O.oeni糖苷酶活性對干白葡萄酒萜烯類香氣的影響

祝 霞 趙丹丹 李俊娥 毛亞玲 韓舜愈 楊學山

(1.甘肅農業大學食品科學與工程學院， 蘭州 730070； 2.甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室， 蘭州 730070)

0 引言

萜烯類化合物能夠賦予葡萄及葡萄酒典型的品種特征[1]，它們在葡萄成熟過程中逐漸積累，并且以糖苷配基的形式直接連接在β-D-葡萄糖上形成單糖苷，連接有單糖苷配基的葡萄糖可進一步與α-L-呋喃阿拉伯糖、α-L-吡喃鼠李糖、β-D-呋喃芹菜糖等鍵合生成雙糖苷或三糖苷[2]。糖苷測定分析表明，葡萄中的雙糖苷鍵合態香氣前體物含量最高，單糖苷次之，三糖苷最低[3]，且鍵合態的糖苷類化合物只有轉化為游離態的香氣成分才會被消費者感知。單糖苷類香氣前體物質可由β-葡萄糖苷酶直接酶解；雙糖苷化合物首先在α-L-鼠李糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶等外切酶的作用下生成β-D-葡萄糖單糖苷，然后在β-D-葡萄糖苷酶作用下釋放出具有揮發性的糖苷配基[4-5]。因此，特異性的單糖苷酶和雙糖苷酶被認為是釋放萜烯類化合物的有效工具。

釀酒酵母可以分泌糖苷酶，但在高糖、高酒精、高多酚以及低pH值的釀酒工藝條件下無法保持其高效的催化活性[6-7]。此外，一些非釀酒酵母也可以合成活力較高的β-葡萄糖苷酶，但其生長僅局限于酒精發酵開始階段，隨著酒精含量的增加，非釀酒酵母數量會急劇下降[8]。蘋果酸-乳酸發酵(Malolactic fermentation，MLF)是釀造優質干紅和部分干白葡萄酒所必需的生產工藝[9]，O.oeni菌株在生物降酸的同時還可以合成釋放糖苷酶，從而豐富和提升酒體的香氣品質[9-13]。文獻[12]提出，評價優良O.oeni菌株發酵特性時，不能只局限于β-D-葡萄糖苷酶，還應考慮α-L-阿拉伯糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶的活性。文獻[14]研究表明，O.oeni糖苷酶具有較強的菌株依賴性，供試菌株中90%的菌株具有活性較高的α-L-鼠李糖苷酶，50%左右的菌株α-L-阿拉伯糖苷酶活性較高。因此，有必要對菌株合成糖苷酶特性進行系統分析，以便在用于發酵劑之前進行合理選擇。

為了在日益全球化的葡萄酒市場中尋求獨特之處，分離篩選優良本土O.oeni、釀造代表產區風格的葡萄酒已成為研究者關注的焦點[15-21]。本文以分離篩選的本土O.oeni菌株為試驗對象，以商業菌株VP41為對照，探討各釀造因子對供試菌株糖苷酶活性的影響，動態監測發酵過程中菌株糖苷酶活性的變化，并在優化后的釀造條件下進行霞多麗干白葡萄酒MLF，分析比較MLF前后酒樣中萜烯類物質的變化，以期為挖掘本土菌株釀造特性、生產代表河西走廊產區的葡萄酒提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本土酒酒球菌菌株：GF-2、ZX-1、QL-11、MG-1菌株分離自甘肅省河西走廊產區葡萄酒生產企業自然啟動MLF酒樣，由北京六合華大基因科技有限公司進行種屬鑒定。16S rDNA測序結果顯示，GF-2、ZX-1、QL-11、MG-1與模式菌株OenococcusoeniDSM 20252(T)相似度分別達到99.84%、99.34%、99.78%、99.58%。

商業酒酒球菌：VP41，購自上海杰兔責任有限公司。

商業釀酒酵母：ES488，購自意大利Enartis公司。

釀酒葡萄：選用2019年產自甘肅省莫高葡萄種植基地的霞多麗葡萄，含糖量約為21.3°Brix，總酸質量濃度6.87 g/L(以酒石酸計)，pH值3.36。

1.2 培養基與試劑

酸性番茄培養基(ATB)配制參照文獻[16]的方法。

參照文獻[18]的方法進行模擬汁培養基的配制：葡萄糖1 g/L、果糖1 g/L、L-蘋果酸2 g/L、海藻糖1 g/L、酒石酸1 g/L、檸檬酸1 g/L、乙酸鈉0.14 g/L、酵母浸粉4.0 g/L、水解酪蛋白2.5 g/L、KH2PO40.3 g/L、KCl 0.22 g/L、L-型半胱氨酸鹽酸0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.065 g/L、MnSO4·4H2O 0.015 g/L、CaCl20.065 g/L、甘油3 mL/L。

香氣標準品：香茅醇、橙花醇、芳樟醇、α-松油醇、β-紫羅蘭酮、反式橙花叔醇等香氣化合物和內標物2-辛醇標準品(美國Sigma公司)。

其他試劑：L-蘋果酸檢測試劑盒(愛爾蘭Megazyme公司)；對硝基苯酚(p-NP)、對硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷(p-NPG)、4-硝基苯基-α-L-吡喃鼠李糖苷、4-硝基苯基-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(上海源葉有限責任公司)；氫氧化鈉、檸檬酸、磷酸二氫鉀、碳酸鈉，均為分析純試劑(天津光復精細化工研究所)。

1.3 儀器與設備

SPX-150-Ⅱ型生化培養箱(上海躍進醫療器械有限公司)；pHS-3C型pH計(上海雷磁責任有限公司)；TU-1810型可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)； SW-CJ-2FD型超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)；LDZX-50KBS型高壓蒸汽滅菌鍋(上海申安醫療器械廠)；GZX-GF101-Ⅱ型恒溫干燥箱(上海躍進醫療器械有限公司)；H2050R型高速冷凍離心機(長沙湘儀儀器有限公司)。

1.4 試驗方法

1.4.1標準曲線制備

參照文獻[22]的方法并略作修改。當p-NP濃度在10～80 μmol/L范圍時，400 nm處OD值與濃度回歸方程為：y=0.007 6x+0.019 9，R2=0.997 4，線性關系良好，可用作后續試驗中糖苷酶活性的計算。

1.4.2菌種活化

參照文獻[20]的方法挑取斜面上保存的菌種置于滅菌后的ATB培養基內，在28℃下培養，待生長至對數期時(600 nm處OD值約1.1)，進行后續試驗接種。

1.4.3糖苷酶活性測定方法

(1)β-D-葡萄糖苷酶活力

參照文獻[14]的方法并略作修改。以對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷為底物，反應體系(2.5 mL)為：從模擬汁培養基中取1 mL的培養液，加1 mL檸檬酸-磷酸緩沖溶液(pH值5.0)和0.5 mLp-NPG溶液，混合后于50℃條件反應30 min，然后8 000 r/min離心15 min，取上清液，加入2 mL的1 mol/L Na2CO3終止反應。在400 nm波長處測定吸光度。

酶活力單位(U)定義為：每1 min每1 mL菌體細胞水解相應底物生成p-NP所需要的酶量(μmol)。

(2)α-L-鼠李糖苷酶活力

參照文獻[23]的方法。以4-硝基苯基-α-L-吡喃鼠李糖苷為底物，反應體系(3.5 mL)為：取0.4 mL的培養液，加1 mL檸檬酸-磷酸緩沖溶液(pH值5.0)和0.1 mL底物(1.5 mmol/L)溶液，混合后于50℃條件下反應30 min后8 000 r/min離心15 min，取上清液，加入2 mL 0.5 mol/L Na2CO3終止反應。在400 nm波長處測定吸光度。

(3)α-L-阿拉伯糖苷酶活力

參照文獻[24]的方法。以4-硝基苯基-α-L-吡喃阿拉伯糖苷為底物，反應體系(2.1 mL)為：取0.4 mL的培養液，加1 mL檸檬酸-磷酸緩沖溶液(pH值5.0)和0.1 mL底物(1.5 mmol/L)溶液，混合后于50℃條件下反應30 min，然后8 000 r/min離心15 min，取上清液，加入0.6 mL飽和硼砂溶液終止反應。在400 nm波長處測定吸光度。

1.4.4本土酒酒球菌菌株酶活力評價

利用模擬汁體系對4株本土O.oeni及1株商業O.oeni菌株的3種糖苷酶(β-D-葡萄糖苷酶、α-L-鼠李糖苷酶和α-L-阿拉伯糖苷酶)活力進行測定，分析比較供試菌株酶活性變化規律，篩選產酶活性較高的菌株。試驗平行重復3次。

1.4.5各釀造因子對菌株糖苷酶活性的影響

(1)初始pH值

將鑒定所得O.oeni菌株經ATB斜面培養、ATB液體培養基活化后，取處于對數生長期的供試菌株以1×107CFU/mL的接種量，分別接種于pH值為3.0、3.2、3.4、3.6、3.8的模擬汁培養基中(HCl或NaOH調整pH值)，28℃靜置培養，每隔48 h測定發酵液中糖苷酶活性。試驗重復3次，下同。

(2)乙醇體積分數

將培養至對數生長期的O.oeni菌株，以1×107CFU/mL的接種量分別接種于乙醇體積分數為6%、8%、10%、12%、14%的模擬汁培養基中，28℃靜置培養，每隔48 h測定發酵液中糖苷酶的活性。

(3)發酵溫度

待O.oeni菌株培養至對數生長期，以1×107CFU/mL的接種量接種于模擬汁培養基中，分別置于18、20、22、25、28℃培養箱靜置培養，每隔48 h測定發酵液中糖苷酶的活性。

(4)SO2添加量

以1×107CFU/mL的接種量，將培養至對數生長期的O.oeni菌株，分別接種于SO2添加量(亞硫酸鈉調節)為15、30、45、60、75 mg/L的模擬汁培養基中，28℃靜置培養，每隔48 h測定發酵液中糖苷酶的活性。

1.4.6復合試驗設計

根據單因素試驗結果，對pH值、乙醇體積分數、發酵溫度、SO2添加量4個因素進行L9(34)正交試驗設計。

1.4.7微釀試驗

菌株活化：參考廠家說明書推薦方法進行釀酒酵母菌株活化。按推薦用量(0.2 g/L)將ES488干酵母菌粉溶于10倍體積無菌水中，37℃靜置溶解20 min，再加入等體積的葡萄汁于28℃活化25 min。酒酒球菌菌株活化參照1.4.2節的方法進行。

葡萄酒微釀試驗：參照文獻[25]完成霞多麗干白葡萄酒酒精發酵后，選擇產酶性能優良的O.oeni菌株，按1×107CFU/mL的接種量進行接種，以商業菌VP41作為對照。自接入菌株開始，每隔48 h取樣，測定L-蘋果酸質量濃度，小于0.2 g/L時結束MLF。取樣測定理化指標和萜烯類香氣化合物。

理化指標測定：酒精度、殘糖含量、pH值、總酸含量、揮發酸含量和總SO2含量檢測均參照文獻[26]中的試驗方法進行。L-蘋果酸含量測定參考L-蘋果酸檢測試劑盒說明書進行。

揮發性香氣化合物含量的測定：參照文獻[25]的香氣物質萃取方法及氣相色譜-質譜聯用儀(Gas chromatography and mass spectrometry，GC-MS)條件，進行香氣成分富集和定性定量分析。于15 mL的頂空瓶中加入2.5 g氯化鈉、8 mL酒樣、20 μL 2-辛醇(質量濃度81.06 mg/L)，加磁力攪拌轉子后封口，放入恒溫加熱磁力攪拌器中，40℃水浴平衡30 min，然后插入萃取針頂空萃取30 min。

(1)GC-MS條件

GC條件：色譜柱DB-WAX 60 m×2.5 mm×0.25 μm，不分流進樣；載氣(He)流速1 mL/min；進樣口溫度240℃，解析時間5 min；柱溫升溫程序：50℃保持5 min，以3.5℃/min升至180℃，保持15 min。

MS條件：電子轟擊離子源(EI)；電子能量70 eV；傳輸線溫度180℃；離子源溫度200℃；質譜掃描范圍50～350(質荷比)。

(2)定性與定量分析

定性分析：采用與標準香氣成分保留時間(RT)對比的方法結合NIST-11、Wiley及香精香料標準譜庫檢索比對結果進行揮發性香氣化合物定性分析。

定量分析：對于已有標準品的香氣化合物通過內標標準曲線法進行定量分析，其他香氣化合物含量利用內標法進行相對定量分析，內標物為2-辛醇。

1.4.8試驗數據處理

對試驗所得數據采用Microsoft Office Excel 2010、Origin 2018進行基本處理和制圖，IBM SPSS Statistics 19.0 軟件進行多重比較(Duncan法，P<0.05)及差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 本土酒酒球菌菌株糖苷酶活性測定

分別將供試菌株接種于模擬汁培養基中進行發酵，每隔48 h取樣，測定酶活力。由于MLF在14 d時基本結束，發酵過程中共需取樣7次，且所測酶種類較多(3種)，為便于直觀比較各菌株的酶活性，參照文獻[27]的方法，采用酶活力累積量(mU/mL)，即同一菌株、同一種酶的7次測定結果逐次相加，表征分析不同菌株之間的差異(表1)，下同。

表1 5株O.oeni糖苷酶活性測定

由表1可知，對4株供試本土O.oeni的3種糖苷酶活性比較發現，菌株GF-2、ZX-1的β-D-葡萄糖苷酶、α-L-鼠李糖苷酶活性最高值都分別顯著高于菌株QL-11、MG-1的最大酶活性(P<0.05)。QL-11、MG-1的3種酶活性測定值都低于菌株VP41的酶活性。因此，選擇菌株GF-2、ZX-1為后續的測試菌株。

2.2 各發酵條件對本土酒酒球菌菌株糖苷酶活性的影響

結合態香氣雙糖苷酶解時，首先由雙糖苷酶作用于相應的阿拉伯糖、鼠李糖基等糖基配體，使雙糖苷變為單糖苷；然后再由β-D-葡萄糖苷酶斷裂糖苷鍵，生成游離芳香苷元和葡萄糖[28]。因此采用雙糖苷酶活力累積量(mU/mL)(α-L-鼠李糖苷酶和α-L-阿拉伯糖苷酶活力累積量之和)和β-D-葡萄糖苷酶活力累積量(mU/mL)，分別直觀表征在不同發酵條件下供試菌株之間的糖苷酶活性差異。

2.2.1初始pH值

由圖1(圖中不同小寫字母表示在P<0.05水平下組內(相同橫坐標、不同圖例)差異顯著，不同大寫字母表示在P<0.05水平下組間(相同圖例、不同橫坐標)差異顯著，下同)所示，隨著pH值的增加，供試菌株的β-D-葡萄糖苷酶和雙糖苷酶活力累積量都呈現增加趨勢，且菌株VP41的2種酶活性低于菌株ZX-1、GF-2的酶活性。供試菌株在pH值為3.6或3.8時具有最大的β-D-葡萄糖苷酶活力累積量，且在不同的pH值梯度下，菌株GF-2的β-D-葡萄糖苷酶活力比ZX-1和VP41的酶活性顯著較高。VP41的最大雙糖苷酶活力累積量(19.440 mU/mL)出現在pH值為3.8，ZX-1、GF-2的最大雙糖苷酶活力累積量則是在pH值為3.6時產生(32.964、22.718 mU/mL)。當初始pH值為3.0時，VP41比ZX-1表現出更強的酶活特性；除pH值3.0以外，菌株ZX-1的雙糖苷酶活性在不同pH值下都顯著高于其它供試菌株(P<0.05)。

2.2.2乙醇體積分數

由圖2可知，不同菌株在不同乙醇體積分數影響下的β-D-葡萄糖苷酶活力累積量不同。本土O.oeni菌株ZX-1、GF-2在乙醇體積分數為8%時產生最大β-D-葡萄糖苷酶活力累積量(24.570、30.166 mU/mL)，對照菌株VP41的最大β-D-葡萄糖苷酶活力累積量在乙醇體積分數為6%時產生(17.202 mU/mL)，且在乙醇體積分數為6%～8%時，VP41的β-D-葡萄糖苷酶活力累積量顯著低于本土O.oeni的酶活力累積量(P<0.05)。乙醇體積分數為6%～12%時，菌株GF-2的雙糖苷酶活力累積量均高于菌株ZX-1和VP41的酶活力累積量，但當乙醇體積分數達到14%時，VP41的雙糖苷酶活力累積量顯著高于2株本土O.oeni，表明商業菌株VP41在較高乙醇體積分數的葡萄酒中更有利于品種香的釋放。此時，GF-2的雙糖苷酶活力累積量顯著下降，與ZX-1無顯著差異(P<0.05)。

2.2.3SO2添加量

圖3為SO2添加量對供試菌株糖苷酶活力的影響。供試菌株在SO2添加量為30 mg/L時有最大β-D-葡萄糖苷酶活力累積量，且GF-2的β-D-葡萄糖苷酶活力累積量(30.933 mU/mL)顯著高于ZX-1和VP41菌株；SO2添加量為45～75 mg/L時，ZX-1與VP41的β-D-葡萄糖苷酶活力累積量差異不顯著(P<0.05)。在SO2添加量為15～45 mg/L時，ZX-1的雙糖苷酶活力累積量顯著高于GF-2和VP41，當SO2添加量為60～75 mg/L時，商業菌株VP41的雙糖苷酶活力累積量顯著高于本土O.oeni。

2.2.4發酵溫度

發酵溫度是葡萄酒釀造過程中最可控的因素之一，不適宜的發酵溫度會導致雜菌的生長，從而破壞葡萄酒的感官質量[10]。O.oeni的最適生長溫度是25～28℃，而葡萄酒的MLF溫度為18～22℃，綜合考慮，選擇在18～28℃不同的溫度下，對菌株酶活性變化情況進行測定分析。

由圖4可知，在不同發酵溫度下，本土O.oeni菌株與商業菌株的β-D-葡萄糖苷酶活力累積量不同。菌株VP41在22℃時有最大β-D-葡萄糖苷酶活力累積量(60.637 mU/mL)，而本土O.oeni菌株的最大酶活性則是在20℃產生，且菌株ZX-1和GF-2的最大酶活性沒有顯著性差異(P<0.05)。雖有研究證明28℃為O.oeni菌株較適宜的生長溫度，但28℃時本土O.oeni菌株與商業菌株的β-D-葡萄糖苷酶活性較低。菌株VP41的最大雙糖苷酶活性在28℃產生(29.695 mU/mL)。本土O.oeni菌株在22℃時雙糖苷酶活力累積量最小，最大酶活性在18℃時產生。

2.3 復合發酵條件下菌株酶活性的測定

葡萄酒釀造過程中，多個發酵參數會協同影響O.oeni的生長，O.oeni對葡萄酒生境的耐受能力決定著MLF的進展程度。因此，在復合發酵條件下測定供試菌株的酶活性，對依據釀造風格選擇MLF菌株更具有參考價值[28]。根據單因素試驗結果，pH值選取3.4、3.6、3.8共3個水平，雖然較高濃度的乙醇會抑制O.oeni的生長，但大部分干型葡萄酒的酒精度在10～15%vol之間，為了模擬真實的葡萄酒環境，結合單因素試驗結果，選取乙醇體積分數10%、12%和14%共3個水平進行后續試驗。結合干型葡萄酒釀造工藝的要求，選擇SO2添加量為30、45、60 mg/L進行復合因子發酵試驗。28℃是O.oeni菌株生長的較佳培養溫度，但過高的發酵溫度存在揮發酸過量的風險[15]。因此，結合葡萄酒MLF的實際情況，在復合發酵試驗設計時選擇發酵溫度為18、20、22℃。

2.3.1β-D-葡萄糖苷酶活性

由表2可知，乙醇體積分數為12%時，供試菌株有最大的β-D-葡萄糖苷酶活力累積量，分別為22.716 mU/mL(ZX-1)、23.990 mU/mL(GF-2)、23.506 mU/mL(VP41)；當SO2添加量為30 mg/L時，ZX-1的β-D-葡萄糖苷酶活力累積量為25.507 mU/mL，GF-2的β-D-葡萄糖苷酶活力累積量為27.914 mU/mL，VP41的β-D-葡萄糖苷酶活力累積量為29.529 mU/mL；與pH值3.4、3.8相比，pH值為3.6時，供試菌株的β-D-葡萄糖苷酶活力累積量達到最大值，且在發酵溫度22℃時，菌株的酶活性也較好。

表2 β-D-葡萄糖苷酶活性測定正交試驗結果與極差分析

從極差R可以看出，不同發酵因素對菌株ZX-1的β-D-葡萄糖苷酶活性影響從大到小依次為：SO2添加量、發酵溫度、pH值、乙醇體積分數；對菌株GF-2的β-D-葡萄糖苷酶活性影響從大到小依次為：SO2添加量、pH值、乙醇體積分數、發酵溫度；對VP41菌株β-D-葡萄糖苷酶活性影響從大到小依次為：SO2添加量、發酵溫度、乙醇體積分數、pH值。

由表3可知，SO2添加量對供試菌株的β-D-葡萄糖苷酶活性有極顯著影響(P<0.01)。pH值、發酵溫度、乙醇體積分數對菌株ZX-1和VP41的β-D-葡萄糖苷酶活性有顯著影響(P<0.05)；pH值、乙醇體積分數對菌株GF-2的β-D-葡萄糖苷酶活性有顯著影響(P<0.05)。

表3 β-D-葡萄糖苷酶活性測定正交試驗方差分析

2.3.2雙糖苷酶活性

在復合發酵條件下，菌株的雙糖苷酶活性表現出相似性，即在乙醇體積分數為12%、SO2添加量為30 mg/L、pH值3.6、發酵溫度22℃的條件下，具有最大的雙糖苷酶活力累積量。由表4可知，供試菌株的雙糖苷酶活力累積量有差異，從大到小依次為GF-2(46.576 mU/mL)、ZX-1(46.806 mU/mL)、VP41(36.774 mU/mL)。

表4 雙糖苷酶活性測定正交試驗結果與極差分析

從極差R可以看出，不同發酵因素對菌株ZX-1雙糖苷酶活性影響從大到小依次為：SO2添加量、pH值、乙醇體積分數、發酵溫度；對菌株GF-2雙糖苷酶活性影響從大到小依次為：SO2添加量、pH值、乙醇體積分數、發酵溫度；對菌株VP41雙糖苷酶活性影響從大到小依次為：SO2添加量、乙醇體積分數、發酵溫度、pH值。

由表5可知，SO2添加量對供試菌株的雙糖苷酶活性影響極顯著(P<0.01)。pH值、乙醇體積分數對菌株ZX-1和GF-2的雙糖苷酶活性有顯著影響(P<0.05)；發酵溫度、乙醇體積分數對菌株VP41的雙糖苷酶活性有顯著影響(P<0.05)。

表5 雙糖苷酶活性測定正交試驗方差分析

2.4 驗證試驗

根據正交試驗結果，選擇受試組中β-D-葡萄糖苷酶活性和雙糖苷酶活性最高的發酵條件，即乙醇體積分數為12%、pH值為3.6、SO2添加量為30 mg/L、發酵溫度為22℃的復合條件下，將發酵菌株分別接種于模擬汁中，進行驗證試驗，平行重復3次。結果表明ZX-1、 GF-2和VP41的β-D-葡萄糖苷酶活力累積量平均值分別為30.020、29.884、33.032 mU/mL，雙糖苷酶活力累積量平均值分別為45.932、46.137、37.011 mU/mL，均高于正交試驗其他處理組。由此確定在該條件下進行霞多麗干白葡萄酒MLF，并進行萜烯類物質檢測分析。

2.5 微釀試驗

2.5.1MLF后葡萄酒理化指標

霞多麗干白葡萄酒的基本理化指標見表6。由表6可知，各酒樣中L-蘋果酸質量濃度均小于0.2 g/L，表明MLF成功完成。pH值升高0.11～0.16，總酸質量濃度降低2.48～2.62 g/L。揮發酸含量雖然有所升高，但質量濃度最大值為0.42 g/L(<1.2 g/L)，均符合GB/T 15037—2006的要求。供試本土O.oeni菌株在第12天完成MLF，商業菌株VP41則在第14天完成MLF。

表6 蘋果酸-乳酸發酵前后干白葡萄酒樣理化指標

2.5.2萜烯類化合物GC-MS檢測

不同處理條件下，各處理組中萜烯類化合物含量的變化情況見表7。ZX-1處理組中萜烯類物質的總含量最高，質量濃度為515.897 μg/L，而VP41處理組中的萜烯類物質種類最多(11種)。2.3節的研究表明，雖然在不同復合條件下，菌株VP41的雙糖苷酶活力累積量顯著低于本土O.oeni(P<0.05)，但其β-D-葡萄糖苷酶在最優復合條件下顯著高于本土O.oeni的酶活力累積量(P<0.05)。萜烯類物質在葡萄果實中主要以雙糖苷的形式存在，在葡萄酒中雙糖苷酶作用生成的單糖苷物質由β-D-葡萄糖苷酶進一步水解，生成游離態的萜烯類物質。本土O.oeni發酵后的酒樣中雖然萜烯類物質種類僅次于VP41處理后的酒樣，但酒樣中的總含量卻較高，α-松油醇、香茅醇、大馬士酮、芳樟醇等萜烯類物質的質量濃度高于其閾值，具有潛在的花香味。

表7 各處理酒樣中萜烯類物質含量的變化

3 討論

3.1 釀造因子對O.oeni糖苷酶活性的影響

一些葡萄酒成分，如糖和乙醇，或釀酒過程中的溫度和pH值等因素均會影響糖苷的活性[14]。本試驗選擇糖苷酶活性表現較好的2株本土O.oeni(GF-2、ZX-1)和商業菌株VP41，分析初始pH值、乙醇體積分數、SO2添加量、發酵溫度等對菌株的糖苷酶活特性進行分析。結果發現不同釀造因子對同一菌株的糖苷酶活性影響不同，且存在著顯著差異(P<0.05)。文獻[2]研究表明，pH值是抑制O.oeni菌株酶活性的重要因子，與菌株酶活性呈正相關，這與本試驗中供試菌株在pH值為3.6～3.8時，菌株的酶活力累積量最高的結果相一致。同時在本試驗中當乙醇體積分數為6%～8%時，菌株糖苷酶活性最大；乙醇體積分數為10%～14%時，糖苷酶活性緩慢下降，與文獻[29]中乙醇影響O.oeni菌株的生長參數，卻不影響酶活性的研究結果存在差異。可能是因為乙醇改變了細胞膜的通透性，從而使胞內酶和底物之間更容易接觸[14]。同時酶活性的降低可以解釋為蛋白質變性的結果。文獻[16]的研究強調了添加SO2可能有助于調節MLF期間O.oeni的糖苷酶活性，本研究發現菌株在30 mg/L時有最大酶活性，得到了類似的結果。發酵溫度是葡萄酒釀造過程中最可控的因素之一，菌株VP41在22℃時有最大β-D-葡萄糖苷酶活性，而本土O.oeni菌株的最大酶活性則是在20℃產生，雖有研究證明28℃為O.oeni菌株較適宜的生長溫度，但本土O.oeni菌株與商業菌株的β-D-葡萄糖苷酶活性較低；菌株VP41的最大雙糖苷酶活性在28℃產生，本土O.oeni菌株最大雙糖苷酶活性在18℃產生，這提示在葡萄酒實際生產中，應根據發酵菌株特點選擇最適宜的發酵溫度。

3.2 O.oeni對葡萄酒萜烯類物質的影響

萜烯類化合物氣味閾值低、風味強烈、感官特征明顯，主要以糖苷態的形式存在于葡萄果皮中。O.oeni在MLF過程中降低葡萄酒酸度的同時伴隨著一系列的代謝活動，其中大量的酶代謝使得產生的揮發性化合物濃度遠超過其閾值，致使葡萄酒香氣濃郁度增加。本試驗接種不同O.oeni菌株分別對霞多麗干白葡萄酒進行MLF，結果表明本土菌株處理的酒樣雖然萜烯類物質種類僅次于VP41處理后的酒樣，但酒樣中的總含量卻較高，α-松油醇、香茅醇、大馬士酮、芳樟醇等萜烯類物質的含量高于其閾值，這與菌株具有的糖苷酶活性及類型有關。文獻[30]發現，MLF后酒樣中β-大馬士酮的濃度明顯增加，表明該化合物的形成可能與參與的菌株的水解活性有關。文獻[15]發現接種O.oeniMS46的葡萄酒MLF后的酒樣中形成了β-香茅醇(柑橘香味)，可能是經菌株MS46的糖苷酶對底物釋放后合成。本研究正如預期，MLF后萜烯類化合物質量濃度明顯增加，與文獻[11]的結果相一致。

4 結論

(1)在單因素條件下，供試菌株糖苷酶活性變化趨勢具有菌株相似性，在不同梯度條件下產酶活性具有一定的菌株差異性。當pH值為3.6時本土O.oeni菌株的糖苷酶活性均具有最大酶活性，且菌株ZX-1、GF-2的兩種酶活性高于商業菌株VP41的酶活性；乙醇體積分數在6%～8%時，供試菌株的糖苷酶都有最大酶活性；SO2添加量為30 mg/L時，供試菌株的β-D-葡萄糖苷酶和雙糖苷酶的酶活性均達到峰值；本土O.oeni的β-D-葡萄糖苷酶在20℃時產生的酶活性最高，菌株VP41在22℃下酶活性有最大值。復合釀造因子試驗結果表明，在pH值3.6、乙醇體積分數為12%、SO2添加量為30 mg/L、發酵溫度為22℃的發酵條件下，供試菌株均有最大酶活力累積量，但本土O.oeni菌株的糖苷酶活力累積量高于商業菌株VP41。

(2)霞多麗干白葡萄酒微釀試驗結果表明，供試本土菌株具有良好的L-蘋果酸降解能力。萜烯類化合物GC-MS分析結果顯示，本土O.oeniZX-1發酵后的酒樣中雖然萜烯類物質種類僅次于VP41處理后的酒樣，但酒樣中的總含量卻最高(質量濃度515.897 μg/L)，α-松油醇、香茅醇、大馬士酮、芳樟醇等萜烯類物質的質量濃度高于其閾值，具有潛在的花香味，這與供試菌株的風味酶活性累積量變化規律相一致。