一例豬流行性腹瀉病毒變異株導致仔豬腹瀉的案例診斷

華 珍

（福建省武夷山市農業農村局，福建 武夷山 354300）

近來年，國內豬場對豬病的防控意識逐漸提高，但仔豬腹瀉仍然是威脅我國生豬養殖發展的主要疾病之一，且每年因仔豬腹瀉死亡所引發的經濟損失巨大。在生豬飼養過程中，導致仔豬腹瀉的病毒性病原種類繁多，其中包括有常見的豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬德爾塔冠狀病毒（PDCoV）、豬輪狀病毒（PRoV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬圓環病毒2型（PCV2）和豬細小病毒（PPV）等，但以上病原（尤其是腸道病毒）感染仔豬所導致的臨床癥狀及病理變化較為相似，傳統的臨床診斷無法對致病病因進行確診，繼而延誤疾病的防治[1]。隨著分子生物學技術的快速發展，以PCR/RT-PCR技術為核心的檢測方法廣泛應用于豬場病原的快速診斷，這為疾病的防控提供了便捷的技術手段。

2020年11月初，福建南平地區某養殖場仔豬暴發腹瀉疫情，筆者根據發病仔豬臨床癥狀特點，采集其小腸組織樣品進行實驗室診斷，最終結果顯示該場暴發疫情是由PEDV變異株感染所引起，其具體診斷過程如下。

1 材料與方法

1.1 病情介紹及病料來源

福建南平某豬場飼養繁殖母豬40余頭，該場于2020年11月初開始，部分欄舍仔豬開始腹瀉，其后豬場飼養員給腹瀉仔豬灌喂抗生素，但效果不佳。至11月7日，該場已有80余頭仔豬發病，其中42頭仔豬死亡。

據養殖戶介紹，發病豬群典型臨床癥狀即為急性腹瀉，且部分仔豬有嘔吐現象，病豬死亡大部分原因是嚴重脫水。為對導致該病的病因進行確診，該場采集嚴重發病的仔豬小腸、腹股溝淋巴結送至武夷山市農業農村局進行病原診斷。

1.2 主要材料

DNA/RNA核酸提取試劑盒購自于北京生化科技有限公司；cDNA反轉錄試劑盒購自于伯樂生命醫學產品有限公司；Taq PCR Mix預混液、DL 2 000 Marker和瓊脂糖粉末等均購自于上海生物工程科技公司。

1.3 方法

1.3.1 病料處理與核酸提取 用滅菌刀將小腸和淋巴結組織切碎后，取0.2 g組織與1.0 mL生理鹽水混合，高速勻漿后離心，取200 μL上清液根據DNA/RNA提取試劑盒說明書對樣本核酸進行提取，將核酸中RNA反轉錄為cDNA，將cDNA樣品保存于-80 ℃，待檢。

1.3.2 病原檢測 應用商業化病原檢測試劑盒采用real-time PCR法分別檢測樣品中是否含有PEDV、TGEV、PRoV、PDCoV、PRV、PPV和PCV2，根據樣品Ct值判定其是否為對應病原陰陽性。

1.3.3 PEDV S1基因序列擴增及分析 用一對特異性引物擴增PEDV S1基因序列，其中RT-PCR體系（50.0 μL）中包含2×PCR mix預混液25.0 μL、上下游引物（10 pmol/L）各2.0 μL、模板cDNA 3.0 μL及雙蒸水18.0 μL，反應條件為94 ℃5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共35個循環，72 ℃ 10 min，其后將PCR產物進行凝膠電泳，并切膠回收后送至生物公司進行雙向測序。

將返回序列進行拼接后，在NCBI網站上進行BLAST，比較該序列與GenBank上收錄的不同PEDV毒株對應序列的同源性，確定本次獲得毒株所屬的基因型。

2 結果

2.1 病原檢測結果

使用商業化試劑盒分別檢測可能導致仔豬腹瀉的病毒性病原，結果發病豬組織樣品中僅檢測出PEDV核酸。此外，我們對樣品進行處理后接種在普通瓊脂培養基培養，未發現任何菌落形成，提示該場仔豬腹瀉是由PEDV感染所引起。

2.2 PEDV S1基因擴增凝膠電泳結果

使用一對特異性引物應用PCR法擴增PEDV S1基因序列，將PCR產物進行凝膠電泳，結果如圖1所示，本文擴增序列大小約為1 900 bp左右，與預期大小基本一致，且無非特異性條帶，提示擴增的PCR產物為PEDV S1基因序列。

圖1 PEDV S1基因序列擴增PCR產物凝膠電泳

2.3 PEDV S1基因序列變異情況分析

將PCR陽性產物進行純化后送至生物公司進行雙向測序，對返回序列進行拼接，最終序列大小為1 983 bp。核苷酸序列同源性分析結果（圖2）發現，該毒株S1基因序列與GenBank收錄的PEDV中國流行變異株（KY624222.1和KY624212.1）同源性較高，均超過97.4%，但與PEDV疫苗株（JN599150.1）同源性相對較低，僅為92.2%。根據以上結果可判定該場暴發疫情是由于PEDV變異株感染所引起。

圖2 PEDV分離株S1基因核苷酸序列同源性分析結果

3 討論與思考

近年來，很多養殖場極大程度地提高了生物安全防控水平，這對疫病防控起到了積極的作用。但仔豬腹瀉仍然在豬場較為常見，且導致仔豬腹瀉病原較多，傳統的臨床診斷辦法無法對此類病原進行準確診斷，準確對致病原進行鑒定需依靠更加方便快捷的分子生物學方法。

PEDV在我國是導致仔豬腹瀉的主要病原之一，該病原為RNA病毒，屬于冠狀病毒科，其基因組變異速率較快，給相應的防控帶來巨大的考驗。在2010年以后我國出現了PEDV變異株，與傳統毒株相比，變異株毒力更強，對我國養豬業危害也更大。在PEDV基因組中，S1基因變異速率相對較快，選擇以S1基因序列進行遺傳進化分析可初步明確毒株基因型和變異情況[2-3]。

本文涉及到的案例為仔豬嚴重腹瀉，但傳統的臨床診斷無法對病原進行確診，筆者采用分子生物學方法對病原進行確診，最終確定為PEDV感染引起。由于PEDV分為疫苗株和變異株，這兩種毒株均可導致仔豬腹瀉，但基于疫苗株研發的疫苗對變異株的防控能力有限，故筆者通過擴增與分析該毒株的S1基因變異情況，確定該毒株屬于變異株。對于豬流行性腹瀉的防控，養殖場可以采用生物防控＋疫苗接種模式進行，其中生物防控包括定期消毒、減少飼養人員在豬舍間流動，同時提高飼養管理水平等；而疫苗接種主要是對豬群免疫接種PEDV相應的弱毒或滅活疫苗。