64］研究發(fā)現(xiàn)桂香絲糯、清香米、泰國香稻1 號R207 等5個香稻品種精米中2AP 含量占比在90%以上。Yoshihashi 等［65］推斷精米中2AP 與淀粉顆粒復(fù)合體緊密結(jié)合，但籽粒中2AP 積累機制尚不明確，目前提出兩種機制加以解釋：一種認(rèn)為葉片和鞘中合成的2AP 被轉(zhuǎn)運至籽粒，另一種認(rèn)為2AP 在籽粒中被從頭合成。研究胚乳發(fā)育過程中2AP 代謝通路變化特性，對于認(rèn)識籽粒2AP 積累機制、培育2AP 高積累水稻至關(guān)重要。Hinge 等［20］研究發(fā)現(xiàn)，隨著籽粒成熟2AP 含量不斷提高，但籽粒中脯氨酸含量較低，P5CS基因表達(dá)水平下降，從而認(rèn)為籽粒中2AP 是由葉片轉(zhuǎn)運而來，但該研究未考慮多胺代謝對2AP 的影響；潘陽陽等［66］利用代謝組和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析技術(shù)，對美香占2號乳熟期、蠟熟期和完熟期的籽粒2AP 代謝通路進行分析，發(fā)現(xiàn)3 個時期籽粒中均含有2AP 生物合成所需的前體物質(zhì)，同時，P5CS、ProDH以及多胺代謝途徑中二胺氧化酶4（DAO4）、多胺氧化酶4（PAO4）、精胺合成酶和亞精胺合成酶等相關(guān)基因具有持續(xù)較高的表達(dá)水平，推測谷氨酸-脯氨酸轉(zhuǎn)化通路和多胺代謝途徑均有助于2AP 的積累。因此，從籽粒動態(tài)發(fā)育角度研究影響2AP積累的相關(guān)代謝物和相關(guān)基因具有較高可行性，將成為揭示2AP 積累機制的重要手段。進一步加強胚乳中特異高表達(dá)的DAO4、PAO4等基因?qū)?AP 含量影響的研究，對于特異提高精米中2AP含量具有重要意義。

3 展望

隨著水稻功能基因組學(xué)的發(fā)展，香稻資源中Badh2基因單倍型得以深入挖掘，不同單倍型香稻材料之間2AP 含量存在較大差異；2AP 生物合成通路也被初步解析，但其中多數(shù)基因的生物學(xué)功能尚未研究，對2AP 如何在籽粒中積累這一關(guān)鍵問題仍然缺乏系統(tǒng)認(rèn)識。利用當(dāng)前新興的代謝組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組等多層組學(xué)技術(shù)，綜合研究香稻籽粒發(fā)育過程中2AP 相關(guān)代謝物和基因的變化特性，尤其是重點關(guān)注多胺代謝途徑的相關(guān)變化，挖掘關(guān)鍵調(diào)控基因，將有助于認(rèn)識籽粒2AP 積累機制。因此，未來香稻的研究可以聚焦以下兩個方面：（1）解析不同香稻類型2AP 代謝通路的差異，重點解析多胺代謝對2AP 含量的影響機制；（2）加強不同類型Badh2單倍型香稻資源中DAO4、PAO4等基因的利用，培育2AP高積累的香稻品種。