甲草胺對非靶標生物的毒理學研究進展

歐陽康, 馮唐奇, 明 坤, 方國斌, 許凌風, 馬洪菊*,

(1. 華中農業大學 植物科學技術學院，武漢 430070；2. 第四儲備資產管理局 哈爾濱管理站，哈爾濱 150030；3. 湖北省植物保護總站，武漢 430070)

甲草胺 (alachlor) 屬于氯乙酰胺類除草劑，是一種選擇性芽前土壤處理劑，主要通過抑制超長鏈脂肪酸延長酶 (very-long-chain fatty acid elongase,VLCFAE) 的活性，從而阻礙超長鏈脂肪酸 (verylong-chain fatty acid, VLCFA) 的生物合成發揮除草作用，對于出苗前土壤中萌發的雜草具有很好的防治效果，適用于大豆、花生、水稻等作物田防除一年生禾本科及部分闊葉雜草[1]。

甲草胺由美國孟山都公司于1966年研發，1969年商品化，在20世紀70年代被中國引進，并逐步被廣泛使用，至20世紀末甲草胺已成為國際上應用最為廣泛的除草劑之一[2]。然而，隨著甲草胺使用量的增加，其對非靶標生物以及生態環境的影響也越來越受到人們的關注。

甲草胺在大田中的消解途徑主要為微生物降解和揮發，其次為光解、化學降解、滲漏、地表徑流和被植物吸收等。微生物降解和吸附主要發生在土壤表面，甲草胺一旦進入根區以下，一般降解緩慢。由于甲草胺對土壤的吸附親和力較低，而在水體中的溶解度較高，并且具有較強的流動性，導致在地表水或地下水中甲草胺常常被檢出[3]。有研究報道，氯乙酰胺類除草劑除具有本身特性外，其降解產物毒性更強[4-6]。因此，環境中殘留的甲草胺對非靶標生物以及生態環境的潛在風險不容忽視。

自20世紀80—90年代以來，國內外對甲草胺毒理學展開了相關研究，明確了甲草胺在高濃度下具有致畸性及內分泌干擾活性[7-8]，因此甲草胺已被部分國家或地區禁用。加拿大農業部宣布自1985年12月31日起，禁止美國孟山都公司除草劑甲草胺的銷售[9]；日本國立研究所也因為甲草胺具有致畸性及內分泌干擾活性，而將其列入具有內分泌干擾作用的黑名單[10]；在2011年6月20—24日，鹿特丹公約第五次會議決定將甲草胺列入《鹿特丹公約》附件三，自2011年10月24日起適用事先知情同意程序[11]。甲草胺原藥和制劑在中國多個農藥生產廠家仍具有登記，然而，目前關于甲草胺毒理學研究較為零散，缺乏系統性總結與歸納。基于此，本文擬從急性毒性、慢性毒性和氧化應激效應等方面綜述甲草胺對非靶標生物的毒性效應(表1)，旨在為甲草胺的環境安全評價提供數據資料。

表1 甲草胺對非靶標生物的毒性效應Table 1 Toxic effects of alachlor to non-target organisms

1 急性毒性

藻類是淡水水體中常見的類群，對群落初級生產及富營養水體的凈化起著重要作用。甲草胺對藻類生長具有一定的抑制作用。Paule[12-13]等研究了光營養生物膜群落對甲草胺的敏感性，結果發現，群落中藻類細胞的數量和甲草胺濃度呈顯著的負相關，甲草胺能顯著抑制光營養生物膜的生長。甲草胺對普通小球藻Chlorella vulgaris的96 h的EC50值為5.54 mg/L，當甲草胺的質量濃度為0.8、1.6、3.2、6.4和12.8 mg/L時，抑制率分別為37%、39%、44%、48%和62%；該研究還表明，甲草胺通過影響普通小球藻葉綠素a的含量從而對其生長產生一定的影響[14-15]。甲草胺對鞭毛藻Ostreococcus lucimarinus的72 h的EC50值為0.373 mg/L，隨著甲草胺劑量的增加和暴露時間的延長，其光合效率和葉綠素含量顯著降低，光合作用相關基因PmpsbA、PmatpB和PmrbcL的轉錄水平均被顯著誘導上升[16]。此外，還有研究發現，甲草胺對馬昆德擬青霉菌Paecilomyces marquandii和菲氏弧菌Vibrio fischeri的生長均有抑制作用，其EC50值分別為50.0和72.4 mg/L[17-18]。Hirase等[19]研究發現，2.7 mg/L的甲草胺暴露可顯著抑制高粱芽長，抑制率達50%以上。EINahhal等[20]研究發現，甲草胺暴露對甜瓜、苦菜和小麥生長均有抑制作用，其48 h的EC50值分別為11.37、0.11和3.91 mg/kg，表明不同作物對甲草胺敏感性不同。

2 慢性毒性

2.1 致畸、致癌和致突變

畸形 (malformation) 是指發育生物體解剖學上形態結構的缺陷，致畸試驗是有毒物質的安全性毒理評價的重要組成部分。Park等[21]研究表明，甲草胺對斑馬魚Danio rerio胚胎具有致畸效應，隨著甲草胺暴露質量濃度 (1、3、5、8、10 mg/L)的增加，斑馬魚胚胎孵化率逐漸降低，并出現心包囊水腫、游囊關閉、軀干彎曲等癥狀。斑馬魚幼魚在10 mg/L的甲草胺暴露下會出現體型彎曲、水腫以及活動遲緩等形態學異?，F象[22]。大比目魚Hippoglossus stenolepis幼蟲在1 mg/L的甲草胺暴露下表現出發育缺陷，包括心包水腫和骨骼畸形[23-24]。此外，還有研究表明，甲草胺對兩棲動物的形態發育具有毒性作用。例如：甲草胺對非洲爪蟾Xenopus laevis胚胎具有致畸性，其致畸指數 (teratogenic index, TI) 為1.7[25]；1.25、2.5、5和10 mg/L的甲草胺暴露可導致東方鈴蟾Bombina orientalis發育畸形，包括軀干彎曲、尾彎、體厚和腹面水皰，其畸形率呈濃度依賴性增加[7]。

美國環境保護署于1984年對甲草胺的風險性開展過全方位評估，通過甲草胺在大鼠上的試驗證實了甲草胺對哺乳動物有致腫瘤的可能性[26]。有學者在此基礎上對甲草胺的致癌機制展開了進一步研究。Nelson等[27]研究發現，1 mg/mL的甲草胺和小牛胸腺DNA在體外能形成加合物，而DNA加合物的形成是藥劑致癌過程的關鍵一步[28]，同時闡明了甲草胺潛在致癌的可能性機制。以甲草胺126 mg/(kg·d) 的劑量持續飼喂雄性大鼠120 d，其甲狀腺濾泡上皮出現肥大、肝臟尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶活性和血清促甲狀腺激素水平顯著增加，這些均與大鼠甲狀腺腫瘤發病相關[29]。Genter等[30]用260mg/(kg.d)劑量的甲草胺連續3個月飼喂小鼠，發現其嗅覺黏膜形態異常，黏膜內嗜酸性物質明顯積累。Genter進一步研究發現，甲草胺能誘導基質金屬蛋白酶MMP-2(matrix metalloproteinase 2, MMP-2) 和MMP-9(matrix metalloproteinase 9, MMP-9) 基因表達顯著上調，MMP抑制劑能降低經甲草胺處理的大鼠的腫瘤發病率[31]。

甲草胺能誘導生物產生突變。研究發現，甲草胺暴露可導致大鼠和小鼠的骨髓細胞出現染色體損傷，其染色體畸變頻率呈劑量依賴性增加[32-33]。甲草胺暴露能導致人外周血淋巴細胞姐妹染色單體交換的頻率顯著增加和染色體畸變的形成，表明甲草胺會導致人外周血淋巴細胞染色體損傷[34-35]。甲草胺處理后能顯著增加胡盧巴Trigonella foenum-graecum細胞染色體畸變率，且其有絲分裂指數呈濃度依賴性降低，表明甲草胺對胡盧巴具有遺傳毒性[36]。Torres等[37]研究發現，甲草胺能誘導黑腹果蠅Drosophila melanogaster性狀改變，270 mg/L的甲草胺暴露可導致黑腹果蠅翅斑總斑點的頻率顯著增加。Bonfanti等[38]研究發現，108 mg/L的甲草胺能誘導大鼠肝細胞體外活化，導致DNA損傷。Ribas等[39]對人外周血淋巴細胞進行單細胞電泳 (single cell gel electrophoresis, SCGE) 檢測，發現甲草胺暴露可導致人外周血淋巴細胞DNA斷裂損傷。鯉魚暴露于10、25、50和100 μg/L的甲草胺中4 d，其血細胞中DNA鏈出現斷裂，并呈現濃度依賴性增加[40]。虹鱒魚Oncorhynchus mykiss在1.52、3.44和7.60 μg/L的甲草胺中暴露10 min，其性腺細胞DNA鏈出現明顯斷裂，暴露30 min后性腺細胞DNA鏈斷裂較對照組顯著增加[41]。此外，甲草胺能誘導藍藻產生不同類型突變，包括對有毒化學物質耐受性的正向突變、營養缺陷型突變和原生營養體突變[42-43]。

2.2 內分泌干擾效應

多種酰胺類除草劑屬于環境內分泌干擾物(environmental endocrine disruptors, EEDs)，具有內分泌干擾活性。環境雌激素是一類具有干擾生物體內正常內分泌物質的合成、運輸、代謝等過程，從而破壞機體內部穩態的化合物。據報道，甲草胺具有雌激素活性，能與生物體內雌二醇競爭性地結合雌激素受體，進而影響生物正常生命活動[44-45]。以50 mg/(kg·d) 劑量的甲草胺飼喂大鼠30 d后發現，雄性大鼠睪丸和甲狀腺的相對質量增加，雌性大鼠卵巢的相對質量下降，雌鼠血漿中甲狀腺激素T4和睪酮T的含量顯著減少[8]。甲草胺對人類精子的運動也有一定影響，暴露于甲草胺 (0、48、100、240和500 mg/L) 后，活精子率、游動精子率和精子流速均呈濃度依賴性下降[46]。

水環境是很多環境污染物的聚集地，魚類是用來研究內分泌干擾作用的理想水生生物。低濃度的甲草胺 (250 μg/L) 暴露對鯽魚Carassius auratus有內分泌干擾作用，可抑制鯽魚的肝臟和精巢的生長、發育，破壞精巢結構，導致性腺指數和肝指數顯著下降；甲草胺暴露還能導致鯽魚體內的血清雌二醇、促甲狀腺激素和甲狀腺激素水平顯著上升，睪酮水平顯著下降，鯽魚體內雌二醇/睪酮值顯著增加，表明甲草胺能顯著干擾其體內性激素平衡[47-49]。由此可見，甲草胺可影響非靶標動物生殖細胞正常發育，導致生物體內激素水平的失衡，但其具體致毒機制有待進一步深入研究。

3 氧化應激效應

生物體內氧化和抗氧化作用失衡會導致產生氧化應激，抗氧化劑酶可清除生物體內過量的活性氧自由基，對維持細胞內活性氧平衡和保護機體免受氧化損傷具有關鍵作用。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD) 和過氧化氫酶 (catalase,CAT) 是生命體應對氧化應激的第一道防線，其活性的變化可作為誘導氧化應激的生物標志。研究表明，用50 mg/L的甲草胺處理淡紫擬青霉Paecilomyces lilacinus48 h，該霉的SOD和CAT活性顯著降低，處理96 h后其CAT活性被誘導升高[50]。5和50 mg/L的甲草胺暴露可顯著抑制萵苣和豌豆種子中SOD和CAT活性，但萵苣和豌豆葉片經5 mg/L的甲草胺處理后，其SOD和CAT活性顯著增加，表明萵苣和豌豆種子較葉片對甲草胺更為敏感[51]。Kim等[52]研究發現，單角輪蟲Brachionus koreanus暴露于300 μg/L的甲草胺24 h后，體內總SOD蛋白酶的活性顯著降低，Bk-Cu/Zn-SOD轉錄水平顯著上調，而Bk-Mn-SOD轉錄水平較對照無顯著差異。谷胱甘肽S-轉移酶(glutathioneS-transferase, GST) 是參與宿主細胞解毒的關鍵酶。Jin-Clark等[53]研究發現，1 mg/L的甲草胺暴露使水搖蚊Chironomus tentansGST的總活性降低50%，乙酰膽堿酯酶 (acetylcholine esterase, AChE) 活性降低30%。將水搖蚊暴露于1、10、100和 1 000 μg/L的甲草胺72 h，其體內GST活性呈濃度依賴性降低，在100和1 000 μg/L處理組中，GST的活性分別降低了65.5%和73.5%，進一步研究發現，CtGSTs2和CtGSTs3的轉錄水平和甲草胺的暴露濃度呈顯著正相關[54]。將釀酒酵母暴露于400 mg/L的甲草胺，其細胞內活性氧含量顯著增加，谷胱甘肽的產生受到抑制，而其利用率卻顯著增加，表明谷胱甘肽在保護細胞免受甲草胺侵害方面具有重要作用[55]。低濃度的甲草胺持續暴露也能導致生物體內產生氧化應激效應。持續低濃度 (1、4、16 μg/L)的甲草胺暴露60 d會對鯽魚肝臟谷胱甘肽 (glutathione, GSH)、解毒代謝關鍵酶GST和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶產生干擾[56]。在0.175 mg/L的甲草胺中暴露30 d，尼羅羅非魚Oreochromis niloticus的血清、腦和腎臟中AChE和GST的活性均顯著增加，并出現了輕微的組織損傷[57]。

甲草胺暴露可導致生物體內活性氧自由基的積累，即使在安全劑量下，甲草胺也能誘導生物體內產生氧化應激，導致體內氧化與抗氧化作用失衡，干擾相關酶活性，影響生物正常生命活動。生物體內的抗氧化酶活性以及相關基因轉錄水平的變化有助于對甲草胺暴露后產生的脂質過氧化損傷起到保護作用。

4 其他毒性

甲草胺能抑制生物的生長發育，干擾生物體內能量合成及代謝。甲草胺對游離和固定化藍藻Cyanobacteria的生長速率均表現出顯著的抑制作用，在25 mg/L的甲草胺中暴露8 d，藍藻的葉綠素a含量、蛋白質含量和異形胞頻率均被抑制[58]。淡水魚龐克雷龍魚Channa punctata暴露于亞致死濃度 (1.2 mg/L) 的甲草胺中10 d，其體內能量來源糖原和總蛋白質含量均顯著降低，相關代謝酶天門冬氨酸氨基轉移酶、丙氨酸氨基轉移酶和乳酸脫氫酶活性被誘導上升[59]。甲草胺暴露能顯著延長豚草條紋葉甲Zygogramma suturalis的發育時間，其種群生長參數和繁殖力均顯著降低[60]。

細胞毒性是指化學物質作用于細胞基本結構或生理過程，影響細胞存活、增殖和功能的紊亂等。27 mg/L甲草胺暴露能破壞虹鱒魚性腺RTG-2和人神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞系的細胞質膜完整性[61]。還有研究表明，7.6 μg/L的甲草胺暴露能顯著抑制虹鱒魚性腺RTG-2細胞系活力，其生長率呈濃度依賴性降低[41]。淋巴細胞是白細胞的一種，由淋巴器官產生，是生物體免疫應答功能的重要組成部分。甲草胺對鯽魚淋巴細胞生長活性的影響呈劑量-效應關系，其抑制中濃度 (IC50)為 27.7 μg/L；當甲草胺的質量濃度大于7 μg/L時，淋巴細胞增殖受到明顯抑制，表明其對鯽魚存在免疫毒性[62]。甲草胺 (54 mg/L) 還能誘導小鼠巨噬細胞系細胞凋亡，進而影響機體對病原體的免疫應答[63]。鯉魚Cyprinus carpio在2.4 mg/L的甲草胺中暴露28 d，其平均紅細胞血紅蛋白濃度顯著降低，出現貧血狀態[64]。

5 總結

雜草苗前防治對田間雜草的控制至關重要。氯乙酰胺類除草劑是目前世界上使用量最多的芽前除草劑，對未出芽雜草具有很好的防治效果，并具有廣譜、低殘留等特性，被廣泛應用于田間防除多種禾本科雜草和闊葉雜草，以乙草胺、丁草胺、異丙甲草胺等為代表的氯乙酰胺類除草劑在中國乃至全球市場占據重要的地位[65-66]，然而其帶來的生態環境以及人類健康問題也不容忽視。氯乙酰胺類除草劑對哺乳動物急性毒性較低，但是對浮游動物以及低等脊椎動物毒性較高。此外，有研究表明，氯乙酰胺類除草劑 (如乙草胺、丙草胺、丁草胺和異丙甲草胺等) 能導致非靶標生物產生氧化應激和內分泌干擾效應，并具有致畸、致癌的風險[67-69]。然而，不同種類的氯乙酰胺類除草劑對非靶標生物的致毒機制不同，不同生物對其敏感性也不同，如乙草胺可作為雌激素活性物質干擾斑馬魚甲狀腺和性腺的發育[70-71]，異丙甲草胺可通過干擾雄性大鼠芳香化酶的合成，進而影響類固醇激素的合成[72]。因此，開展酰胺類除草劑對非靶標生物的毒理學研究，比較分析酰胺類除草劑對非靶標生物的毒性差異，對于酰胺類除草劑科學合理使用以及其安全性評價具有重要意義。

本文以甲草胺的毒理學研究為側重點，系統總結了甲草胺對非靶標生物的毒性效應。綜上所述，甲草胺能抑制水生生物的生長發育，造成水生生物的形態異常。此外，甲草胺具有內分泌干擾活性，能干擾生物體內激素的穩態，影響性腺的發育，導致生殖毒性；多項研究證實甲草胺能誘導生物產生突變，并對哺乳動物存在致癌的可能。有關甲草胺對非靶標生物的內分泌系統潛在的致毒機制有待進一步研究；甲草胺在環境介質中的遷移、富集對人類的風險也不容忽視。