戊唑醇等9種農藥對螟黃赤眼蜂的毒性評價

金 磊, 張文哲, 張傳清, 朱國念, 劉亞慧*,

(1. 浙江農林大學 農業與食品科學學院，杭州 311300；2. 浙江大學 農藥與環境毒理研究所，杭州 310029)

赤眼蜂Trichogrammaspp. 是目前應用最廣泛、影響最大的鱗翅目卵寄生性天敵昆蟲，其優勢是能在寄主為害作物之前殺死寄主[1-2]。研究表明，通過釋放螟黃赤眼蜂Trichogramma chilonis，對水稻田[3-5]、玉米田[6]、棉花地[7]和蔬菜地[8]等多種鱗翅目害蟲均取得了良好的防效。但是，化學農藥的施用可能對赤眼蜂的生存造成影響，進而降低其作為害蟲天敵的自然生防作用。因此，評價生產上常用農藥對赤眼蜂的安全性顯得尤為重要。已有研究表明，部分殺蟲劑對赤眼蜂具有較高的毒性風險[9-12]，而有關殺菌劑對赤眼蜂的安全性評價僅有少數報道且涉及的藥劑種類較少[13-14]。螟黃赤眼蜂寄主廣泛，能寄生包括稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis、草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda及甘蔗螟蟲等80多種農林害蟲，生防價值較高，是目前規模化生產和釋放的主要赤眼蜂種類之一[15]。有關農藥對赤眼蜂的毒性風險評價目前多集中在松毛蟲赤眼蜂T. dendrolimi、玉米螟赤眼蜂T. ostriniae和稻螟赤眼蜂T. japonicun等方面，針對螟黃赤眼蜂的研究則較少。

目前生產上常見的病蟲害，如水稻田的稻曲病、紋枯病、二化螟Chilo suppressalis和稻縱卷葉螟C. medinalis；玉米田的玉米小斑病、大斑病和棉鈴蟲Helicoverpa armigera；蔬菜上的霜霉病、炭疽病、小菜蛾Plutella xylostella和甜菜夜蛾Spodoptera exiqua等，已成為長期以來制約農作物高產、優產和穩產的主要因素。用于防治上述重要病蟲害的常用殺菌劑主要有甲氧基丙烯酸酯類 (QoIs) 如嘧菌酯，麥角甾醇合成抑制劑類(DMIs) 如戊唑醇、苯醚甲環唑，琥珀酸脫氫酶抑制劑類 (SDHIs) 如噻呋酰胺等；殺蟲劑主要有雙酰胺類如氯蟲苯甲酰胺等。由于化學藥劑在有效防治病蟲害的同時容易引起“3R”等問題[16]，以寄生蜂為代表的生物防治已成為有害生物綜合防治(IPM) 的重要組成部分，因此如何科學選用對寄生蜂風險低的藥劑對于有害生物綜合防治具有重要意義。

關于農藥對赤眼蜂的毒性風險常以半致死用量 (LR50) 和安全性系數 (safety factor，SF) 兩個指標表示，其對于藥劑的安全性評價具有參考意義[17]。基于此，筆者選擇目前生產中常用的9種殺蟲劑和殺菌劑，采用藥膜法測定了其對螟黃赤眼蜂的毒性，以LR50和致死中時間 (LT50) 進行綜合評價，同時測定了常用殺菌劑混合使用對螟黃赤眼蜂存活的影響，以期更全面地評價不同農藥的生態風險，為田間科學用藥、合理保護和利用天敵以及協調化學與生物的綜合防治提供指導，為農藥的風險管理提供參考信息。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試蜂種及寄主昆蟲

寄主昆蟲：米蛾Corcyra cephalonica(Stainton)由浙江省農業科學研究院植物保護與微生物研究所提供，長期飼養于26 ℃ ± 1 ℃、相對濕度70% ±10%、光照周期14 h : 10 h的人工氣候箱內。收集由繁育數代的米蛾成蟲在80目 (孔徑0.18 mm) 尼龍紗網上所產的卵，將當天收集的新鮮米蛾卵于30 W 的紫外燈下照射45 min殺死其胚胎后供試。

蜂種：螟黃赤眼蜂Trichogramma chilonis是由浙江省農業科學研究院植物保護與微生物研究所提供、以米蛾卵為寄主在上述條件人工氣候箱內多代繁殖所得的品系。

1.1.2 供試藥劑 97%丙硫菌唑 (prothioconazole)和95%噻呋酰胺 (thifluzamide) 原藥由江西正邦生物化工股份有限公司提供；98%苯醚甲環唑(difenoconazole) 原藥由浙江新農化工有限公司提供；97%咪鮮胺 (prochloraz) 和96%嘧菌酯(azoxystrobin) 原藥由浙江天豐生物科學有限公司提供；97%戊唑醇 (tebuconazole) 原藥由江蘇揚農化工股份有限公司提供；72.2%茚蟲威 (indoxacarb)原藥由寧波三江益農化學有限公司提供；96.5%氯蟲苯甲酰胺 (chlorantraniliprole) 原藥來自上海杜邦農化有限公司；72.7%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽 (emamectin benzoate) 原藥來自江蘇豐源生物工程有限公司。先將各原藥分別用丙酮溶解配制成一定濃度的母液，試驗時再分別用丙酮稀釋成不同濃度藥液供試，現配現用。

1.2 試驗方法

1.2.1 對螟黃赤眼蜂成蜂的急性毒性測定 供試藥劑對螟黃赤眼蜂成蜂的急性毒性測定參照Shotkoski等[18]和Shufran等[19]所用的藥膜法并進行適當改進。在預試驗明確供試藥劑有效濃度的基礎上，每種藥劑在0～2000 mg/L范圍內設置5個處理濃度 (表1)，分別用丙酮以等比級差稀釋并配制，每個濃度設3個重復，以丙酮溶液作對照。分別吸取0.5 mL藥液于指形管 (直徑1.5 cm，高11 cm) 中，將加好藥液的指形管于滾膜機上均勻滾動，置于陰涼通風處晾干，使管內形成均勻藥膜。每個指形管接入50頭左右羽化后12 h內的健壯成蜂，讓其在管內自由爬行，飼喂10%蜂蜜水，并用黑布封口以利于空氣流通，然后置于人工氣候箱中培養。8 h后檢查記錄管中死亡和存活蜂數 (以毛筆刷輕觸不動為死亡)，計算死亡率(%)，對照組死亡率 <10%時數據為有效。通過處理藥劑濃度與死亡率在SPSS 22.0中統計分析出半致死濃度 (LC50，單位 mg/L)。若某藥劑在最高供試濃度處理下仍未發生明顯死亡，則表明該藥劑的LC50>最高供試濃度。

表1 供試藥劑的處理濃度Table 1 Treatment concentration of the tested pesticides

參考文獻方法[10]計算安全性系數 (SF)。

式 (1) 中：LR50為半致死用量，指在室內條件下，赤眼蜂死亡率為50%時藥劑的用量，以單位面積上所附著的藥劑有效成分的量表示，單位g/cm2，通過 × 105換算為g/hm2，本研究中最終結果LR50均以g/hm2表示；54.6 cm2為指形管的內表面積。

式 (2) 中，RDF 為田間推薦施用劑量，單位g/hm2。

1.2.2 對螟黃赤眼蜂成蜂的致死中時間測定 參考Desneux等[20]的藥膜法測定各供試藥劑對螟黃赤眼蜂壽命的影響。其中6種殺菌劑的供試質量濃度均為200 mg/L，茚蟲威和氯蟲苯甲酰胺為100 mg/L，甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽為10 mg/L。藥膜制作方式同1.2.1節，每個指形管中引入10頭12 h內羽化的成蜂，為1組，每種藥劑處理設置10組共100頭，以丙酮溶液作對照。處理后飼喂10%蜂蜜水，用黑布封口后放入人工氣候箱中培養。每天定時用10%蜂蜜水飼喂兩次，逐日記錄 (毒性高的藥劑縮短記錄時間為3 h) 螟黃赤眼蜂死亡個體數并及時移走死亡蜂，直至全部蜂死亡，結束觀察。

1.2.3 殺菌劑混合使用對螟黃赤眼蜂存活的影響測定 采用1.2.2節中藥膜法進行。基于1.2.1節的測定結果，將丙硫菌唑、苯醚甲環唑、噻呋酰胺及嘧菌酯分別與咪鮮胺和戊唑醇按有效成分質量比1 : 1兩兩混合，參考所測得最高毒性殺菌劑的LC50值，將藥膜處理的質量濃度設為100 mg/L，以單劑處理為對照，以丙酮溶液為空白對照。每處理指形藥膜管中分別引入20頭健壯成蜂，試驗期間每天喂食10%蜂蜜水2次。每處理設5個重復，分別在8、24、48及72 h記錄死亡蜂和存活蜂數，并及時移除死亡蜂，計算死亡率。

1.3 數據處理與分析

所有試驗數據均采用Excel 2010和SPSS 22.0軟件進行處理，計算出毒力回歸方程和相應的LR50值、決定系數R2以及95%置信限；參考Robertson等[21]的方法采用概率回歸分析得出卡方值 (χ2) 和LT50值，當任意兩藥劑處理LT50值的95%置信限范圍重疊，則表示差異不顯著，反之為差異顯著；混合物對螟黃赤眼蜂的致死率經反正弦平方根轉換后用于統計分析，相同時間不同藥劑處理間的差異采用單因素方差分析，并采用Tukey氏多重比較進行顯著性檢驗 (P= 0.05)。

2 結果與分析

2.1 供試9種農藥對螟黃赤眼蜂的急性毒性

9種藥劑對螟黃赤眼蜂的急性毒性從高到低依次為甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽>咪鮮胺>戊唑醇>氯蟲苯甲酰胺和茚蟲威>苯醚甲環唑、丙硫菌唑、噻呋酰胺和嘧菌酯 (表2)。

表2 9種藥劑對螟黃赤眼蜂的急性毒性 (8 h)Table 2 Acute toxicities of nine pesticides against Trichogramma chilonis (8 h)

農藥對螟黃赤眼蜂成蜂的風險依據其安全性系數 (SF)[10]共劃分為4個等級：極高風險性(SF≤0.05)、高風險性 (0.055)。根據該風險劃分標準，本研究中苯醚甲環唑、丙硫菌唑、噻呋酰胺、嘧菌酯、氯蟲苯甲酰胺和茚蟲威6種農藥為低風險性，咪鮮胺和戊唑醇為中等風險性，甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽則為高風險性 (表3)。

表3 供試9種藥劑對螟黃赤眼蜂的風險性評價Table 3 Risk assessment of nine pesticides against Trichogramma chilonis

2.2 供試9種農藥對螟黃赤眼蜂的致死中時間

不同農藥對螟黃赤眼蜂的致死中時間 (LT50)見表4。供試藥劑中，丙硫菌唑、苯醚甲環唑、噻呋酰胺、嘧菌酯和茚蟲威對螟黃赤眼蜂的LT50值與對照差異不顯著，而咪鮮胺、戊唑醇、氯蟲苯甲酰胺和甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽的LT50值與對照相比均顯著降低，表明其可顯著影響螟黃赤眼蜂的存活時間。

表4 供試9種藥劑對螟黃赤眼蜂的致死中時間Table 4 The lethal time of nine pesticides against Trichogramma chilonis

2.3 殺菌劑混合使用對螟黃赤眼蜂存活的影響

咪鮮胺與其他殺菌劑混合處理的毒性測定結果見圖1。其中，咪鮮胺+丙硫菌唑和咪鮮胺+噻呋酰胺處理組，螟黃赤眼蜂在8～24 h內的死亡率與空白對照差異不顯著，且分別在8～72 h和8～48 h內的死亡率顯著低于咪鮮胺單劑處理 (圖1 A和B)；咪鮮胺+嘧菌酯處理，螟黃赤眼蜂在8～72 h內的死亡率與咪鮮胺單劑相比均顯著降低，但顯著高于丙酮空白對照 (圖1 C)；咪鮮胺+苯醚甲環唑處理，8～72 h內螟黃赤眼蜂的死亡率與咪鮮胺單劑無顯著性差異，且均顯著高于空白對照 (圖1 D)。

戊唑醇與其他殺菌劑混合處理的毒性測定結果見圖 2。其中，戊唑醇+丙硫菌唑處理在8～24 h、戊唑醇+噻呋酰胺處理在8 h以及戊唑醇+嘧菌酯處理在8～72 h內 (除24 h外)，螟黃赤眼蜂的死亡率均與空白對照差異不顯著 (圖 2 A、B和C)；戊唑醇+丙硫菌唑處理組與戊唑醇+嘧菌酯處理組，在8～72 h內螟黃赤眼蜂的死亡率均顯著低于戊唑醇單劑處理 (圖 2 A和B)；而戊唑醇+苯醚甲環唑處理組螟黃赤眼蜂在8～72 h的死亡率與戊唑醇單劑無顯著性差異 (圖 2 D)。戊唑醇+噻呋酰胺處理組在8～48 h內螟黃赤眼蜂的死亡率顯著低于戊唑醇單劑處理，而在72 h與戊唑醇單劑處理的死亡率無顯著性差異 (圖 2 C)。

3 結論與討論

保護和利用好寄生性天敵是有害生物綜合治理中的重要課題。本研究采用半致死用量 (LR50)和致死中時間 (LT50) 兩種指標，綜合評估了戊唑醇等9種生產中常用農藥對螟黃赤眼蜂T.chilonis的毒性。結果表明：甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽屬高風險性藥劑，其LR50和LT50值分別為0.53 g/hm2和0.16 d；茚蟲威和氯蟲苯甲酰胺的LR50值大于915.75 g/hm2，均為低風險性藥劑，這與已有的一些急性毒性研究結果[22-23]類似。本研究還發現，經約田間推薦劑量10倍質量濃度(1 000 mg/L) 的氯蟲苯甲酰胺和茚蟲威處理后8 h，螟黃赤眼蜂分別表現為明顯的行動遲緩和無序亂飛的中毒癥狀。氯蟲苯甲酰胺的LT50值僅為0.86 d，與對照差異顯著，對螟黃赤眼蜂表現出較高的毒性風險；而茚蟲威的LT50值與空白對照差異不顯著，毒性風險較低。就這兩種藥劑的測定結果而言，兩種檢測指標結果的差異性表明，適當延長藥劑的處理時間，有利于更加全面地明確一些藥劑潛在的毒性風險。Simon-Delso 等[24]通過攝入法研究啶酰菌胺對蜜蜂的累積毒性時發現，直到17～18 d才觀察到累積暴露毒性的存在而非標準測試方法的10 d，同樣證明了延長暴露時間對毒性試驗的重要性。

隨著殺菌劑使用量的逐年增多，其對寄生性天敵的潛在風險已逐漸引起人們的重視，然而關于殺菌劑對螟黃赤眼蜂的毒性風險評價仍鮮有報道。已有研究表明，不同種類赤眼蜂對同種殺菌劑的敏感性差異顯著。前人研究發現，咪鮮胺和戊唑醇對玉米螟赤眼蜂T. ostriniae分別表現為極高風險[8]和低風險[25]，對松毛蟲赤眼蜂T. dendrolimi則分別表現為中等風險[8]和高風險[26]；而本研究中，咪鮮胺和戊唑醇對螟黃赤眼蜂均表現為中等風險。祝小祥等[13]報道，苯醚甲環唑對擬澳洲赤眼蜂T. confusum為中等風險，對稻螟赤眼蜂T.japonicun和亞洲玉米螟赤眼蜂為低風險；徐華強等[27]明確，嘧菌酯對玉米螟赤眼蜂為高風險；而本研究結果顯示，苯醚甲環唑和嘧菌酯對螟黃赤眼蜂均為低風險，且對其存活無顯著影響。綜合分析造成這些結果差異的原因，可能與試驗環境與處理方式的差異有關，也可能與不同赤眼蜂體內解毒酶活力的高低有關[26]。丙硫菌唑屬麥角甾醇合成抑制劑類 (DMIs)，主要是抑制C14脫甲基反應，影響菌體甾醇類生物合成，進而破壞真菌細胞膜的功能；噻呋酰胺屬琥珀酸脫氫酶抑制劑類 (SDHIs)，主要作用于琥珀酸泛醌氧化還原酶，抑制線粒體電子呼吸鏈的能量傳遞。目前尚未見有關這兩種殺菌劑對赤眼蜂毒性的研究報道。本研究首次明確丙硫菌唑和噻呋酰胺對螟黃赤眼蜂無致死效應，為低風險性藥劑，其LR50值均大于1 831.50 g/hm2，且LT50值大于4 d。張唯偉等[28]通過田間天敵種群調查及群落多樣性指數分析，同樣證明了噻呋酰胺對稻田天敵群落的安全性。因此，研究結果為豐富殺菌劑的安全性數據以及對赤眼蜂的利用具有重要的意義。

在實際生產中，為了擴大防治譜、延緩抗藥性以更好地防治多種病害，同時節約經濟成本和減少施藥次數，將多種殺菌劑復配使用是較為常見的方法，因此，赤眼蜂在田間也很容易接觸到不同類型的殺菌劑。有研究表明，將一些高毒農藥單劑與低毒單劑復配后若無增毒現象發生，則可認為該混配組合對天敵的安全性優于其高毒單劑[29]。本研究中供試殺菌劑混合物的毒性在不同階段呈現不同程度下降，所得結果對相關殺菌劑混合制劑的開發具有一定的指導意義。

綜上所述，本研究表明，急性毒性指標LR50并不能全面準確地評價農藥對赤眼蜂的安全性，同時結合LT50值的結果可以更全面科學地了解農藥對赤眼蜂的毒性影響。本研究中，咪鮮胺、戊唑醇和甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽的LR50和LT50值結果均表明這3種藥劑對螟黃赤眼蜂具有較高的毒性，因此在放蜂期建議不要使用；氯蟲苯甲酰胺的毒性表現比較滯后，其急性毒性不明顯，主要對蜂的存活會產生較大影響，應當有選擇性地使用，盡量避開放蜂期；而丙硫菌唑、苯醚甲環唑、嘧菌酯、噻呋酰胺和茚蟲威對螟黃赤眼蜂具有較好的相容性。但是，由于農藥在田間施用過程中還會受到光照、風和雨水等環境因子的影響，因此為進一步評價常用農藥對寄生性天敵如螟黃赤眼蜂的影響，還需開展相應的田間試驗以明確農藥的實際作用。