QuEChERS-氣相色譜-串聯質譜法高通量篩查植物源中藥材中460種農藥殘留

黃學者, 崔宗巖, 葛 娜, 紀涌彥, 曹彥忠

(秦皇島海關技術中心，河北 秦皇島 066004)

我國中藥材種類繁多，常用植物源中藥材有600多種，每年有大量的中藥材出口到日本、美國等近100個國家和地區[1]。原國家食品藥品監督管理總局發布的2013—2016年全國藥品質量抽驗監測數據表明，國內中藥材與飲片總體合格率分別為64%、68%、75%和77%，合格率雖呈逐年提升，但不合格率依然較高，其中農藥殘留和重金屬超標是最主要的風險因素，占80%以上[2]。究其原因，首先，我國中藥材生產科技水平不夠發達，現有登記用于中藥材的農藥產品數量有限[3]，農民存在濫用、誤用農藥現象，易導致農藥殘留風險。其次，目前國內雖然有一些中藥材的生產管理規定，但缺乏統一標準，可操作性較差。我國藥用和芳香植物生產管理規范 (GAP) 標準還沒有推行[4]，GAP種植基地較少，規范化種植的中藥材僅50多種。因此，亟需建立一種廣泛適用于各種類型植物源中藥材農藥殘留的篩查方法。

關于中藥材中農藥殘留檢測的前處理方法主要有：固相萃取 (SPE)[5]、在線凝膠滲透色譜(GPC)[6]、基質固相分散 (MSPD)[7]、QuEChERS[8]等，其中QuEChERS方法具有快速、簡單、廉價、有效、可靠和安全等特點，得到了越來越多檢測機構的認可和廣泛應用，食品安全國家標準[9]即采用QuEChERS方法作為農藥殘留的前處理方式。儀器檢測方法主要包括：氣相色譜-電子捕獲檢測法 (GC-ECD)[10]、大氣壓氣相色譜-飛行時間質譜法 (APGC-QTof)[11]、超高效液相色譜-四極桿/軌道阱高分辨質譜聯用法 (UPLC-Q-Orbitrap HRMS)[12]、氣相色譜-質譜法 (GC-MS)[13]、氣相色譜-串聯質譜法 (GC-MS/MS)[14-15]、高效液相色譜法(HPLC)[16]、液相色譜-串聯質譜法 (LC-MS/MS)[17]等。其中GC-MS/MS具有高抗干擾能力、高通量和高選擇性等優點，適用于分析背景干擾嚴重、定性困難、樣品組分含量低的情況，能夠滿足中藥材中農藥多殘留的檢測。

現有中藥材農藥殘留檢測方法的不足在于：1) 檢測目標物種類有限，高通量多殘留檢測方法較少；2) 檢測樣品多集中在一種或一類中藥材上，不能滿足涵蓋各種類型植物源中藥材的快速和高通量檢測要求。

本研究建立了460種農藥殘留的GC-MS/MS方法數據庫，結合QuEChERS檢測方法，分別對5類代表性植物源中藥材的提取凈化條件進行了考察和優化，并將其應用于市售中藥材樣品的篩查檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

氣相色譜-串聯質譜儀 (TSQ 8000型，美國Thermo Fisher公司)，高速冷凍離心機 (3-30K型，美國Sigma公司)，振蕩器 (SA300型，日本Yamato公司)，氮吹儀 (N-EVAPTM112型，美國Organomation公司)，超純水發生器 (Mili-Q型，美國Millipore公司)，分析天平 (XP105型，瑞士Mettler Toledo公司) 等。

460種農藥(見表1)標準品 (純度≥97%，德國Dr. Ehrenstorfer GmbH、美國Strem Chemicals及美國Sigma Aldrich等公司)。準確稱取適量標準品，分別用甲苯等溶劑配制成1 mg/mL的標準儲備液，于 ?20 ℃保存。標準工作溶液采用甲苯稀釋，配制質量濃度為1.0 μg/mL。

甲苯、正己烷和乙腈 (均為色譜純，Dikma公司)；乙酸 (色譜純，美國TEDIA公司)；無水硫酸鎂和氯化鈉 (分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；N-丙基乙二胺 (PSA) 和C18(Dikma公司)；石墨化碳黑 (GCB，CNW公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理 準確稱取中藥材樣品2.50 g于50 mL離心管中，加入15 mL去離子水浸泡2 h；加入20.0 mL 0.1%乙酸-乙腈(0.1%為體積分數，下同)、6.00 g無水硫酸鎂和2.50 g氯化鈉，渦旋混勻2 min，振蕩提取20 min，于3 500 r/min下離心5 min；取10.0 mL上清液于40 mL塑料具塞離心管中，管內預先裝有1.50 g無水硫酸鎂(150 mg/mL)、0.50 g PSA (50 mg/mL)和0.50 g C18(50 mg/mL)，渦旋2 min，于10 000 r/min下離心5 min；取5 mL上清液于15 mL玻璃試管中，在45 ℃下氮吹至近干，加入100 μL 7 μg/mL的環氧七氯正己烷溶液，渦旋混勻，過0.22 μm有機相濾膜，待GC-MS/MS檢測。

1.2.2 儀器檢測條件

色譜條件：DB-5MS型5%苯基-95%甲基聚硅氧烷固定相的弱極性色譜柱 (30 m × 0.25 mm，0.25 μm)，進樣口溫度290 ℃，不分流進樣，載氣為高純氦氣 (≥99. 999%)，采用恒流進樣模式，流速1.5 mL/min，進樣體積為1.0 μL。升溫程序：初始溫度為50 ℃，保持1 min，以 20 ℃/min的速率升至100 ℃，然后再以10 ℃/min 的速率升至290 ℃，保持10 min。

質譜條件：EI離子源，溫度250 ℃，傳輸線溫度為280 ℃，多離子反應監測 (SRM) 模式。460種農藥的保留時間和質譜條件見表1。

2 結果與討論

2.1 儀器檢測方法數據庫的建立

2.1.1 色譜條件的優化 選擇最常用的DB-5MS型5%苯基-95%甲基聚硅氧烷固定相的弱極性色譜柱，該色譜柱耐高溫，適用于不同沸點和極性農藥殘留化合物的分離和檢測。由于串聯質譜對目標物的選擇性檢測能力大大提高，對分離的要求相對降低，因而主要考慮了低沸點和高沸點化合物的特性，以及異構體的分離特征，對升溫程序進行了選擇和優化，50 ℃保持1 min后對比了3種升溫速率：① 20 ℃/min升至290 ℃；② 10 ℃/min升至290 ℃；③ 20 ℃/min升至100 ℃，然后10 ℃/min升至290 ℃。結果發現：升溫程序①分析時間短，但部分同分異構體分離效果不好；升溫程序②分離效果較好，但分析時間較長。升溫程序③既保證了分離效果又節約了分析時間，在1.2.2節色譜條件下實現了460種農藥在色譜柱上較好的分離 (圖1)，通過色譜不能分開的則依據其特征性質譜參數再進行分離。

2.1.2 質譜參數的優化 采用自動化選擇反應監測 (AutoSRM) 功能對化合物的特征離子對 (母離子、子離子) 及對應碰撞能量等進行了優化，優化后的質譜參數見表1。實際樣品檢測采用SRM方式，通過二級選擇，使得目標物檢測的特異性大大提高，一方面降低了噪音，提高了檢測靈敏度，另一方面也避免了復雜基質的干擾，提高了定性定量的準確性。

表1 460種農藥的保留時間和定量離子對、輔助定性離子對及碰撞能量Table 1 Retention time, quantitative ion, confirming ion and collision energy of 460 pesticides

2.2 QuEChERS方法的選擇和優化

針對不同類型的植物源中藥材基質，結合國家相關標準[18-22]，選擇和優化了QuEChERS前處理條件，主要優化了提取溶劑體系和凈化條件。

2.2.1 提取條件選擇 乙腈是農藥殘留常用提取試劑，QuEChERS方法提取體系通常分為3種：單一乙腈體系[23]、加乙酸鹽緩沖體系[24](美國化學家分析家協會-AOAC標準方法) 以及加檸檬酸鹽體系[25]等，其中乙酸鹽緩沖體系在實際操作中抗基質效應更強，為了提高對酸堿敏感農藥的回收率，本研究選定乙酸-乙腈作為提取溶劑，分別考察了乙腈、0.1%乙酸-乙腈和1%乙酸-乙腈3個提取體系對5種類型植物源中藥材的提取效果。結果表明：在100 μg/kg添加水平下，根莖類、花葉類、籽實類、全草類和皮類5種類型中藥材基質均表現出相似的變化趨勢。以根莖類為例 (圖2A)，相對純乙腈，當提取溶劑為0.1%乙酸-乙腈時，均可使得目標物的回收率及相對標準偏差提高，且對大多數樣品而言，0.1%和1%乙酸加入量之間無顯著差異，因而最終選用0.1%乙酸-乙腈作為提取溶劑。

2.2.2 凈化條件選擇 參考QuEChERS方法常用凈化條件[14,17]，本研究選擇分散固相萃取法清除樣品中的水分和干擾基質，在用無水硫酸鎂清除水分的條件下分別考察了PSA、PSA + C18和PSA + C18+GCB 3種凈化體系對5種類型中藥材基質的凈化效果。結果表明：在100 μg/kg添加水平下，根莖類、花葉類、籽實類、全草類和皮類5種類型中藥材基質同樣均表現出相似的變化趨勢，代表性根莖類樣品的凈化條件對比見圖2B。相對于PSA，PSA + C18對基質較為復雜的花葉類、全草類和皮類樣品的凈化效果明顯增強，對基質相對簡單的根莖類和籽實類樣品的凈化效果略有增強；與PSA + C18相比，PSA + C18+ GCB對部分顏色較深的花葉類和全草類樣品的凈化效果 (祛除顏色)雖有一定程度增強，但GCB對部分農藥 (七氯、五氯苯胺、五氯硝基苯和六氯苯等) 吸附作用過強，導致其回收率大大降低，因而本方法未采用PSA + C18+ GCB的凈化組合；PSA中加入C18雖然在視覺上對根莖類和籽實類樣品凈化效果增強不明顯，但在不影響回收率的前提下，考慮到盡量減輕連續及大量進樣對色譜柱和儀器造成的污染和損害，最終決定選用PSA + C18凈化組合。

續表1Table 1 (Continued)

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2.3 方法性能評價

目前，國內外關于中藥材中農藥最大殘留限量 (MRLs) 的標準主要以藥典為準[26]。《歐洲藥典》 (EP 8.0)、《美國藥典》 (USP 38) 和《英國藥典》 (BP 2015) 共涉及中草藥中76種農藥殘留，其中《英國藥典》對植物源中藥材中的農藥進行了概括性限制：有機氯類農藥的MRL值為0.05 mg/kg，其他農藥MRL值為0.5 mg/kg 或1.0 mg/kg；《中國藥典》規定了22種有機氯類農藥的MRL值。本研究考察了QuEChERS-GC-MS/MS方法在5種類型中藥材基質中的定量限 (LOQ) (信噪比為10時對應的目標物濃度)，表2中僅列出了其中至少在一種基質中LOQ大于50 μg/kg的農藥品種。

表2 QuEChERS-GC-MS/MS測定5種類型中藥材基質中農藥殘留的定量限 (僅列出LOQ大于50 μg/kg的農藥)Table 2 Limits of quantification (LOQ) for determination of pesticide residues in different types of Chinese medicinal materials by QuEChERS-GC-MS/MS (Only pesticides of LOQ > 50 μg/kg were listed) (μg/kg)

總體而言，對不同類型中藥材樣品，本方法的LOQ整體上在0.006～221 μg/kg之間，其中80%以上目標物LOQ不高于50 μg/kg，對于根莖類和籽實類樣品，60%以上農藥LOQ低于10 μg/kg，說明本篩查檢測方法在高通量基礎上具有較高的靈敏度；針對不同類型植物源中藥材樣品所測得的回收率和相對標準偏差數據表明，72%以上目標物的回收率在60%～120%之間，77%以上農藥的相對標準偏差在20%以內，方法的準確度良好。

與現有國家標準GB 23200.10—2016[18]及其他相關文獻方法相比，本研究建立的QuEChERSGC-MS/MS方法更加全面適用于不同類型植物源中藥材基質 (根莖類、花葉類、籽實類、全草類、皮類等)，可實現一次進樣同時檢測400種以上農藥殘留，且大多數農藥的靈敏度和準確度均可滿足方法學要求[27]，具有簡便、快速和高通量的優點，適用于不同類型植物源中藥材中農藥殘留的篩查測定。

2.4 實際樣品檢測

為了驗證本研究方法的實用性并系統了解市售植物源中藥材中農藥殘留狀況，采用本研究方法對從藥店及藥材市場等地采集的215批中藥材樣品進行了篩查檢測。結果表明，有17批樣品未檢出任何農藥殘留，其余198批樣品均檢出1種以上農藥殘留，占檢測樣品總數的92%。其中所有花葉和全草類樣品均檢出了農藥殘留，可能與這些類型的中藥材為農藥直接施用部位有關。從檢出農藥種類來看，所有樣品共檢出72種農藥殘留，檢出率最高的3種農藥分別為毒死蜱 (20.7%)、氟氯氰菊酯 (16.0%) 和六氯苯 (15.3%)，其中毒死蜱最高殘留量達到355 μg/kg，氟氯氰菊酯最高殘留量達到1 014 μg/kg，應當引起關注和重視，可以作為其質量安全評價重點關注的風險物質。

3 結論

建立了植物源中藥材中農藥多殘留高通量篩查檢測的QuEChERS-GC-MS/MS。樣品在用0.1%乙酸-乙腈提取、氯化鈉鹽析分層、PSA + C18分散固相萃取凈化條件下，針對根莖類、花葉類、籽實類、全草類和皮類5種類型中藥材基質，實現了一次進樣同時檢測400多種農藥殘留。該方法具有快速、靈敏和高通量的優勢，將其運用于市售215批植物源中藥材樣品檢測，發現毒死蜱、氟氯氰菊酯等農藥檢出率較高，應當重點關注和防控。