高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測寧南霉素在人參中的殘留及消解規(guī)律

宋雨桐, 陸 洋, 尤慶航, 侯新港, 朱宗利, 孫曉偉,方 楠, 侯志廣, 梁 爽, 逯忠斌

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，長春 130118)

人參Panax ginsengC. A. Mey 作為藥食同源中藥材，具有抗疲勞、調(diào)節(jié)血糖和抗氧化等功能[1-3]。但由于人參的生育周期較長，使得人參易受疫病、灰霉病和根腐病等多種病害的侵?jǐn)_，造成人參產(chǎn)量損失高達(dá)20%～50%[4]。生產(chǎn)中主要應(yīng)用化學(xué)殺菌劑防治人參上的病害，但化學(xué)農(nóng)藥的過度使用不僅會造成環(huán)境污染，還會對食品安全與人體健康產(chǎn)生影響。因此選擇一種高效、安全、低毒、低殘留的殺菌劑防治人參疫病顯得尤為重要。

寧南霉素是一種從牛鏈球菌中分離的新型農(nóng)用抗生素殺菌劑，由中國科學(xué)院成都生物研究所創(chuàng)制[5-6]，屬于胞嘧啶核苷肽型新抗生素農(nóng)藥，對植物病害具有良好防效，已廣泛用于治療多種作物上的病毒病、莖腐病和白粉病等病害[7]，但尚未在人參上登記使用。

目前，對寧南霉素殘留的檢測方法主要有高效液相色譜-紫外檢測器[8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[9-10]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜[11]，但由于人參中含有皂苷、多糖、微量元素、揮發(fā)油等未知成分導(dǎo)致基質(zhì)過于復(fù)雜[12]，所以上述報道所采用的QuEChERS法和HLB固相萃取柱進(jìn)行凈化后，并不完全適用于人參基質(zhì)。鑒于此，本研究通過改進(jìn)上述方法，優(yōu)化固相萃取凈化手段，建立了一種簡單、高效測定人參中寧南霉素殘留量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 (HPLC-MS/MS) 分析方法。并通過1年4地的田間試驗研究了寧南霉素在人參及其植株中的最終殘留量和消解動態(tài)，旨在為寧南霉素在人參中最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)制定和指導(dǎo)寧南霉素的安全使用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Agilent 1260-6470高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國 Agilent 公司)；FW-100型谷物粉碎機(jī) (天津市泰斯特儀器有限公司)；KQ-250DE型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)；YXJ-A型離心機(jī) (上海安亭科學(xué)儀器廠)；0.22 μm有機(jī)濾膜 (天津津騰實驗設(shè)備有限公司)；VORTEX 3型渦旋儀(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；3205型食品加工機(jī)(博朗電器)；IKA RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；自制氮吹儀 (自制)；50 mL離心管 (Biosharp公司)。

寧南霉素 (ningnanmycin，純度95.0%) 標(biāo)準(zhǔn)品，德強(qiáng)生物股份有限公司；8%寧南霉素水劑(德強(qiáng)生物股份有限公司)；乙腈和甲醇 (色譜純)，北京邁瑞達(dá)科技有限公司；氨水和濃鹽酸 (分析純)，北京化工廠；甲酸 (色譜純)，天津福晨化學(xué)試劑廠；純凈水 (杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)；500 mg ProElut PLS固相萃取柱和500 mg ProElut PXC固相萃取柱 (北京迪馬科技有限公司)。

1.2 田間試驗

田間試驗于2019年分別在吉林省白山市、撫松縣、延吉市和遼寧省桓仁縣進(jìn)行。供試人參品種為大馬牙，供試藥劑為8%寧南霉素水劑，按《農(nóng)藥殘留試驗準(zhǔn)則》[13]和《農(nóng)藥登記殘留田間試驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》[14]設(shè)計農(nóng)藥消解動態(tài)試驗和最終殘留試驗。小區(qū)面積為50 m2。在人參疫病發(fā)病初期，莖葉噴霧，施藥次數(shù)為2～3次。

1.2.1 消解動態(tài)試驗 在人參疫病發(fā)病初期，于人參植株莖葉噴霧施藥1次，施藥劑量為制劑量900 g/hm2(有效成分72 g/hm2)，分別于施藥后2 h及0、1、3、7、14、20、30和45 d采集人參植株樣品。

1.2.2 最終殘留試驗 以制劑量900 g/hm2(有效成分72 g/hm2) 在人參疫病發(fā)病初期，于人參植株莖葉噴霧施藥3次，施藥間隔期為7 d，采收間隔期分別為14 和21 d，分別采集人參莖葉及人參(地下肉質(zhì)根部分) 樣品。每個試驗小區(qū)采集兩個獨(dú)立樣品，每個樣品單獨(dú)采集，處理間設(shè)保護(hù)帶。另設(shè)清水空白對照。

1.3 樣品前處理

1.3.1 干人參樣品的制備 按國家標(biāo)準(zhǔn)[15]規(guī)定方法。稱取 ?20 ℃冷凍保存的鮮人參100 g，經(jīng)鍘刀切片后，于80 ℃烘箱中烘干 (寧南霉素的熔點為195 ℃) 24 h后取出，用食品加工機(jī)粉碎，過180 μm孔徑篩，于4 ℃保存，備用。

1.3.2 樣品的提取 準(zhǔn)確稱取5 g (精確至0.01 g)樣品于50 mL離心管中，加入體積分?jǐn)?shù)為0.2%的甲酸水溶液，使總水量為25 mL (約加入22 mL)，渦旋振蕩5 min后于4 000 r/min下離心5 min，取上清液，用定性濾紙過濾后待凈化。

1.3.3 樣品的凈化 PLS柱用3 mL甲醇、3 mL體積分?jǐn)?shù)為0.2%的甲酸水溶液預(yù)淋洗，棄去淋洗液。取5 mL提取液過柱，收集流出液，待PXC柱凈化。PXC柱用5 mL甲醇、5 mL水和 5 mL 30 mmol鹽酸溶液預(yù)淋洗，棄去淋洗液。取5 mL上述過PLS柱濾液再過PXC柱，待樣液流盡后用5 mL水、5 mL甲醇淋洗，棄去流出液。用12 mL體積比為4 : 1的氨水-甲醇溶液洗脫。收集洗脫液，于50 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至約0.5 mL，氮?dú)獯蹈桑皿w積比為1 : 1的乙腈-0.2%甲酸水溶液稀釋，定容至2 mL，過0.22 μm微孔濾膜，待測。

1.4 檢測條件

色譜條件：Waters XSelect? HSS T3色譜柱(2.1 mm × 100 mm, 2.1 μm)，柱溫30 ℃，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣體積5 μL，流動相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液，流動相B為0.1%甲酸-甲醇混合溶液，梯度洗脫程序見表1。

表1 寧南霉素流動相梯度洗脫條件Table 1 The mobile phase gradient elution conditions for ningnanmycin

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源正離子掃描模式(ESI+)；多反應(yīng)監(jiān)測模式 (MRM)；霧化氣為氮?dú)猓混F化氣壓力0.31 MPa；毛細(xì)管電壓3 500 V；干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流速10 L/min；鞘氣溫度380 ℃；鞘氣流速11 L/min；寧南霉素定量離子對444.2 > 315.1，源內(nèi)碎裂電壓25 V，碰撞能16 V；定性離子對444.2 > 333.1，源內(nèi)碎裂電壓25 V，碰撞能12 V。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取0.01 g (精確至0.001 g)寧南霉素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度為 1 000 mg/L 的寧南霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于0～4 ℃避光密封保存。

標(biāo)準(zhǔn)溶液：用體積比為1 : 1的乙腈-0.2%甲酸水溶液的混合溶液稀釋寧南霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配制成 0.05、0.1、0.2、0.5、1和2 mg/L 的系列寧南霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，于0～4 ℃避光貯存，備用。

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：稱取空白鮮人參、人參植株和干人參樣品各5 g，按1.3節(jié)樣品前處理步驟處理后分別用寧南霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋，配成系列質(zhì)量濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，外標(biāo)法定量。以寧南霉素質(zhì)量濃度 (x) 為橫坐標(biāo)，峰面積 (y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立線性回歸方程。

1.6 添加回收試驗

分別向空白樣品中添加寧南霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，鮮人參和人參植株添加水平為0.1、0.2和1 mg/kg干人參添加水平為0.2、1和2 mg/kg。每個水平重復(fù)5次，另設(shè)空白對照。按1.4節(jié)條件進(jìn)行測定，計算添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

比較了甲醇 (含0.1%甲酸)-水 (含0.1%甲酸)、乙腈 (含0.1%甲酸)-水 (含0.1%甲酸)、甲醇-水 (含0.1%甲酸) 和乙腈-水 (含0.1%甲酸)4種不同的流動相組合對寧南霉素色譜峰的影響。由圖1可知：當(dāng)有機(jī)相為甲醇 (含0.1%甲酸) (a)、乙腈 (含0.1%甲酸) (b) 時寧南霉素的響應(yīng)值明顯高于甲醇 (c)、乙腈 (d)，這是由于寧南霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)使其在正離子模式下，能與甲酸中的H+結(jié)合，可以更好地提高寧南霉素的離子化效率，提高整體的響應(yīng)值[16]。鑒于寧南霉素在酸性條件下更穩(wěn)定，所以向溶劑中加入0.1%甲酸，優(yōu)于純?nèi)軇o論是否添加0.1%的甲酸，當(dāng)有機(jī)相為甲醇時，寧南霉素的色譜峰分離程度與響應(yīng)值均明顯高于有機(jī)相為乙腈時，這是因為相比于非質(zhì)子性的乙腈，質(zhì)子性的甲醇對加氫峰的農(nóng)藥母離子測定其質(zhì)譜峰面積的響應(yīng)更大，而乙腈偏堿性，具有更強(qiáng)的質(zhì)子親和力，在ESI過程中更容易捕獲質(zhì)子使其自身離子化，從而抑制農(nóng)藥的加氫峰母離子生成，使農(nóng)藥質(zhì)譜峰面積響應(yīng)降低[17]。基于上述條件優(yōu)化，選用甲醇 (含0.1%甲酸)-水 (含0.1%甲酸) 為流動相。

2.2 提取溶劑與提取方法的優(yōu)化

由于寧南霉素易溶于水，可溶于甲醇，難溶于丙酮、苯等溶劑[18]，所以本研究選用了0.2%甲酸水溶液 (酸性)、10%甲醇水溶液 (中性) 和0.1%氨水溶液 (堿性) 3種不同pH值的水性溶劑進(jìn)行提取。結(jié)果表明：在提取溶劑中加入適量的甲酸可以使寧南霉素在提取溶劑中更加穩(wěn)定，回收率為99%，而在堿性條件下易分解失活，回收率僅為2.4%，因此采用0.2%甲酸水溶液作為提取溶劑。

試驗通過比較渦旋振蕩法、超聲波法和勻漿法提取人參中寧南霉素的回收率發(fā)現(xiàn)，三者的回收率均在90%左右，但由于勻漿過程中需要反復(fù)清洗刀頭，操作過程復(fù)雜，且易產(chǎn)生交叉污染。超聲跟渦旋振蕩雖不存在交叉污染的問題，但超聲所需時間較長。綜合考慮，最終采用渦旋振蕩法提取5 min。

2.3 凈化方法的優(yōu)化

由于人參基質(zhì)含有皂苷、揮發(fā)油等多種成分，若提取后直接測定，會對目標(biāo)化合物的檢測產(chǎn)生嚴(yán)重干擾，因此需對提取液凈化。分別考察了分散固相萃取法 (d-SPE) 和固相萃取法 (SPE) 對寧南霉素凈化效果的影響。

2.3.1 分散固相萃取法 樣品經(jīng)0.2%甲酸水溶液提取，采用分散固相萃取法，使用N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基甲硅烷基 (C18) 和石墨化碳黑(GCB) 凈化。結(jié)果表明：d-SPE法對人參中雜質(zhì)的去除能力差，吸附劑在吸附極性與非極性雜質(zhì)的同時也會吸附目標(biāo)化合物，從而降低了寧南霉素在質(zhì)譜的離子化程度。

2.3.2 固相萃取法 分別考察了PLS (6 mL，500 mg，DIKMA公司)、C18(6 mL，500 mg，DIKMA公司)、PXC (6 mL，500 mg，DIKMA公司) 、PEP (6 mL，200 mg，Agilent 公司) 和HLB (12 mL，500 mg，SUPELCO公司) 5種固相萃取柱的凈化效果。結(jié)果 (表2) 顯示：5種固相萃取柱單獨(dú)使用時, 寧南霉素的回收率均未達(dá)到農(nóng)藥殘留分析要求[13]；而采用PLS＋PXC固相萃取柱串聯(lián)使用，很好地解決了人參基質(zhì)過于復(fù)雜導(dǎo)致的凈化效果不足和吸附交換能力不足等問題，減少了寧南霉素在人參樣品中存在的雜質(zhì)干擾影響和回收率偏低兩個關(guān)鍵問題。

表2 不同固相萃取柱對寧南霉素回收率影響Table 2 The influence of different SPE cartridges on ningnanmycin recoveries

2.4 方法的線性范圍、定量限、準(zhǔn)確度及精密度

結(jié)果如表3所示：在0.05～2 mg/L范圍內(nèi)，不同基質(zhì)中，寧南霉素的質(zhì)量濃度與響應(yīng)值有良好的線性關(guān)系。

表3 寧南霉素在人參中的線性范圍、回歸方程與定量限Table 3 Linear range, regression equation and limit of quantification of ningnanmycin in ginseng

由表4可知：寧南霉素在鮮人參中的平均回收率為90%～99%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD) 為4.7%～5.6%；在人參植株中的平均回收率為92%～94%，RSD為4.0～5.6%；在干人參中的平均回收率為89%～95%，RSD為1.4%～10%。該結(jié)果表明所選定的方法符合農(nóng)藥殘留分析的要求[13]。

表4 寧南霉素在人參中的添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (n = 5)Table 4 The recoveries and relative standard deviation of ningnanmycin in ginseng (n = 5)

2.5 寧南霉素在人參植株中的消解動態(tài)

2019年白山、桓仁兩地人參植株上的消解動態(tài)結(jié)果見表5。從中可看出，由于寧南霉素易降解的特性導(dǎo)致寧南霉素在人參植株中消解較快，且本試驗的LOQ為0.1 mg/kg等原因，導(dǎo)致消解動態(tài)數(shù)據(jù)中的部分?jǐn)?shù)值低于本試驗的LOQ，致使消解曲線擬合時少于5個點，擬合的曲線R2值不高，所以本試驗以3倍信噪比計算出寧南霉素的檢出限 (LOD) 為0.02 mg/kg，以高于LOD的數(shù)值模擬建立一級動力學(xué)方程，得到的半衰期為0.76 d(桓仁)、11.77 d (白山)。寧南霉素在白山人參植株中的消解要比桓仁慢，可能與噴灑過程中人參植株的受藥面積和采樣均勻程度有關(guān)，還可能是受寧南霉素自身的理化性質(zhì)影響，由于寧南霉素屬于生物農(nóng)藥，極易被日光、植物或土壤微生物分解，而在試驗過程中桓仁的平均日照數(shù)、施藥期間的降雨量和平均氣溫均大于白山，導(dǎo)致寧南霉素在白山人參植株中的半衰期較長。

表5 寧南霉素在人參植株中的消解動態(tài)Table 5 Dissipation dynamics of ningnanmycin in ginseng plants

2.6 寧南霉素在人參中的最終殘留量

試驗結(jié)果見表6。從中可以看出，寧南霉素在鮮人參和干人參上的最終殘留量均低于LOQ；在人參植株上的最終殘留量為

表6 寧南霉素在人參中的最終殘留量Table 6 Terminal residues of ningnanmycin in ginseng

3 結(jié)論與討論

本研究建立了固相萃取法檢測人參中寧南霉素殘留的分析方法，比較了不同酸堿度提取體系與不同提取方式對寧南霉素回收率的影響，考察了不同固相萃取柱對其凈化效果的影響，優(yōu)化了前處理提取和凈化的過程。該方法簡單、高效、準(zhǔn)確，通過以PLS+PXC固相萃取柱萃取，有效地實現(xiàn)了樣品凈化，通過基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法定量，方法驗證結(jié)果符合中國《農(nóng)作物中殘留試驗準(zhǔn)則》要求。

應(yīng)用所建立的方法檢測吉林省白山市、撫松縣、延吉市及遼寧省桓仁縣人參中寧南霉素的殘留量。結(jié)果表明，寧南霉素在人參植株上估算半衰期為0.76～11.77 d。當(dāng)樣品采收間隔期為14、21 d時，鮮人參和干人參中寧南霉素的殘留量均低于LOQ；人參植株中寧南霉素的殘留量為

目前我國規(guī)定寧南霉素在稻米與糙谷中的臨時限量為0.2 mg/kg、在番茄、黃瓜和蘋果中的臨時限量為1.0 mg/kg、在香蕉中的臨時限量為0.5 mg/kg[19]，暫未設(shè)定寧南霉素在人參中的最大殘留限量 (MRL)。綜上所述，為達(dá)到防治人參疫病同時降低農(nóng)藥殘留的目的，建議我國寧南霉素在鮮人參中的MRL值為0.2 mg/kg，人參植株中的MRL值為0.5 mg/kg，干人參中的MRL值為0.5 mg/kg。建議將8%寧南霉素水劑在人參上登記使用，并推薦其用于防治人參疫病時，推薦施藥劑量675～900 g/hm2(有效成分54～72 g/hm2) 施藥3次，安全間隔期為14 d，收獲期人參安全。