單因素試驗結(jié)合Box-Behnken設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化舒肝顆粒（廣西方）的醇提工藝

梁芳 黃艷紅 龔志強 蒙田秀 呂瀟 陳思宏 譚德慧

【摘 要】 目的：優(yōu)化舒肝顆粒（廣西方）的醇提工藝。方法：通過單因素試驗篩選影響醇提工藝的關(guān)鍵因素，以乙醇體積分數(shù)、提取溶劑加入量、提取時間為考察因素，以提取液中迷迭香酸、虎杖苷、大黃素的總含量與浸膏得率的綜合評分為評價指標(biāo)，采用Box-Behnken 設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化舒肝顆粒（廣西方）的醇提工藝，并進行驗證實驗。 結(jié)果：最佳醇取工藝條件為加入12倍量60%乙醇，提取2次，每次加熱回流80 min。驗證試驗中3批樣品提取后的綜合評分為99.54%，與模型預(yù)測值98.16%相比較，相對誤差為0.46%（RSD=0.40%，n=3）。結(jié)論：優(yōu)化的醇提工藝合理可行，可為舒肝顆粒（廣西方）的工藝研究提供參考。

【關(guān)鍵詞】 舒肝顆粒（廣西方）;醇提工藝;總含量;Box-Behnken 設(shè)計-響應(yīng)面法

【中圖分類號】R932 【文獻標(biāo)志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2021）13-0039-07

Abstract：Objective To optimize the alcohol extraction technology of Shugan granules （Prescription of Guangxi）.Methods Screening of key factors influencing the alcohol extraction process by single factor tests.Using volume fractions of alcohol，volume of addition and extraction time as factors，taking comprehensive scoring value of the total contents of rosmarinic acid，polydatin， emodin and the yield of extract as evaluation index，Box-Behnken design-response surface method was used to optimize the alcohol extraction technology of Shugan granules（Prescription of Guangxi）.Validation test was also conducted.Results The optimal extraction technology was adding 12 times of 60% alcohol，extracting for 2 times，reflexing for 80min each time.In validation test，the average of comprehensive scoring value was 99.54%，the relative deviation of which to predicted value （98.16%） was 0.46% for 3 batches of samples （RSD=0.40%，n=3）.Conclusions The optimized alcohol precipitation process for Shugan granules （Prescription of Guangxi） is rational and feasible， which can provide a reference for process studies in the future.

Keywords：Shugan Granules （Prescription of Guangxi）;Alcohol Extraction Technology;Total Contents;Box-Behnken Design-response Surface Method

舒肝顆粒（廣西方）由夏枯草、茵陳、虎杖等9味藥材加工而成，具有疏肝開郁、清熱解毒、化濕健脾之功效，是治療黃疸型及非黃疸型急性肝炎的良方。方中夏枯草為君藥，虎杖為臣藥，均有保肝作用。臨床研究表明，夏枯草所含的迷迭香酸通過減輕肝臟炎癥反應(yīng)，改善肝纖維化，緩解急性肝損傷來保護肝功能[1-2];虎杖中的虎杖苷具有保護肝臟、抗炎、抗肝癌、降低脂肪肝的作用，大黃素能有效改善肝功能，降低血脂，減輕肝臟炎癥[3-4]。本研究采用Box-Behnken設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化舒肝顆粒（廣西方）的醇提工藝，為后續(xù)舒肝顆粒（廣西方）的工藝研究提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent1200（配置DAD/ELSD檢測器）高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）;Agilent1200色譜工作站（美國安捷倫科技有限公司）;AE240十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）;JJ1000型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）;HH-S6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 （金壇市醫(yī)療儀器廠）。

1.2 對照品與試劑 對照品均購于中國食品藥品檢定研究院，虎杖苷對照品（批號：111575-201603，純度87.3%）、迷迭香酸對照品（批號：111871-201706，純度90.5%）、大黃素對照品（批號：110756-201512，純度98.7%）;甲醇和乙腈（色譜純）購自美國Thermo Fisher公司，液相用水為娃哈哈純凈水。

1.3 藥材 夏枯草（批號：18102001）、虎杖（批號：18051501）、茵陳（批號：18022701）、北柴胡（批號：18102202）、蒲公英（批號：18082202）、蒼術(shù)（批號：18092504）、甘草（批號：18102801）均為廣西仙茱中藥飲片廠生產(chǎn)。馬蘭草、白茅根購自廣西玉林藥市，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室田慧教授鑒定，馬蘭草為菊科植物馬蘭頭（Kalimeris indica L.）的干燥全草，白茅根為禾本科植物白茅（Imperata cylindrical Beauv.var.major（Nees）C.E.Hubb.）的干燥根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 有效成分的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：CAPCELL PAK C18（250 mm×4.6 mm，5μm）;流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫：0～12 min，20%A、12～20 min，20%→30%A、20～25 min，30%→70%A、25～35 min，70%→80%A、35～40 min，80%→90%A;流速：1.0 mL/min;檢測波長：306 nm;柱溫：30℃;進樣量：10μL。取混合對照品溶液和供試品溶液進樣分析，結(jié)果表明混合對照品溶液和供試品溶液在HPLC色譜圖中相應(yīng)色譜峰的保留時間一致，各相鄰峰間分離度均大于1.5，理論板數(shù)按迷迭香酸峰計不低于6000。HPLC色譜圖如圖1所示。

2.1.2 供試品溶液的制備 按處方量的1/20稱取藥材8.75 g，置250 mL圓底燒瓶中，加入12倍量60%乙醇，稱定重量，提取2次，每次回流提取80 min，放冷，用60%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液2 mL，置10 mL容量瓶中，加60%乙醇定容至刻度，搖勻，過微孔濾膜，即得。

2.1.3 混合對照品溶液的制備 精密稱定迷迭香酸對照品8.58 mg、虎杖苷對照品5.89 mg、大黃素對照品5.29 mg，置50 mL量瓶中，加60%乙醇適量，超聲使溶解，再加60%乙醇定容至刻度，搖勻，備用。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取“2.1.3”項下的混合對照品溶液，精密量取0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，加60%乙醇定容至刻度，搖勻，過微孔濾膜，按“2.1.1”色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以對照品濃度作為x軸，峰面積作為Y軸進行回歸分析，得到虎杖苷、迷迭香酸、大黃素的回歸方程分別為：Y=31.193X-11.752，（r=0.9997）、Y=11.445X-4.6137（r=0.9998）、Y=7.0932X+10.846（r=0.9995）。結(jié)果表明虎杖苷在5.14～51.40 μg、迷迭香酸在7.76～77.60 μg、大黃素在5.22～52.20 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度考察 精密吸取“2.1.4”混合對照品溶液5#，按“2.1.1”色譜條件連續(xù)進樣6次，測定虎杖苷、迷迭香酸、大黃素的峰面積并計算RSD值，結(jié)果虎杖苷平均峰面積為1223.98，RSD=0.07%，迷迭香酸平均峰面積為691.97，RSD=0.05%，大黃素平均峰面積為481.15，RSD=0.17%，表明儀器的精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性考察 取“2.1.2”項下的同一供試品溶液，在同一色譜條件下分別于0、2、4、8、12、24 h進樣分析，計算虎杖苷、迷迭香酸、大黃素峰面積的RSD值，結(jié)果分別為0.43%、0.63%、1.45%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性考察 按“2.1.2”項下的方法制備6份供試品溶液，按“2.1.1”色譜條件進樣測定。測得虎杖苷平均含量為2.5585 mg/g，RSD=0.87%;迷迭香酸平均含量為1.8457 mg/g，RSD=0.86%;大黃素平均含量為1.8362 mg/g，RSD=1.74%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收考察 分別在已知含量的6份供試品溶液中加入一定量的虎杖苷、迷迭香酸、大黃素對照品，按“2.1.1”色譜條件進樣分析，計算平均回收率和RSD值，結(jié)果見表1，虎杖苷平均回收率為98.36%，RSD=1.52%;迷迭香酸平均回收率為99.15%，RSD=1.58%;大黃素平均回收率為99.81%，RSD=1.75%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇體積分數(shù)考察 按處方量的1/20稱取藥材6份，每份8.75 g，置250 mL圓底燒瓶中，固定提取次數(shù)1次，加熱回流提取60 min，分別精密加入40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇各100 mL， 按“2.1.2”項下的方法制備成供試品溶液，進樣分析，測定虎杖苷、迷迭香酸、大黃素的總含量，結(jié)果如圖2A所示。結(jié)果表明，50%、60%、70%乙醇提取的總含量高，故選擇乙醇體積分數(shù)為50%～70%進行Box-Behnken設(shè)計試驗。

2.2.2 提取溶劑加入量考察 按處方量的1/20稱取藥材8.75 g，共6份，置250 mL圓底燒瓶中，固定提取次數(shù)1次，加熱回流提取60 min，分別精密加入8倍、10倍、12倍、14倍、16倍、18倍的50%乙醇各100 mL，同上法制備成供試品溶液，進樣分析，測定虎杖苷、迷迭香酸、大黃素的總含量，結(jié)果如圖2B所示。結(jié)果表明，加入量在8～12倍時測得的總含量呈上升趨勢，在12倍量時達最高點，提取效果最好，在12～16倍時測得的總含量呈下降趨勢，16～18倍時總含量平穩(wěn)，故選擇10～14倍進行Box-Behnken設(shè)計試驗。

2.2.3 提取時間考察 按處方量的1/20稱取藥材6份，每份8.75 g，置250 mL圓底燒瓶中，固定加入12倍量50%乙醇，提取次數(shù)1次，分別加熱回流30、60、90、120、150、180 min， 同上法制備成供試品溶液，測定虎杖苷、迷迭香酸、大黃素的總含量，結(jié)果如圖2C所示。結(jié)果表明，加熱回流60 min時測得的總含量最高，提取時間為120～180 min時雖然提取率有所提高，但考慮到生產(chǎn)實際，為節(jié)省生產(chǎn)時間，選擇30～90 min進行Box-Behnken設(shè)計試驗。

2.2.4 提取次數(shù)考察 按1/20處方量稱取藥材8.75g，共3份，置250 mL圓底燒瓶中，固定加入12倍量50%乙醇，分別提取1、2、3次，每次60min，同上法制備成供試品溶液，測定虎杖苷、迷迭香酸、大黃素的總含量，結(jié)果如圖2D所示。結(jié)果表明提取2次時測得的總含量最高，提取效果最好。

2.3 浸膏得率的測定 精密吸取各乙醇提取液20 mL，照《中國藥典》2015年版四部醇溶性浸出物測定法（通則2201）測定，計算浸膏得率Rt （%）。

計算公式：Rt （%）=（M2-M1）/W×V/20×100%

2.4 Box-Behnken設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化醇提工藝

2.4.1 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果 在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，依據(jù)Box-Behnken中心試驗設(shè)計原理，設(shè)計三因素三水平17個實驗點的響應(yīng)面法分析模型，以乙醇的體積分數(shù)（A，%）、提取溶劑加入量（B，倍）、提取時間（C，min）為自變量，固定提取次數(shù)為2次，以總含量和浸膏得率的綜合評分（R）作為本次實驗的響應(yīng)值，因素與水平詳見表2，Box-Behnken設(shè)計與結(jié)果見表3。

2.4.2 模型的建立及顯著性檢驗 通過Design-Expert 8.0.6軟件對表3的數(shù)據(jù)進行回歸分析，以乙醇體積分數(shù)（A）、提取溶劑加入量（B）、實驗提取的時間（C）三個因素對綜合評分進行響應(yīng)面分析，采用多元線性回歸以及二次多項式方程對各個數(shù)據(jù)進行擬合，得回歸方程為Y=-295.35850+6.80485 A+3.77413 B+0.038017 C-3.30000×10-3 AB+3.50000×10-3AC+6.24444×10-3BC-0.058405 A2-0.019758 B2-5.44500×10-3 C2，方差分析結(jié)果見表4。

由表4可知，該模型P=0.0015<0.05，表明擬合模型具有顯著性差異。失擬項P=0.1197>0.05差異不顯著，表明該模型的回歸方程具有較好的擬合度和可信度，實驗誤差相對較小。模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9418，表明該模型可解釋3個因素94.18%的變異性，模型可用于醇提工藝中綜合評分的預(yù)測。該回歸模型的顯著性檢驗結(jié)果如表3所示，模型的一次項A、C顯著（P<0.05），二次項A2、B2、C2對綜合評分的影響非常顯著（P<0.01），BC對綜合評分的影響顯著（P<0.05），其他項均不顯著。3個因素的主次順序為：乙醇體積分數(shù)>提取時間>提取溶劑加入量，交互項對總含量的影響力強弱順序為：BC>AC>AB。

2.4.3 響應(yīng)面分析 利用 Box-Behnken得出的回歸模型作出兩兩因素對綜合評分的交互作用響應(yīng)面曲線圖及等高線圖，從響應(yīng)面曲線圖可以直觀看出各因素的交互作用顯著程度以及變化趨勢，曲面的傾斜程度反映兩因素交互作用的顯著程度，等高線的密度反映該因素對綜合評分的影響強弱。由圖3可知，提取溶劑加入量和提取時間兩個因素的交互影響作用最強，故曲線陡峭，等高線呈橢圓形，對綜合評分影響顯著;乙醇體積分數(shù)和提取時間的交互影響較小，等高線接近圓形;而乙醇體積分數(shù)和提取溶劑加入量的交互影響最小，作用不顯著，等高線呈圓形。各因素對綜合評分的影響交互項強弱順序為：BC>AC>AB，與表3回歸系數(shù)的顯著性檢驗結(jié)果一致。

2.4.4 驗證試驗 采用Design-Expert8.0.6軟件預(yù)測最佳醇提工藝參數(shù)：乙醇體積分數(shù)57.78%，提取溶劑加入量11.84倍，提取時間81.43 min。考慮到生產(chǎn)過程中實施工藝參數(shù)的可行性，將最佳醇提工藝條件調(diào)整如下：乙醇體積分數(shù)為60%，提取溶劑加入量為12倍，提取時間80 min。在此條件下平行進行3次驗證試驗，結(jié)果見表5，測得綜合評分99.54%（RSD=0.40%，n=3），與模型預(yù)測值98.16%的相對平均偏差為0.40%，表明該醇提工藝條件穩(wěn)定、可靠，同時也說明建立的回歸模型合理。

3 討論

夏枯草的活性成分熊果酸也具有保肝功效，且含量比迷迭香酸高[5-7]。故原計劃將熊果酸作為含量測定指標(biāo)之一，但熊果酸的紫外吸收波長在210 nm左右，且熊果酸和齊墩果酸系同分異構(gòu)體，化學(xué)結(jié)構(gòu)接近，只有一個甲基位置的差異，HPLC法較難把熊果酸峰和齊墩果酸峰分離[8]，只能選擇夏枯草另一種活性成分迷迭香峰作為含量測定指標(biāo)。

本研究以君藥夏枯草的迷迭香酸[9]280和臣藥虎杖的虎杖苷和大黃素[9]208-209作為含量測定指標(biāo)，在波長選擇時發(fā)現(xiàn)虎杖苷峰和迷迭香酸峰在254 nm波長測定時呈現(xiàn)倒峰，大黃素峰在330 nm波長測定時呈現(xiàn)倒峰，只有在306 nm波長測定時3個成分均呈現(xiàn)良好的峰形，且分離度佳，故選擇306 nm作為HPLC法的檢測波長。

響應(yīng)面法適宜于解決非線性數(shù)據(jù)處理的相關(guān)問題，它是以多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過回歸方程優(yōu)化工藝參數(shù)的綜合實驗設(shè)計方法，廣泛應(yīng)用于中藥材及復(fù)方制劑的提取工藝條件優(yōu)化。這種方法突破了正交設(shè)計和均勻設(shè)計等線性模型，并且在此基礎(chǔ)上進行了改進，精密度有了提高，而且可以自動識別自變量以及非自變量之間的規(guī)律[10]。本次提取工藝研究是在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，結(jié)果表明，最佳醇提工藝為加入60%乙醇12倍，加熱回流2次，每次80 min。經(jīng)驗證，本次實驗得到的實驗數(shù)值與預(yù)測數(shù)值的偏差為0.46%，表明該醇提工藝條件合理可行，可用于后續(xù)舒肝顆粒（廣西方）制劑生產(chǎn)的醇提工藝提取。

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（收稿日期：2020-12-04 編輯：程鵬飛）