高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測仲丁靈在人參中的殘留及消解動態(tài)

尤慶航, 彭 湃, 宋雨桐, 方 楠, 朱宗利, 侯新港,梁 爽, 逯忠斌, 曲 彤, 侯志廣*,

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，長春 130118；2. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，長春 130118)

人參Panax ginsengC. A. Mey為五加科多年生草本植物，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，人參及其制品能促進(jìn)新陳代謝，調(diào)節(jié)生理機(jī)能，對治療心血管疾病、胃病和肝臟疾病、糖尿病、不同類型的神經(jīng)衰弱癥等均有較好療效[1-4]，其皂苷除藥用制成人參茶以外，還在食品和化妝品的生產(chǎn)等方面均有較好的應(yīng)用前景[5]。人參是一種宿根性藥用植物[6]，自然界的土壤條件，大多不符合獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)參根的要求，因此，多數(shù)參區(qū)都是選擇適宜的天然林地，伐木整地后進(jìn)行栽培。而我國林地面積較少，為保護(hù)森林資源，防止水土流失，近年來中國已逐漸從林下栽參轉(zhuǎn)向農(nóng)田栽參。與林地相比，農(nóng)田草害更為嚴(yán)重，嚴(yán)重影響人參產(chǎn)量。但目前尚未見除草劑在人參上的登記，因此選用高效、低毒、低殘留的除草劑來防除參地雜草具有十分重要的現(xiàn)實意義。

仲丁靈 (butralin) 是一種二硝基苯胺類芽前土壤處理除草劑，具有觸殺兼局部內(nèi)吸的作用，藥劑可通過植物的根莖和幼芽吸收，在植物體內(nèi)抑制分生組織細(xì)胞的分裂和分化，從而達(dá)到阻礙雜草的生長使其死亡的目的[7]。因其除草范圍廣，且低毒、低殘留、安全性高，所以近年來仲丁靈越來越多的作為選擇性芽前除草劑被應(yīng)用于防除一年生禾本科雜草及部分闊葉雜草[8]。根據(jù)田間藥效試驗資料，仲丁靈在人參田防除雜草的藥效較好，但不恰當(dāng)?shù)氖褂脮屛幢焕玫霓r(nóng)藥遷移到土壤中，被人參根系吸收并轉(zhuǎn)運到其他部位富集積累，進(jìn)而影響食用者健康。因此，檢測人參及其土壤中仲丁靈的殘留量十分必要。

在GB 2763—2019[9]中，仲丁靈的殘留物定義為仲丁靈母體，與仲丁靈結(jié)構(gòu)相似且同為二硝基苯胺類除草劑的二甲戊靈的膳食攝入評估和MRL監(jiān)測的殘留物定義均定為二甲戊靈母體[10]。本文以此作為參考，將殘留檢測物暫定為仲丁靈母體。目前，關(guān)于仲丁靈的殘留檢測多集中在煙草[11]、土壤[12]、大豆[13]、水果[14]、水稻[15]等作物上，檢測方法主要有配備電子捕獲檢測器的氣相色譜法 (GC-NPD)[16]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 (GCMS/MS)[17]、高效液相色譜法 (HPLC)[18]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 (HPLC-MS/MS)[19]。截至目前尚未見有關(guān)仲丁靈在人參及其土壤中殘留動態(tài)的相關(guān)報道。由于人參中含有皂苷、揮發(fā)油、酚類、氨基酸、有機(jī)酸、維生素、脂肪和甾醇等多種成分，致使基質(zhì)較為復(fù)雜，當(dāng)農(nóng)藥理化性質(zhì)不穩(wěn)定或目標(biāo)分析物濃度過低時，復(fù)雜基質(zhì)會對人參中農(nóng)藥殘留檢測造成困難[20]。與傳統(tǒng)分析手段相比，HPLC-MS/MS對于復(fù)雜基質(zhì)中痕量化合物的檢測適用性更強(qiáng)[21]。鑒于此，本研究建立了一種快捷簡便的HPLC-MS/MS測定鮮人參、干人參、人參植株及人參土壤中仲丁靈殘留量的分析方法。此外，還通過1年4地的田間試驗，研究了仲丁靈在人參及其土壤中的消解動態(tài)和最終殘留量。旨在指導(dǎo)農(nóng)民合理施藥，保障仲丁靈在人參上的安全使用，為我國仲丁靈在人參中最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)的制定以及仲丁靈在人參上的登記使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、藥劑與試劑

Agilent 1260-6470高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國安捷倫科技有限公司)；T25 ULTRA-TURRAX勻漿機(jī) (德國IKA集團(tuán))；SHZ-88水浴恒溫振蕩器(金壇市醫(yī)療儀器廠)；RV 10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (德國IKA集團(tuán))；LE204E萬分之一天平 (上海梅特勒-托利多儀器有限公司)。

仲丁靈 (butralin) 標(biāo)準(zhǔn)品 (純度98.7%，Dr.Ehrenstorfer公司)；48%仲丁靈乳油 (EC，大弓農(nóng)化有限公司)；乙腈 (色譜純，MREDA公司)；甲醇 (色譜純，MREDA公司)；甲酸 (色譜級，福晨化學(xué)試劑有限公司)；乙酸銨 (色譜級，Sigma-Alorich集團(tuán))；氯化鈉 (分析純，北京化工廠)；水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)；1 g NH2固相萃取柱(Agilent公司)。

1.2 田間試驗

根據(jù)《農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則》[22]進(jìn)行。于2019年在吉林省白山市、撫松縣、延吉市以及遼寧省桓仁縣進(jìn)行1年4地的田間試驗，供試藥劑為48%仲丁靈乳油 (推薦劑量為制劑量3 750 g/hm2)，供試人參Panax ginsengC. A. Mey品種為大馬牙。

1.2.1 消解動態(tài)試驗 選擇栽有人參的土壤進(jìn)行，小區(qū)面積50 m2，施藥劑量以制劑量3 750 g/ hm2(有效成分1 800 g/hm2) 于人參出苗前通過土壤噴霧施藥1次。分別于施藥后0 (2 h)、1、3、7、14、20、30、45和60 d、收獲期采集深度0～10 cm土壤樣品；施藥后，待人參植株生長至15 cm高時，分別于0 (2 h)、1、3、7、14、20、30、45、60 d及收獲期采集人參莖葉。上述樣品均于 ?20 ℃下儲藏，待測。

1.2.2 最終殘留試驗 施藥劑量以制劑量3 750 g/ hm2(有效成分1 800 g/hm2) 于人參出苗前噴霧施藥1次，小區(qū)面積為50 m2。于收獲期分別采集人參(地下肉質(zhì)根部分)、人參莖葉、人參土壤樣品。于?20 ℃下儲藏，待測。另設(shè)清水空白對照，處理間設(shè)保護(hù)帶。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品的制備 稱取500 g于 ?20 ℃下保存的人參，經(jīng)切片機(jī)切片后，一部分用食品加工機(jī)搗碎，混勻，制得鮮人參樣品，于 ?20 ℃保存；另一部分根據(jù)GB/T 19506—2009[23]方法置于80 ℃烘箱中烘干24 h，用粉碎機(jī)粉碎，過篩孔直徑為180 μm 篩，制得干人參樣品，于 ?20 ℃保存。

1.3.2 提取 稱取鮮人參樣品和人參植株樣品各20.0 g，分別置于250 mL燒杯中，加入100 mLV(乙腈) :V(水)=8 : 2混合溶液，高速勻漿約2 min，在鋪有助濾劑的布氏漏斗中減壓抽濾。將濾液全部收集于裝有5～7 g氯化鈉的具塞量筒中，振搖150次，靜置1 min；再次振搖100次，靜置1 h以上。取上清液待凈化。

稱取干人參樣品5.0 g和種植人參土壤樣品20.0 g，分別置于250 mL具塞三角瓶中，加入50 mLV(乙腈) :V(水)=8 : 2混合溶液，振蕩提取1 h。后續(xù)抽濾等處理同鮮人參樣品的處理。取上清液待凈化。

1.3.3 凈化 移取20 mL上述提取液于250 mL平底燒瓶中，于40 ℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入2 mLV(乙腈) :V(甲苯)=3 : 1混合溶液溶解，向NH2固相萃取柱中加入4 mLV(乙腈) :V(甲苯)=3 : 1混合溶液預(yù)淋洗，棄去流出液。當(dāng)液面下降到柱填充物頂部時，將樣品溶解液轉(zhuǎn)移到凈化柱上，并用新平底燒瓶接收，再用2 mLV(乙腈) :V(甲苯)=3 : 1混合溶液分別洗滌試樣燒瓶3次，轉(zhuǎn)移到凈化柱中，最后用20 mLV(乙腈) :V(甲苯)=3 : 1混合溶液洗脫；收集全部洗脫液，于40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用氮氣吹干，加入5 mLV(乙腈) :V(水)=3 : 2混合溶液復(fù)溶，混勻，過0.22 μm濾膜，待測。

1.4 儀器檢測條件

色譜條件：Agilent Zorbax RRHD Eclipse Plus C18色譜柱 (3.0 mm × 50 mm，1.8 μm)；流動相為V(甲醇)和V[(0.1%甲酸 + 5 mmol/L甲酸銨) 水溶液]=8 : 2，等度洗脫；流速0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量為5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源正離子掃描模式(ESI+)；多反應(yīng)監(jiān)測 (MRM)；毛細(xì)管電壓4 000 V；霧化氣為氮氣，霧化氣壓力為0.207 MPa；干燥氣溫度330 ℃，干燥氣流速為7 L/min；鞘氣溫度300 ℃；鞘氣流速8 L/min。質(zhì)譜參數(shù)如表1。

表1 仲丁靈的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of butralin

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制與基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取仲丁靈標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g (精確至0.000 1 g)，先用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)母液，再用乙腈稀釋，制備100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4 ℃貯存，備用。使用時用乙腈稀釋成0.2、1和10 mg/L的系列仲丁靈標(biāo)準(zhǔn)工作液。

取空白基質(zhì)樣品按1.3節(jié)的方法進(jìn)行樣品前處理，添加仲丁靈標(biāo)準(zhǔn)溶液，配成質(zhì)量濃度為0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2和0.5 mg/L系列的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。按1.4節(jié)條件測定，以仲丁靈質(zhì)量濃度 (x) 為橫坐標(biāo)，峰面積 (y) 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立線性回歸方程。

1.6 基質(zhì)效應(yīng)

在HPLC-MS/MS分析過程中，電噴霧電離源(ESI) 易受樣品中分析目標(biāo)化合物以外的基質(zhì)成分和目標(biāo)化合物在離子化過程中相互競爭的影響，從而產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)[24]，影響HPLC-MS/MS在定量分析中的準(zhǔn)確性與重現(xiàn)性[25]，因此本研究分別用空白溶劑和空白基質(zhì)提取溶液配制一系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在相同的色譜條件下檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液的校正曲線斜率按公式 (1)分別計算鮮人參、干人參、人參植株和人參土壤中的基質(zhì)效應(yīng)。

式中Smatrix為基質(zhì)空白提取液制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，Ssolvent為空白溶劑乙腈制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。當(dāng)Me值在0.8～1.2之間時，其基質(zhì)效應(yīng)可以忽略；當(dāng)Me值大于1.2時表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；當(dāng)Me值小于0.8時表現(xiàn)為基質(zhì)減弱效應(yīng)[26]。

1.7 添加回收試驗

稱取不含仲丁靈的鮮人參樣品20 g、干人參樣品5 g、人參植株樣品20 g和人參土壤樣品20 g，按1.3節(jié)方法進(jìn)行樣品前處理。向空白基質(zhì)中添加仲丁靈標(biāo)準(zhǔn)溶液，仲丁靈在鮮人參和干人參中添加水平為0.01、0.05、0.5 mg/kg，在人參植株和人參土壤中的添加水平為0.01、0.05、0.5、10 mg/kg。每個水平重復(fù)5次，按1.4節(jié)條件測定，計算添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC-MS/MS條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 分別在ESI+和ESI?模式下以0.3 mL/min的流速直接注入1.0 mg/L仲丁靈標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在ESI+下獲得了豐度較高的母離子[M+H+]離子峰，進(jìn)一步優(yōu)化二級質(zhì)譜的條件來獲得特征子離子，并從中選擇兩個離子豐度較強(qiáng)，響應(yīng)值較高，干擾較小的兩個離子作為其定性與定量的離子對m/z240.2/222.2。

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化 C18色譜柱對于大多數(shù)化合物分辨效果好，保留性強(qiáng)且在液相色譜儀中應(yīng)用較為廣泛，故選用了Eclipse Plus C18色譜柱(3.0 mm × 50 mm，1.8 μm)，并在甲醇相和水相體積比為8 : 2的等度洗脫條件下對仲丁靈在不同流動相條件下的響應(yīng)值和峰型進(jìn)行了觀察，比較了甲醇-水 (含0.1%甲酸+5 mmol/L甲酸銨)、甲醇-水 (含0.1%甲酸)、甲醇-水 (含5 mmol/L氫氧化銨) 和甲醇-水4種流動相組合。由圖1表明：當(dāng)有機(jī)相為甲醇溶液，水相為含有0.1%甲酸和5 mmol/L甲酸銨的水溶液時，仲丁靈的響應(yīng)值最高，峰型較為尖銳，故選用甲醇-水 (含0.1%甲酸+5 mmol/L甲酸銨) 作為流動相，在此條件下仲丁靈的保留時間約為5.4 min。

2.2 方法的線性關(guān)系和基質(zhì)效應(yīng)

結(jié)果 (表2) 顯示，在0.002～0.5 mg/L內(nèi)，不同基質(zhì)中，仲丁靈的質(zhì)量濃度與響應(yīng)值有良好的線性關(guān)系。

表2 仲丁靈在人參中的線性方程及基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Linear equations and matrix effects of butralin in ginseng

仲丁靈在鮮人參、干人參、人參植株和人參土壤中的Me值均大于1.2，表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，為保證分析方法的準(zhǔn)確性，采用基制匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液校正樣品，結(jié)果表明可以達(dá)到殘留分析檢測的要求[22]。

2.3 方法的準(zhǔn)確度和精密度

結(jié)果 (表3) 表明：仲丁靈在鮮人參、干人參、人參植株和人參土壤中的平均回收率分別為98%～108%、93%～98%、94%～106%和95%～107%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.4%～2.5%、0.6%～6.2%、1.2%～2.5%和0.80%～5.7%。仲丁靈的定量限 (LOQ) 為0.01 mg/kg。其準(zhǔn)確度和精密度均滿足農(nóng)藥殘留定量分析的要求[22]。

表3 仲丁靈在人參及人參土壤中的添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Recoveries and RSDs of butralin in ginseng and ginseng soil

2.4 仲丁靈在人參中的消解動態(tài)

2019年在吉林省白山市和遼寧省桓仁縣的田間消解動態(tài)結(jié)果顯示，48%仲丁靈乳油在人參中的消解動態(tài)均符合一級反應(yīng)動力學(xué)方程 (圖2)。由表4可知，施藥后隨著采收間隔期的延長，仲丁靈在人參土壤及人參植株中的殘留量均逐漸降低。施藥60 d后，白山試驗點人參土壤樣品中仲丁靈的殘留量為0.32 mg/kg，消解率達(dá)到了87.3%；遼寧省桓仁試驗點人參土壤樣品中仲丁靈殘留量為0.29 mg/kg，消解率達(dá)到78.6%。仲丁靈在吉林白山和遼寧桓仁的人參土壤樣品中半衰期分別為12.63 d和 18.91 d，表明仲丁靈在人參土壤中降解較快，屬于易降解農(nóng)藥 (t1/2< 30 d)。

表4 仲丁靈在人參植株及人參土壤中的消解動態(tài)Table 4 Dissipation dynamics of butralin in ginseng plant and ginseng soil

施藥60 d后，白山試驗點人參植株樣品中仲丁靈的殘留量為0.36 mg/kg，消解率達(dá)到了88.7%；遼寧桓仁試驗點人參植株樣品中仲丁靈的殘留量為0.28 mg/kg，消解率達(dá)到了88.7%。仲丁靈在吉林白山和遼寧桓仁的人參植株樣品中半衰期分別為11.80 d和 10.81 d。

徐月明等報道仲丁靈在土壤中的半衰期為9.04～11.17 d[27]，李義強(qiáng)等報道仲丁靈在煙葉中的半衰期為5.2～12.2 d[28]，本研究中仲丁靈在人參植株中的半衰期與其結(jié)果相近，但在人參土壤中的半衰期卻相對較長，可能的原因是：一方面人參植株本身的生長發(fā)育狀況和理化特性對仲丁靈的降解有一定的影響；另一方面，不同的氣候條件、土壤中微生物的種類與數(shù)量、有機(jī)質(zhì)的含量影響農(nóng)藥在土壤中降解[29]，也使得處于不同地理位置的試驗點的半衰期有一定差異。

2.5 仲丁靈在人參中的最終殘留量

2019年在吉林省延吉市、白山市、撫松縣和遼寧省桓仁縣進(jìn)行的1年4地的最終殘留試驗結(jié)果 (表5) 表明，48%仲丁靈乳油在人參出苗前，以制劑量3 750 g/hm2(有效成分1 800 g/hm2) 施藥1次，仲丁靈在鮮人參中的最終殘留量為

表5 仲丁靈在人參及人參土壤中的最終殘留量Table 5 Terminal residues of butralin in ginseng and ginseng soil

3 結(jié)論

建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定鮮人參、干人參、人參植株及人參土壤中仲丁靈殘留的分析方法。研究了仲丁靈在人參中的消解動態(tài)和最終殘留量。該方法采用NH2固相萃取柱凈化，鮮人參、干人參在0.01、0.05和0.5 mg/kg，人參植株和人參土壤在0.01、0.05、0.5和10 mg/kg添加水平下，仲丁靈的回收率為93%～108%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.6%～6.2%，滿足農(nóng)藥殘留分析檢測的要求。

2019年仲丁靈在人參中的消解動態(tài)和最終殘留試驗結(jié)果表明，仲丁靈在人參及其土壤中的半衰期為10.81～18.91 d，屬于易降解農(nóng)藥 (t1/2<30 d)。收獲期仲丁靈在鮮人參中的最終殘留量為