生物檢材中有機磷農藥代謝物檢測技術研究進展

張成龍, 國 菲, 楊瑞琴*,, 李 鵬*,,3

(1. 中國人民公安大學 偵查學院，北京 100038；2. 山東省淄博市公安局刑偵支隊，山東 淄博 255000；3. 山西醫科大學，太原 030001)

有機磷農藥是人工合成的磷酸酯類化合物，具有廣譜、高效和低殘留等特點，在國內外農業和園林種植領域得到廣泛應用[1-2]。該類物質毒性大，因誤服導致的急性中毒事件、自殺和投毒事件時有發生。據世界衛生組織報道，每年有300多萬起有機磷農藥意外中毒事件和自殺、投毒案件發生[3]。要想查明真相，確定中毒毒物的種類及含量，及時快速開展毒物檢驗工作是第一步，但大多數有機磷農藥體內代謝或體外分解較快[4-6]，從中毒發生到檢材提取再到檢材檢測有一定時間的延遲，致使有機磷農藥定量檢測濃度與實際中毒濃度往往相差較大，送檢不及時，甚至會出現假陰性現象。有機磷農藥代謝物作為中毒生物標志物之一[7]，具有監測有機磷農藥接觸水平[8-11]、毒性反應[12-14]及預測可能毒性的作用[15-16]。因此，對生物檢材中有機磷農藥代謝物的準確檢測具有重要意義。

1 有機磷農藥體內代謝概述

有機磷農藥通過無損皮膚、消化道及呼吸道等途徑進入人體內后，可迅速分布于全身臟器并與乙酰膽堿酶結合，造成輕重不等的中毒現象[17]。有機磷農藥種類不同，其在體內的代謝也有一定差異[18]，其中肝細胞多功能氧化酶的氧化作用和磷酸三酯酶的水解作用為其在體內主要代謝途徑[19-21]。其代謝物大體可分為兩類：一類是二烷基磷酸酯類化合物 (DAP)。多數有機磷農藥可代謝為1種及1種以上的DAP[22]，人體在接觸有機磷農藥后的24～48 h 在尿流中可檢測到DAP[7]，DAP包括磷酸二甲酯 (DMP)、磷酸二乙酯 (DEP)、二甲基硫代磷酸酯 (DMTP)、二乙基硫代磷酸酯 (DETP)、二甲基二硫代磷酸酯 (DMDTP) 和二乙基二硫代磷酸酯(DEDTP) 6種化合物。另一類是特殊代謝物(SM)。SM是一種或少數幾種有機磷農藥的代謝物，具有特異性。在實際案件中，可結合具體案情確定農藥的種類，例如：2-異丙基-4-甲基-6-羥基嘧啶 (IMPY) 為二嗪磷的特殊代謝物，2-(二乙氨基)-6-甲基-4-羥基嘧啶 (DEAMPY) 為甲基嘧啶磷的特殊代謝物，對硝基酚 (PNP) 為對硫磷和甲基對硫磷特殊代謝物，3,5,6-三氯-2-吡啶醇 (TCP)為毒死蜱和甲基毒死蜱的特殊代謝物等[22-23]。

2 有機磷農藥代謝產物實驗室檢測技術及應用

2.1 氣相色譜分析技術

氣相色譜 (GC) 技術是實驗室常用的分析手段之一，靈敏度較高，其中火焰光度檢測器的使用對含磷的代謝物具有良好選擇性。由于二烷基磷酸酯類化合物極性較高，采用GC進行檢測時，前處理常用五氟芐基溴 (PFBBr) 對6種DAP進行衍生反應以降低其極性，但該過程繁瑣費時，且衍生試劑具有強烈刺激性氣味，污染環境。

Aprea等[24]介紹了一種精確、重現性強的定量測定尿樣中6種DAP的分析方法。分別在室溫和90 ℃條件下對尿樣中含硫DAP和不含硫的DAP分兩步衍生，經CN柱凈化，用毛細管氣相色譜?火焰光度檢測器 (GC-FPD) 技術檢測。該方法準確度及精密度均較高，檢出限在2～3 ng/mL之間，可滿足職業暴露和普通人群中的DAPs檢測。Oglobline等[25]采用改進的氣相色譜法分析了有機磷農藥接觸工人尿液中的6種DAP，通過PFBBr對6種DAP進行衍生化處理，尿液樣本經凍干后，采用雙毛細管柱GC-FPD方法測定，檢出限為5～50 ng/mL。該方法前處理使用冷凍干燥機處理可大大縮短樣本制備時間，適用于職業性接觸有機磷農藥工人尿液的大批量常規分析。

楊玉林等[26]采用GC-FPD檢測技術建立了尿液中6種DAP的定量分析方法。通過衍生化溫度、時間等條件的優化，選用50 ℃下進行PFBBr一步衍生，反應14～16 h，以二丁基磷酸酯 (DBP)為內標，直接進樣，大大簡化了操作步驟，并在衍生過程中充入高純氮，有效避免了含硫代謝物的氧化。6種DAP在100 ng/mL下的檢出限為2～15 ng/mL，回收率為66%～90%。金忠秀等[27]創建了血漿中有機磷農藥含硫代謝物DETP、DEDTP的GC-FPD檢測方法。結果表明，經V(乙醚) :V(乙腈) = 1 : 1液-液萃取后，40 ℃下用PFBBr進行衍生反應4 h，能有效避免基質中相鄰峰干擾，并提高分析效率。DETP和DEDTP的回收率分別為92.46% 和 98.10%，檢出限分別為5.0 ng/mL和 1.0 ng/mL，經實際樣本檢測，證明該方法對大批量低接觸有機磷農藥的普通人群的分析極為有利。

2.2 氣相色譜-質譜聯用分析技術

氣相色譜-質譜聯用 (GC-MS) 技術結合了色譜的高分離效能和質譜的定性準確特點，具有更高的靈敏度和更低的檢出限，樣本用量少，近年來被廣泛應用于有機磷農藥代謝物的檢測分析。

Ueyama等[28]創建了安全、靈敏的GC-MS方法，可實現對尿液中DMP、DEP、DMTP和DETP的同時檢測，并對pH值對氮吹蒸發的影響、衍生反應的溫度和時間、抗氧化劑的添加以及凈化步驟進行了優化，檢出限和定量限分別為0.1～0.3 ng/mL和0.3～1 ng/mL，回收率為60.5%～92.4%。之后，Ueyama等[29]對上述方法進行了改進，在衍生反應前增加脫水處理，并使用氣相色譜-電子轟擊離子源-質譜 (GC-EI-MS) 進行檢測。4種分析物的檢出限和定量限分別為0.05～0.15 ng/mL和0.20～0.50 ng/mL，相對標準偏差在15.7%以下，改進后的方法在高通量和低成本的情況下，獲得了更高的靈敏度和精密度。

Alwis等[30]介紹了一種自動固相萃取、同位素稀釋結合GC-MS/MS技術分析尿液中6種DAP的方法，分析物經過自動離線固相萃取裝置提取后，采用1-氯-3-碘丙烷進行衍生反應，檢出限為0.05～0.17 ng/mL，回收率為56%～104%。該方法省時、省力、重復性高，樣本制備時間短，只需4 h，是之前所用時間的1/5[31]。Bravo等[32]同樣采用同位素稀釋結合GC-MS/MS技術對尿液中6種DAP進行定量分析，前處理使用凍干法，6種DAP檢出限為0.1～0.6 ng/mL，回收率為75%～100%。通過對1 100份美國加利福尼亞州孕婦和兒童尿液樣本檢測分析，證實該方法的靈敏度可用于一般人群監測。之后，Alwis等[33]以磷酸二丁酯 (DBP)為內標，對尿液中6種DAP進行自動固相萃取后，改用PFBBr進行衍生化反應，GC-MS檢測，檢出限為0.1～0.15 ng/mL，回收率為58%～119%。較之前方法相比保持了簡單、快捷、準確等優點，而且更為經濟、普適，為大規模生物檢材的監測提供了技術支撐。

Margariti等[34]開發并驗證了GC-MS 法定量測定頭發中3種DAP (DMP、DMTP、DEP) 的分析方法。前處理包括去污步驟、固液萃取、液-液萃取、PFBBr衍生化和Florisil/PSA柱凈化。向空白頭發樣品中添加1 和10 ng/mg分析物，回收率為56.1%～107.9%，日內相對標準偏差為13.5%～17.5%。檢出限為0.02～0.10 ng/mg 。Elodie等[35]采用GC-MS技術對血清和頭發樣品中的DMP進行檢測，以研究尿道下裂與有機磷農藥接觸的關系。頭發前處理步驟包括去污、干燥粉碎、超聲輔助固-液萃取、PFBBr衍生化后氮吹至近干，定容后進樣；血清前處理主要是在酸性條件下液-液萃取，之后采用PFBBr衍生化后氮吹至近干，定容后進樣。研究結果表明，后代尿道下裂，父母血清和頭發樣本中DMP的濃度比一般人群報告的要高得多，并支持有機磷農藥暴露可能是尿道下裂的潛在危險因素的假設。孫?琳[36]建立了高分離度、高精確性的GC-MS法，對血液和組織器官樣本中對硫磷及其4種代謝物 (對氧磷、DETP、DEP和PNP) 進行檢測分析，并對對硫磷的體內代謝轉化進行了研究。通過優化分流比、升溫程序、質譜設置等條件的優化，5種分析物在30 min內可完成分離檢測，檢出限為2.0～16.7 ng/mL，線性范圍6.25～500 ng/mL。

Guo等[37]建立了高靈敏度GC-MS/MS方法，對尿液中DMP、DMTP、DETP和TCP進行分析，除TCP外，采用多反應離子監測 (MRM) 結合保留時間定性，內標法定量。結果檢出限、定量限分別為 0.083～0.667 ng/mL、0.2～2.0 ng/mL，回收率為54.1%～68.6%。該方法選用硅烷化試劑N-(叔丁基二甲基硅烷基) -N-甲基三氟乙酰胺(MTBSTFA) 對分析物進行衍生化，所需時間大幅縮短，且不需要其他試劑參與。李曄等[38]采用GC-MS技術對尿液中DMP、DEP、DETP、DMDTP和DEDTP 5種DAP進行了測定。多篇文獻給出50 ℃條件下反應16 h的PFBBr衍生條件[26]，該研究基于乙腈沸點，采用80 ℃下衍生反應30 min，并加入焦亞硫酸鈉作為抗氧化劑，DAPs在0.05～10 mg/L內線性關系良好，回收率為51.6%～90.8%，檢出限為1～2 ng/mL，該方法在有效保證檢測準確度的同時加快了檢測速度，適用于對中毒物快速檢測。

Takayasu等[39]應用GC-MS技術報道了中毒病例死后甲基毒死蜱、殺蟲磷及其代謝物 (TCPY、3MNP) 在血液、尿液和器官組織中的分布。對各類檢材主要采用Extrelut? NT柱進行固相萃取，并在85 ℃條件下采用N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺 (含1% 三甲基氯硅烷) 對TCPY、3MNP進行衍生反應，為提高定量準確性，在尿液處理前過程中加入β-葡萄糖醛酸酶，以水解目標物的葡萄糖醛酸軛合物。其中TCPY、3MNP在血液中的定量限均為10 ng/mL，回收率分別為76%～94.3%、83.9%～102%；在尿液中定量限也均為10 ng/mL，回收率分別為77.4%～95.4%、85.2%～99%。

2.3 液相色譜-質譜聯用分析技術

液相色譜-串聯質譜 (LC-MS/MS) 技術具有靈敏度高、重現性好、分辨率高和簡便高效等優點，與其他檢測方法相比，其不需要衍生化，前處理簡單安全，對環境污染較小，但儀器造價和運行成本較為昂貴。

Dulaurent等[40]首次報道了溶劑萃取前處理結合LC-MS/MS技術對尿中的6種DAP同時進行檢測，使用ODS3 C18色譜柱分離，多反應監測 (MRM)模式下進行質譜檢測。檢出限為0.5～1.3 ng/mL。該方法靈敏度高，在環境暴露的志愿者尿液中檢測到DAP的存在，證實了LC–MS/MS技術在該領域的適用性，但6種DAP的回收率偏低，均在70%以下。

Odetokun等[41]開發了全自動固相萃取結合高效液相色譜-電噴霧電離-串聯質譜技術，對尿中6種DAP進行定量分析。該操作系統采用96孔板-弱陰離子交換固相萃取板對分析物進行自動提取后直接進樣，萃取效率為40%～98%，檢出限為0.044～1.549 ng/mL。該方法大大減少了工作量，提高了工作效率，每周可檢測1 152份樣本，是之前檢測量的兩倍[32]，可用于職業和非職業有機磷農藥暴露的環境及應急生物監測。Ueyama等[29]開發了一種靈敏、可靠的固相萃取結合液相色譜-串聯質譜技術，檢測尿液中DMP、DEP、DMTP和DETP的含量，并實際應用于日本兒童尿液中DAPs濃度的測定。該方法的優勢是使用包含陰離子和陽離子配體的多模式ODS色譜柱，能較好地保留4種較高極性分析物，該方法的靈敏度較高，檢出限低于0.4 ng/mL。該研究成為評估人類有機磷農藥暴露風險的重要一步。

王娜等[42]建立了尿中毒死蜱等有機磷農藥特殊代謝物3,5,6-三氯-2-吡啶醇 (TCP) 的超高效液相色譜-串聯質譜 (UPLC-MS/MS) 分析檢測方法。前處理選用V(二氯甲烷) :V(乙酸乙酯) = 20 : 80溶液對待測物進行液-液萃取，回收率高達97.9%，在電噴霧電離負離子 (ESI?) 模式下，選擇離子監測(SIR) 方式檢測，檢出限為0.41 ng/mL。該方法為生物負荷的痕量監測提供了技術支撐。Davis等[43]采用高效液相色譜-串聯質譜 (HPLC-MS/MS) 技術，對尿液中幾種農藥的12種生物標記物進行定量分析，其中包括有機磷農藥的5種特殊代謝物(PNP、TCPY、MDA、IMPY、DEAMPY)。該方法通過使用較窄直徑的分析柱和對每個分析物使用同位素稀釋量化，可以達到示蹤級分析所需的選擇性和靈敏度，檢出限低至0.04 ng/mL，回收率為94.1%～98.0%。周志榮等[44]建立了對尿液中DMDTP、DEP、DEDTP、PNP、CMHC和TCPY LC-MS/MS測定方法。采用近年國外尿樣中使用的水酶解技術進行前處理，并對固相萃取柱、流動相、離子源進行了優化，檢出限在2 ng/mL以下，回收率為79%～130%。該方法可同時檢測DAPs和SMs，為進一步擴大有機磷農藥代謝物檢測范圍奠定了基礎。

Roca等[45]開發了液相色譜靜電場軌道肼高分辨質譜方法 (LC-HRMS)，可同時檢測尿液中6種DAP和多種SM，是目前國內外可同時檢測有機磷農藥代謝物種類最多的技術。該方法使用全掃描模式，一次檢測可完成對正負離子的同時掃描，可實現對多種物質的同時檢測，大大簡化了操作步驟，縮短了檢測時間。在前處理過程中使用β-葡萄糖醛酸酶進行水解，創新性地采用改進的QuEChERS技術進行提取，有效地降低了基質效應，提高了回收率。各有機磷農藥代謝物在0.8～200 ng/mL內線性關系良好，定量限為0.8～50 ng/mL，回收率為60%～120%。

3 有機磷農藥代謝產物快速檢測技術及應用

快速檢測技術操作簡便、結果直觀，在現場初篩和生物監測方面發揮著重要作用[46-47]。在中毒案件中，快速檢測技術可縮小實驗室檢測范圍或直接篩查出中毒因子，為搶救中毒者贏得時間。本文介紹了3種常見的有機磷農藥代謝物快速檢測方法：熒光探針法、免疫分析法和生物傳感器法。

3.1 熒光探針法

典型的熒光探針由識別基團 (受體)、熒光團和連接兩者的連接基團所組成。熒光探針法是受體和底物集合后，導致受體分子的光物理性質發生變化，從而熒光團部分發生熒光淬滅或增強的方法[48]。Wang等[49]報道了EU3+功能化的Hf-MOF熒光探針 (Eu3+@1) 探測尿液中對硫磷和甲基對硫磷特殊代謝物對硝基苯酚 (PNP) 和殺螟松特殊代謝物3-甲基-4-硝基苯酚 (PNMC)。Hf-MOF探針上的有機配體可向Eu3+傳遞能量敏化Eu3+發光[50]，而PNP和PNMC與Eu3+@1在紫外吸收光譜上存在部分重疊，PNP和PNMC對輻射光競爭吸收可降低有機配體向Eu3+的傳能效率，導致其熒光淬滅而被檢測出來。該熒光探針對水和pH耐受性強，在1 min內可完成檢測，PNP和PNMC的檢出限分別為0.36 μg/mL和 0.41 μg/mL，具有快速、高效和高選擇性等優點。此外，該熒光探針可循環使用，綠色環保，節約成本。

3.2 免疫分析法

免疫分析法是利用毒物與標記毒物競爭性結合抗體，從而檢測毒物的方法[51-52]。Zhang等[53]報道了檢測人體唾液中毒死蜱特殊代謝物TCP的納米金免疫層析 (ITS) 技術，該技術是免疫分析法的一種，當待測物與膜上固定的納米金標記的抗體 (或為抗原) 特異性結合后，復合物再與膜上檢測線的抗原 (或為抗體) 相結合，根據檢測線的顏色深淺進行定量。作者采用實驗室研制的前處理緩沖液對ITS樣本墊進行預處理，優化了Au納米顆粒與TCP抗體偶聯比等參數，實現了對TCP的高靈敏度和選擇性的直接檢測，TCP在0.625～20 ng/mL內線性關系良好，檢出限為0.47 ng/mL。

3.3 生物傳感器法

生物傳感器法是利用生物反應或生物物質間的親和作用，選擇性地檢測生物試樣或系統的化學成分、提供生產過程有關信息的方法[54-55]。Zou等[56]開發了一種便攜式量子點 (QD) 熒光免疫傳感器，用于血漿中毒死蜱特殊代謝物TCP的生物監測。該傳感器是生物傳感器的一種，抗體與TCY和QD-TCY偶聯體發生競爭性免疫反應后，根據其捕獲量子點的熒光量實現對血漿中TCY的定量分析。該技術集成了免疫層析法、量子標記技術和X射線光電子能譜、熒光光譜技術，具有簡單、快速和靈敏等優點。最佳條件下，可在15 min內完成檢測，檢出限為1.0 ng/mL，添加回收率102.0%，是床旁快速檢測和環境生物監測的新途徑之一。Wang等[57]也開發了用于血漿中TCP生物監測的免疫層析電化學生物傳感器，該裝置結合了電化學免疫傳感器和測流免疫層析技術，競爭性酶聯免疫反應在免疫色譜條帶上進行，絲網印刷的碳電極測定檢測區捕獲的HRP標記的抗體。與傳統的酶聯免疫吸附法相比，該裝置更為輕便、靈敏，檢出限低至0.1 ng/mL，為農藥中毒的臨床診斷和現場快速篩查提供了可能。

4 問題與展望

現階段，國內外對于有機磷農藥代謝產物的檢測分析雖已取得初步成果，但從實踐的角度來看，目前的檢測水平仍然存在一些問題：1) 有機磷農藥在生物體內的代謝規律研究還不全面，國內外文獻報道多針對原藥動力學開展研究。因此，今后應繼續深入研究有機磷農藥的體內代謝機制，及其代謝物的穩定性和分布規律，為更全面地檢測代謝物奠定基礎。2) 有機磷農藥代謝物快速檢測技術專屬性高，大多只適用于單一分析物的檢測，對于多種目標物同時進行檢測只能依賴于GC-MS、LC-MS/MS 等實驗室確證方法。為提高檢測效率，擴大檢測范圍，開發同時檢測生物樣本中包含DAPs和SMs在內的多種有機磷農藥代謝物的檢測技術顯得尤為重要。3) 目前采用的方法以色譜-質譜聯用法為主，需耗費大量的時間和有機溶劑對復雜基質進行提取和凈化，以保護儀器，消除基質干擾。因此，建立簡單、高效、綠色和環保的前處理方法將是今后發展趨勢之一。QuEChERS技術快速、低廉、針對大部分極性較高物質回收率高，在未來必會凸顯其重要性。4) 目前國內外的各種檢測技術多為生物監測而開發，檢測對象也以血、尿等活體生物檢材為主，為滿足公安機關辦理有機磷農藥中毒死亡案件的實踐需要，需進一步探索針對死者生物檢材的檢測技術，為相關案件的司法鑒定提供全面的科學依據。