天津市小麥田薺菜對雙氟磺草胺的抗性及其乙酰乳酸合成酶基因突變

李 琦, 于金萍, 郭文磊, 劉亦學*,, 張 惟

(1. 天津市植物保護研究所，天津 300381；2. 廣東省農業科學院 植物保護研究所/廣東省植物保護新技術重點實驗室，廣州 510640)

薺菜Capsella bursa-pastoris是十字花科薺菜屬草本植物，在中國分布廣泛，其適應性強、種子量大、競爭力強，成熟后易傳播，可造成作物嚴重減產，是中國小麥種植區的主要惡性雜草之一[1-2]。近年來，隨著氣候及耕作制度的改變，薺菜已成為天津市冬小麥田主要優勢雜草，嚴重影響小麥的產量與品質[3]。

乙酰乳酸合成酶 (acetolactate synthase，ALS，EC 4.1.3.18) 在植物體內主要催化亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸生物合成的第一階段，以ALS作為靶標的除草劑可以通過抑制該酶的活性，使雜草無法合成上述3種氨基酸而死亡[4-6]。鑒于其低毒、高活性和高選擇性的特點，ALS抑制劑類除草劑被長期用于防除麥田雜草，但由于此類除草劑作用位點單一，且長期大面積單一使用，導致其抗性問題十分嚴重[7]。截至2020年11月，全球已有165種雜草對ALS抑制劑類除草劑產生了抗性[8]。

雜草對除草劑的抗性機理一般分為靶標抗性(target site resistance) 和非靶標抗性 (non-target site resistance)。靶標抗性包括靶標酶的過量表達及其基因突變；非靶標抗性則包括雜草對除草劑解毒代謝能力的增強以及吸收轉運量的減少等[9]。研究發現，多數雜草對ALS抑制劑類除草劑產生抗性的主要原因是由于ALS基因保守區中的一個或幾個可變氨基酸被其他氨基酸替代所致，目前已經報道證實有8個ALS基因氨基酸位點的27種氨基酸替代類型與其抗性相關[10-11]。

雙氟磺草胺 (florasulam) 是美國陶氏農業科學公司開發的一種三唑并嘧啶磺酰胺類 (triazolopyrimidines，TP) 除草劑，屬于ALS抑制劑類，于2001年在我國正式獲準登記，可防除小麥田大多數闊葉雜草。小麥是天津市重要的糧食作物之一，薺菜等闊葉雜草在天津市部分地區的小麥田發生危害較嚴重。近年來，天津市部分地區農戶反映雙氟磺草胺對小麥田薺菜防治效果較差，推測薺菜可能對雙氟磺草胺產生了抗性，但其具體抗性水平、抗性機制尚不明確。為此，本研究在天津市靜海區、武清區、寶坻區及薊州區等薺菜發生嚴重區域的冬小麥田采集部分薺菜種群，測定了其對雙氟磺草胺的敏感性，并擴增、比對了敏感和抗性種群的ALS基因片段，以期為薺菜的有效防除及除草劑的合理使用提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

雜草種子：于2018年6月，從天津市靜海區、武清區、寶坻區及薊州區等地冬小麥田采集薺菜Capsella bursa-pastoris種群共6個，分別編號為TJ01、TJ02、TJ03、TJ04、TJ05和TJ06；另從天津市農業科學院核心區內未使用過任何除草劑的非耕地采集1個薺菜種群，作為敏感對照，編號TJ12。采集地點等具體信息見表1。

表1 供試薺菜種群采集點信息Table 1 Location of C. bursa-pastoris populations collected

供試除草劑：50 g/L雙氟磺草胺 (florasulam)懸浮劑 (SC)，天津市華宇農藥有限公司。

生物試材：植物基因組DNA提取試劑盒，北京全式金生物技術有限公司?；驍U增引物由金唯智 (天津) 生物科技有限公司合成。

主要儀器：ASS-4型自動控制噴灑系統，北京盛恒天寶科技有限公司；5804R型臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；T100型PCR儀，美國Bio-Rad公司；DYY-8C型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；HDL潔凈工作臺，北京東聯哈爾儀器制造有限公司；RXZ-280C植物培養箱，寧波江南儀器廠；GZX型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海躍進醫療器械有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 薺菜對雙氟磺草胺的抗性水平測定 采用整株水平測定法[12]。從各薺菜種群中選取籽粒飽滿均勻一致的種子，置于含2層濾紙的9 cm培養皿中，每皿加5 mL滅菌水保濕，將培養皿置于光照培養箱中催芽 (光周期：12 h/12 h；溫度：20 ℃/15 ℃)。將15粒露白的薺菜種子均勻播種于直徑12 cm的塑料盆內，置于可控溫室中培養 (自然光照，溫度20～35 ℃，相對濕度50%～70%)。待生長至2片真葉時間苗，每盆留長勢基本一致的薺菜10株。

待長至3～4葉期，用ASS-4型自動控制噴灑系統進行莖葉噴霧。噴霧壓力為0.275 MPa，噴液量450 L/hm2。根據預試驗，設定雙氟磺草胺的處理劑量 (有效成分用量) 分別為：抗性種群 (R)，0、0.06、0.3、1.5、7.5、37.5、187.5 g/hm2；敏感種群 (S)，0、0.012、0.06、0.3、1.5、7.5、37.5 g/hm2。每處理重復3次，試驗共重復2次。噴藥后21 d，剪取薺菜地上部分，于恒溫干燥箱內75 ℃下烘干72 h，稱量干重并記錄。

1.2.2 薺菜ALS基因片段克隆 從薺菜抗性和敏感種群中分別隨機選取20株進行基因組DNA提取。待薺菜生長至4葉期后，剪取單株幼嫩葉片，采用植物基因組DNA提取試劑盒提取DNA。采用已報道的兩對引物序列[13]：Forward 1(5′-ATTCGTCTCCCGATTTGC-3′)/Reverse 1 (5′-GCCCGACACCAGTGCTTAT-3′) 和Forward 2 (5′-GGTATCCCTGTTGCGAGTA-3′)/Reverse 2 (5′-GCATACAAAGACCGTTTA-3′)，用于薺菜ALS基因擴增，其擴增片段包含已報道與抗性相關的8個基因突變位點。PCR擴增反應體系總體積為25 μL，包括：1 μL基因組DNA模板，1 μL正向引物 (10 μmol/L)，1 μL反向引物 (10 μmol/L)，10 ×EasyTaqSuperMix 12.5 μL，9.5 μL無核酸酶水。反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，34個循環；72 ℃終延伸10 min。反應結束后，取5 μL PCR擴增產物于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測，將含目的條帶的PCR擴增產物送金唯智 (天津) 生物科技有限公司進行測序。將測序所得序列在NCBI上與薺菜ALS基因進行BLAST比對，用DNAMAN 6.0.3軟件對擴增所得敏感、抗性種群薺菜ALS基因進行比對分析。

1.2.3 數據處理 試驗數據采用雙邏輯非線性回歸模型y=C+ {(D–C)/[1 + (x/GR50)b]} 擬合劑量反應曲線，計算出抑制50%薺菜生長所需的除草劑劑量 (GR50值)。式中：y為除草劑某一劑量下薺菜干重相對于空白對照的百分比；x為除草劑劑量；C為劑量反應下限；D為劑量反應上限；b為斜率。

抗性倍數 (resistance index，RI) 計算公式為：RI = GR50(TJ01-TJ06)/ GR50(TJ12)。式中，GR50(TJ01-TJ06)為抗性種群的GR50值，GR50(TJ12)為敏感種群的GR50值。參考Beckie等[14]的方法對抗性情況進行分級：RI < 2為敏感，2 ≤ RI < 5為低水平抗性，5 ≤RI ≤ 10為中等水平抗性，RI > 10為高水平抗性。

試驗結果采用SPSS 20.0軟件的ANOVA方法進行統計分析，運用SigmaPlot 12.5軟件繪制劑量反應曲線。

2 結果與分析

2.1 不同薺菜種群對雙氟磺草胺的抗性水平

整株水平測定結果 (表2) 表明，所采集的6個薺菜種群對雙氟磺草胺都產生了高水平抗性，GR50值在5.7～23.6 g/hm2之間，與敏感種群TJ12相比，6個田間種群的抗性倍數在11.4～47.2之間。

表2 不同薺菜種群對雙氟磺草胺的抗性水平Table 2 Resistance ratio of C. bursa-pastoris to florasulam

2.2 薺菜抗性和敏感種群ALS基因差異

以提取的薺菜敏感和抗性種群單株基因組DNA為模板對ALS基因片段進行擴增，得到的兩條ALS基因序列拼接后長度為1 738 bp，與NCBI中薺菜ALS基因序列 (HQ880660.1) 的同源性達99%以上。擴增的ALS基因片段包含了所有已報道的ALS基因抗性突變位點。將抗性和敏感種群的ALS基因序列進行比對，結果顯示：在產生抗性的6個薺菜種群中，所有單株的ALS氨基酸序列的第197位氨基酸密碼子均由CCT突變為了TCT，從而導致脯氨酸 (Pro) 突變為絲氨酸(Ser) (表3)。對PCR產物測序結果進行比對分析，發現6個抗性種群中隨機選取的120個單株所發生的突變都是雜合型突變 (即197位密碼子為CCT/TCT)。

表3 薺菜抗性與敏感種群ALS基因序列比對分析Table 3 Sequence alignment and deduced amino acid of the resistant and susceptible C. bursa-pastoris populations

3 結論與討論

通過整株水平測定發現，采自天津市冬小麥田的6個薺菜種群TJ01、TJ02、TJ03、TJ04、TJ05、TJ06均對雙氟磺草胺產生了高水平抗性，其抗性倍數在11.4～47.2之間。連續重復使用單一作用機制的除草劑是導致雜草抗藥性產生的重要原因[15]。據報道，ALS抑制劑類除草劑連續重復使用3～5年以上，就可導致雜草產生抗性[16]。本研究中，抗性種群采集地塊皆有多年使用雙氟磺草胺防治闊葉雜草的歷史。此外，隨意提高施藥劑量、同一生產季度內多次施用具有相同作用機制的除草劑等不合理的施藥方式也加劇了雜草抗藥性的發生和傳播[17]。據張樂樂[18]報道，薺菜種子位于土壤表層時最適宜萌發，隨著埋藏深度增加其萌發率顯著降低，當超過1.2 cm時，萌發將完全被抑制。因此，在小麥種植前對土壤進行適度深耕，可有效降低薺菜的危害。此外，合理選擇不同作用機制的除草劑交替和混合使用也可以延緩雜草抗藥性的發生和發展。

靶標酶基因突變是雜草對ALS抑制劑類除草劑產生抗性的重要機制。本研究中，產生抗性的6個薺菜種群植株的ALS基因都發生了Pro-197-Ser突變，已有報道表明，多種雜草因該突變產生了對ALS抑制劑類除草劑的抗性[14]，因此，Pro-197-Ser突變很可能是本研究中薺菜抗性種群對雙氟磺草胺產生抗性的重要原因。Yu等[19]通過對ALS酶動力學的研究，發現Pro-197-Ser突變對ALS功能幾乎沒有影響，不會影響薺菜的正常生理過程，因此這可能是該突變形式在天津廣泛存在的原因之一。張樂樂[18]報道，薺菜的ALS基因中含有2個拷貝，并且這2個拷貝均可發生抗性基因突變，這可能是導致目前天津發現的抗性種群突變都是雜合型突變的關鍵因素。

長期在同一區域使用相同類型的除草劑，對雜草產生高選擇壓，會加速其抗藥性的發生和發展，而盲目用藥又會進一步加劇抗藥性的蔓延。本研究僅從整株水平測定和靶標基因突變分析的角度進行了研究，下一步還需針對有關靶標酶活性的測定、交互抗性、代謝酶等與抗性關聯的其他問題進行深入地研究剖析。