北疆某規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)豬圓環(huán)病毒2型抗體及抗原檢測(cè)與分析

常軍帥，程露露，張 琪，屈勇剛，梁 晏，李 娜，孫瓊飛，王紫陽

（1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.動(dòng)物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832003）

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus, PCV)為最小的環(huán)狀ssDNA病毒之一，因與其他病毒區(qū)別較大，在分類上將其歸屬為圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬。PCV可分為4種不同的類型，分別為PCV1（圓環(huán)病毒1型）、PCV2（圓環(huán)病毒2型）、PCV3（圓環(huán)病毒3型）和PCV4（圓環(huán)病毒4型）。PCV1于1974年被德國科學(xué)家Tischer在豬腎細(xì)胞內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)，是一種不引起細(xì)胞病變（CPE）的病毒[1]；1991年，加拿大科學(xué)家Ellis等[2]從斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）病豬群內(nèi)分離出了一株新型病毒，具有極強(qiáng)的致病性，因與之前發(fā)現(xiàn)的PCV1病毒類似，所以后來被命名為PCV2；PCV3、PCV4分別于2017年、2019年被先后發(fā)現(xiàn)并報(bào)道[3]。PCV2生存能力極強(qiáng)，在75 ℃下也可堅(jiān)持15 min不被殺滅，且具有極強(qiáng)的致病性，會(huì)對(duì)各個(gè)不同階段的豬群產(chǎn)生不良影響，在種豬群可導(dǎo)致母豬體內(nèi)帶毒/公豬精液帶毒，生產(chǎn)中常引起母豬久配不孕、反復(fù)發(fā)情；在妊娠后期，會(huì)影響胎兒生長，降低仔豬初生重；對(duì)于6周齡前的仔豬，PCV2通過免疫抑制，可引起PMWS、“抖抖病”（CT）、豬皮炎腎病綜合征（PDNS），也可使豬群繼發(fā)豬細(xì)小病毒病（PPV）和豬藍(lán)耳病（PRRS）；對(duì)于肥育豬，感染PCV2后表現(xiàn)為亞健康，飼料利用率降低，經(jīng)濟(jì)損失最為嚴(yán)重[3]。PCV2為病毒性疾病，目前只能依靠疫苗免疫來預(yù)防此病，然而由于種豬帶毒、免疫程序不合理或疫苗質(zhì)量較差，導(dǎo)致在生產(chǎn)操作中免疫效果較差，需采用一定檢測(cè)技術(shù)對(duì)免疫效果及豬群是否存在PCV2感染進(jìn)行評(píng)價(jià)。

為了解北疆某規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)PCV2免疫豬群[疫苗及免疫程序均按照《國家中長期動(dòng)物疫病防控規(guī)劃（2012—2020）》中農(nóng)業(yè)部制定的常見動(dòng)物疫病免疫的推薦方案]的PCV2的抗體水平及病原存在情況，本試驗(yàn)于2019—2020年在該場(chǎng)采集了671份血清樣品，進(jìn)行了PCV2抗原抗體檢測(cè)與分析，以期為該場(chǎng)PCV2的免疫防控提供幫助。

1 材料

1.1 樣品

2019年1月至2020年12月期間從北疆某規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)，共采集671份血清樣品，送至石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。其中哺乳仔豬130份、保育豬113份、肥育豬148份、后備豬73份、種公豬39份、經(jīng)產(chǎn)母豬168份。

1.2 材料和儀器

診斷試劑盒（批號(hào)：PCV20200518E）為豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）抗體檢測(cè)試劑盒，購自哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司；獸用一次性采血器5 mL為美康實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；PCR儀、自動(dòng)酶標(biāo)儀、微量移液器購自賽默飛世爾科技公司；DL 2 000 DNA Marker、病毒基因DNA/RNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 樣品處理

根據(jù)豬群不同，從耳緣靜脈或前腔靜脈采集3～5 mL血液，室溫下靜置析出清亮、無溶血的血清，收集至EP管直接檢測(cè)。

2.2 間接ELISA檢測(cè)

2.2.1 方法 根據(jù)豬PCV2的ELISA抗體檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，試驗(yàn)前把試劑恢復(fù)到（25±3） ℃（抗原包被板仍4 ℃保存）。先將已作5倍稀釋（20 μL血清樣品加入80 μL的樣品稀釋液）的血清樣品100 μL、100 μL陰性和陽性對(duì)照（各2孔）加入抗原包被孔內(nèi)，輕微震蕩后加蓋封口膜，置37 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱孵育30 min。孵育后洗滌5次，每孔加入100 μL酶結(jié)合物液，再次孵育30 min，然后洗滌5次。加入100 μL的底物液（底物液A與底物液B等體積混合）在37 ℃條件下避光顯色15 min后，加入50 μL終止液使反應(yīng)終止，用酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)定OD值用來分析。

2.2.2 結(jié)果判定 試驗(yàn)成立的條件是陰性對(duì)照的OD450均值≤0.15，陽性對(duì)照OD450均值≥0.60。若不符合，需再次進(jìn)行試驗(yàn)。

臨界值=陽性對(duì)照OD450均值×1/4。被檢樣品OD450值＜臨界值，判定為抗體陰性；被檢樣品OD450值≥臨界值，則判定為抗體陽性。

2.2.3 數(shù)據(jù)分析 使用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析PCV2抗體的S/P平均值、陽性率及各豬群間的差異。

2.3 PCV2抗原檢測(cè)

按照病毒基因DNA/RNA提取試劑盒說明書對(duì)PCV2抗體陽性值數(shù)據(jù)過高的血液混樣提取核酸，然后用PCR擴(kuò)增。引物序列參考文獻(xiàn)[4]，由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成PCV2特異性引物，引物序列為：F：5'-CTGTTTTCGAACGCAGTGCC-3'；R：5'-GCATCTTCAACACCCGCCT-3'。PCR反應(yīng)體系的設(shè)計(jì)（20 μL）：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，設(shè)置為35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后取7 μL進(jìn)行1%的瓊脂糖電泳，預(yù)期產(chǎn)物大小為486 bp。

3 結(jié)果

3.1 各類別豬群PCV2抗體檢測(cè)結(jié)果

在各類別豬群中，哺乳仔豬群和保育豬群抗體陽性率較低，分別為38.46%（50/130）和29.20%（33/113）；經(jīng)產(chǎn)母豬群、后備豬群、肥育豬群、種公豬群抗體陽性率依次為83.93%（141/168）、75.34%（55/73）、72.30%（107/148）和76.92%（30/39）。不同豬群之間PCV2平均抗體水平存在差異，保育豬群和經(jīng)產(chǎn)母豬群、后備豬群、肥育豬群、種公豬群差異顯著（P＜0.05）；種公豬群和后備豬群、肥育豬群差異不顯著（P＞0.05）。結(jié)果見表1。

表1 不同類別群豬PCV2免疫抗體檢測(cè)結(jié)果

3.2 各類別豬群PCV2抗原檢測(cè)結(jié)果

通過對(duì)抗體陽性數(shù)據(jù)過高的豬只進(jìn)行PCV2抗原檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)各豬群內(nèi)均存在PCV2抗原。結(jié)果見圖1。

圖1 不同類別群豬PCV2抗原PCR檢測(cè)結(jié)果

4 討論與分析

豬圓環(huán)病毒病為免疫抑制性疾病，可引起豬群免疫力低下、疫苗免疫效果差，繼而引發(fā)藍(lán)耳病、細(xì)小病毒病等，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的損失。通過本次對(duì)該規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)的671份血清進(jìn)行PCV2抗體檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該豬場(chǎng)PCV2抗體陽性率為62.00%（416/671），低于國家規(guī)定的水平（70.00%）。在各類豬群中，哺乳仔豬群和保育豬群抗體陽性率較低，分別為38.46%（50/130）和29.20%（33/113），說明PCV2的疫苗免疫程序存在改進(jìn)空間。該豬場(chǎng)PCV2的疫苗首次免疫時(shí)間為仔豬出生后的第4周齡，在未免疫前仔豬就有38.46%（50/130）呈現(xiàn)出抗體陽性，與楊滲等[5]所檢測(cè)出的哺乳仔豬群45%（36/80）抗體陽性率結(jié)果相比較低，推測(cè)原因可能是母源抗體的存在較少，可加強(qiáng)對(duì)妊娠母豬的PCV2免疫次數(shù)。保育豬群的抗體陽性率均值在各豬群內(nèi)最低，為29.20%（33/133）。莊汝柏等[6]研究發(fā)現(xiàn)隨著仔豬日齡的增長，PCV2的母源抗體水平將不斷下降，可以通過進(jìn)一步對(duì)母源抗體水平的測(cè)定，并結(jié)合PCV2疫苗的抗體產(chǎn)生效果，規(guī)劃出最適合PCV2首免日期，便可提高保育豬群對(duì)PCV2的抗體陽性率。經(jīng)產(chǎn)母豬、后備豬、肥育豬、種公豬的PCV2抗體水平均超過了國家規(guī)定的水平（70.00%），但均低于楊滲等[5]所檢測(cè)出的抗體水平。肥育豬的抗體水平為72.30%（107/148），說明部分豬未免疫成功。肥育豬體型較大，在免疫過程中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)“飛針”現(xiàn)象，可采用更易固定豬只的設(shè)備，保證免疫質(zhì)量，防止豬群免疫力低下造成的料重比增高。經(jīng)產(chǎn)母豬、后備豬和種公豬都屬于種豬群，種豬的免疫程度對(duì)豬場(chǎng)健康發(fā)展起到了決定性的作用。建議加強(qiáng)免疫次數(shù)或更換更好的疫苗，進(jìn)而提高豬場(chǎng)對(duì)PCV2的抵抗力。

通過對(duì)各豬群抗體檢測(cè)數(shù)據(jù)異常的豬只血清混樣后進(jìn)行抗原檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)不同類別的豬群都存在PCV2的感染。徐麗華等[7]曾對(duì)豬場(chǎng)進(jìn)行過PCV2抗原檢測(cè)，陽性率檢出結(jié)果為27.4%（90/329），證明了豬群中普遍存在著PCV2的感染情況。哺乳仔豬、保育豬的PCV2抗體水平低于其他場(chǎng)或地區(qū)，而且在抗體陽性中還有部分是由于抗原感染造成的抗體陽性，說明該場(chǎng)的PCV2疫苗免疫情況比我們看到的更差。對(duì)于種豬群，尤其是種公豬群，也存在著PCV2感染情況，會(huì)導(dǎo)致整個(gè)豬場(chǎng)各個(gè)豬群相繼感染PCV2。針對(duì)這種情況，我們可對(duì)種豬逐個(gè)排查，進(jìn)行單個(gè)豬只樣品的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)陽性豬只立馬淘汰，同時(shí)對(duì)其生活圈舍徹底消毒。通過凈化種豬群，才可在整個(gè)豬場(chǎng)的PCV2凈化中看到效果。

PCV2本身并不可怕，但通過降低豬群免疫力，提高了死亡率。只有凈化種豬群，并對(duì)各個(gè)階段的豬群加強(qiáng)PCV2免疫，完善免疫程序，才可為豬場(chǎng)創(chuàng)造更高的經(jīng)濟(jì)效益。