湘潭市屠宰場沙門氏菌分離鑒定及耐藥性分

周 政

（湘潭市易俗河鎮農技農機畜牧水產推廣服務中心，湖南 湘潭 411228）

沙門氏菌屬于腸桿菌科成員之一，該病原廣泛存在于自然環境中，可感染多種動物，其中包括豬、禽和反芻動物等。此外，人對該病原也易感，且人類感染該病原后可出現嚴重的臨床癥狀，包括惡心、嘔吐和渾身乏力等，嚴重時導致敗血癥，甚至威脅生命[1]。截至目前，科研人員發現沙門氏菌屬有超過2 600種血清型，但也只有部分血清型沙門氏菌可感染人，如鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌[2-3]。據報道，消費者發生食源性細菌病中毒主要是由沙門氏菌感染引起的，而歐洲消費者感染沙門氏菌病部分原因是與食用被該病原污染的豬肉有關[4]。由于沙門氏菌的感染途徑主要是水平傳播，環境中存在沙門氏菌對消費者健康也會造成一定的威脅。

隨著人們對食品安全越來越重視，目前國內有研究人員開始關注屠宰場生豬肉品或環境中沙門氏菌的污染情況。邱燕等2016年對貴州部分地區屠宰場豬肉樣品進行檢測發現，該地區屠宰場豬肉中沙門氏菌檢出率為14.0%（7/50）[5]；韓依辛等對廣東省部分地區屠宰場豬肉樣品檢測結果顯示，498份樣品中有70份為沙門氏菌檢測陽性，檢出率為14.06%[6]。本研究于2020年5—8月從湘潭縣部分生豬屠宰場共采集90份樣品進行沙門氏菌分離鑒定及藥敏試驗，旨在為該病的防控提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2020年5—8月從湘潭縣3個生豬屠宰場共采集90份樣品，其中包括豬肉樣品58份和環境樣品32份。豬肉樣品主要采集扁桃體、淋巴結或肺臟等，每份樣品約30 g，標記后置于封口袋中；環境樣品主要是生豬剖殺臺和豬肉分割臺，用無菌棉簽蘸取少量滅菌PBS溶液后，在剖殺臺或分割臺表面進行來回涂抹，涂抹面積為25～30 cm2，其后將棉簽置于封口袋中并標記。所有樣品低溫運輸至湘潭縣動物疫病預防控制中心，待檢。

1.2 樣品處理及細菌分離鑒定

取生豬組織樣品（0.8～1 g）與適量PBS溶液混合后進行研磨，離心后取50 μL上清液放入SC增菌培養液中進行細菌增殖；環境樣品所用棉簽與適量PBS混合后，取100 μL上清液置于增菌培養液中培養。其后，采用沙門氏菌檢測試紙對以上樣品分別進行檢測。

將試紙條檢測為陽性的樣品進行細菌分離鑒定：用接種環蘸取少量菌液在麥康凱培養基表面劃線，37 ℃恒溫箱培養24 h，觀察菌落生長情況；其后挑取疑似菌落進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌株形態學特征。

1.3 沙門氏菌16S rRNA基因擴增、測序及分析

將形態學鑒定為沙門氏菌的菌株在營養培養基中增菌后，取200 μL菌液煮沸以獲得細菌基因組。以細菌基因組為模板，通過PCR法對細菌的16S rRNA基因序列進行擴增，其體系（50.0 μL）包括：2×PCR mix 25.0 μL、上下游引物各1.0 μL、DNA模板3.0 μL及雙蒸水20.0 μL；反應條件為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環，最后72 ℃延伸10 min。PCR反應結束后取5.0 μL產物進行瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。將陽性PCR產物送至上海生工進行測序，獲得測序結果后，將序列進行拼接，其后在NCBI上將獲得序列進行同源性BLAST比對分析。

1.4 血清型分型及藥敏試驗

采用玻片凝集試驗及沙門氏菌屬診斷血清的O、H和Vi抗原抗血清反應對本試驗獲得的沙門氏菌分離株進行血清型鑒定，其判定標準參考Kauffmann-White方案。

嚴格按照CLSI標準對本試驗獲得的沙門氏菌菌株進行藥敏試驗。以多環西素、頭孢唑林、林可霉素、克林霉素、氧氟沙星、恩諾沙星、多黏菌素B、氨芐西林、頭孢拉定、頭孢噻肟和氨曲南作為菌株抗生素敏感型試驗抗生素。具體操作過程為：將以上菌株分別在普通瓊脂培養基中擴增后，將其稀釋至1×106cfu/mL，取100 μL菌液涂布于培養基表面，待菌液稍干后貼上含有不同抗生素的藥敏紙片，其后將培養基置于37 ℃恒溫培養箱內培養24 h。最后用游標卡尺衡量不同抗生素紙片的抑菌圈直徑，根據藥敏紙片產品說明書判定菌株對該抗生素的敏感性。

2 結果

2.1 沙門氏菌分離及鑒定

本試驗從湘潭縣3個屠宰場采集環境或豬肉樣品共90份，對樣品中細菌性病原進行初步擴增后，用沙門氏菌檢測試紙對以上樣品進行檢測，結果發現有9份樣品檢測為陽性，其陽性率為10.0%；其后我們對以上陽性樣品進行病原分離及革蘭氏染色鑒定，最終可確定9個樣品分離菌株疑似為沙門氏菌，該菌株在麥康凱培養基表面可形成無色、表面光滑的圓形菌落，革蘭氏染色可發現兩端鈍圓的革蘭氏陰性短桿菌（圖1）。其后，對以上菌株進行擴增后，提取DNA基因組，應用PCR技術對菌株16S rRNA基因序列進行擴增、測序及分析，結果發現本試驗獲得的9個菌株均被鑒定為沙門氏菌。

圖1 沙門氏菌革蘭氏染色鏡檢結果

2.2 湘潭縣屠宰場來源樣品沙門氏菌污染情況

通過數據統計，結果表明90份被檢樣品中有9份樣品被沙門氏菌污染，平均檢出率為10.0%（9/90）；其中3個屠宰場被污染樣品數量分別為1份、5份和3份，其檢出率分別為3.3%（1/30）、16.7%（5/30）和10.0%（3/30）；此外，90份樣品可分為環境樣品（32份）和豬肉樣品（58份），檢測為沙門氏菌陽性的樣品數量分別為5份和4份，檢出率分別為15.6%（5/32）和6.9%（4/58），見表1。

表1 湘潭縣屠宰場來源樣品沙門氏菌污染情況

2.3 藥敏試驗結果

進一步的藥敏試驗結果表明，本試驗分離的9個沙門氏菌毒株對不同抗生素敏感性具有一定差異，具體結果如表2所示，所有沙門氏菌對多環西素和頭孢唑林均產生耐藥性，耐藥率為100.0%；對克林霉素、林可霉素和氨芐西林的耐藥率均超過50.0%，分別為88.89%、88.89%和77.78%；對多黏菌素B、氧氟沙星和恩諾沙星等藥物相對敏感，其耐藥率分別為0、22.22%和11.11%。

表2 分離的沙門氏菌菌株對不同抗生素藥敏試驗結果

3 討論

盡管目前人們對食品衛生安全問題逐漸重視，但生豬在飼養和屠宰等環節仍然容易受到病原菌感染或污染，且部分病原菌具有感染人的能力，如大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌等，這類致病菌感染（污染）豬（肉）不但可影響豬肉品質，還可能對消費者健康造成威脅。沙門氏菌屬于重要的人畜共患性致病菌，且該致病菌在豬場十分常見，但肥育豬感染該病一般不表現臨床癥狀，這導致有些外觀健康的屠宰豬帶菌，消費者接觸或食用帶菌肉類后就有可能會感染該病。方忠意等對河南地區部分屠宰場外觀健康屠宰場盲腸組織內容物進行細菌分離鑒定，結果發現樣品中沙門氏菌檢出率為5.36%（45/840）[7]；而韓依辛等調查結果顯示廣東省部分屠宰生豬沙門氏菌檢出率達14.06%（70/498）[6]。

為初步調查屠宰場生豬沙門氏菌污染情況及分離菌對不同抗生素的耐藥特性，本試驗于2020年5—8月從湘潭縣3個屠宰場采集屠宰豬組織及環境樣品共90份，用于沙門氏菌分離鑒定，結果發現共9份樣品為沙門氏菌陽性，平均檢出率為10%，其中豬肉樣品和環境樣品檢出率分別為6.9%和15.6%，且以上3個屠宰場中均有沙門氏菌陽性樣品，這些數據說明湘潭縣生豬屠宰場中豬肉或環境中存在沙門氏菌污染，且環境污染更加嚴重，同時也提示屠宰場應定期對環境和屠宰工具等進行消毒，防止環境中致病菌污染豬肉。

進一步藥敏試驗分析結果顯示，本試驗分離的9個沙門氏菌分離株對不同抗生素耐藥性存在差異，其中對多環西素、頭孢唑林、林可霉素和克林霉素耐藥率均超過80%，提示臨床上不能使用以上抗生素用于該地區豬沙門氏菌病防控；但以上菌株對氧氟沙星、恩諾沙星和多黏菌素B等耐藥率相對較低，提示以上抗生素是防控豬沙門氏菌病的首選，但不可長期使用同種藥物，應注意穿梭用藥。