8個新收集大白菜雜交種DNA指紋構建及其與已有種質的親緣關系分析

劉栓桃，王立華，張志剛，王榮花，王樹彬，李巧云，趙智中

（山東省農業科學院蔬菜研究所／國家蔬菜改良中心山東分中心／山東省設施蔬菜生物學重點實驗室／農業部黃淮地區蔬菜科學觀測實驗站（山東），山東 濟南 250100）

大白菜（Brassica rapassp.pekinensis）是山東省的優勢蔬菜，為常異交作物，雜種優勢非常明顯，因此雜交種在生產實踐中的普及率較高。由于消費需求不斷變化且呈現出多樣化的特點，近年來衍生出很多新的大白菜品種，如快菜，苗期生長迅速、無毛、葉肉厚，蓮座期葉片直立性好，食用器官就是蓮座期的葉片；紹菜，日本進口品種，中棵直筒型；娃娃菜，葉球體積小食用器官為蓮座葉、合抱類型，適宜運輸；黃心秋白菜，近年來新出現的類型，且心葉顏色越黃越受歡迎。

對于新涌現的品種類型，有必要了解其與已有品種或種質資源之間的親緣關系，這對掌握其親本類型、培育自主知識產權的新品種有非常大的幫助。前人對大白菜遺傳多樣性、種質資源親緣關系等方面的研究已經有很多報道，如RAPD［1，2］、AFLP［2，3］、SSR［4－7］和SRAP［8］等標記類型均被用于鑒定大白菜種質的親緣關系。隨著高通量測序技術的發展，很多物種的參考基因組序列已經公布，大白菜參考基因組序列也已經釋放［9］，以全基因組重測序技術為基礎的新型分子標記如 InDels標記、SNP 標記得到普遍應用［10，11］。尤其是InDels標記，它在基因組中一般呈共顯性分布，且其在基因組中的位置清楚、變異穩定，這是RAPD、AFLP、SSR等標記不能比擬的［5］。

本課題組已經開發了適宜大白菜種質資源和雜交種指紋構建的核心引物［12，13］，前期已經對105份大白菜育種材料和72個雜交種進行了DNA指紋分析，本研究將在此基礎上，構建8個新收集大白菜品種的DNA指紋，進一步充實大白菜雜交種DNA指紋數據庫，同時分析這些雜交種與已有育種材料和雜交種之間的親緣關系，為加快新種質利用和創制大白菜新種質提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為市售8個大白菜新品種（見表1）。分別是娃娃菜新品種耐寒金皇后、玲瓏黃012，抗根腫病合抱類新品種CR新美，合抱類型黃心秋白菜新品種12CC4912、金德麗和梅賽德斯，紹菜新品種墨玉青，直筒類新品種御菜。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 每個品種隨機選取20粒種子，參考劉栓桃等［14］的方法準備幼苗，即種子用蒸餾水清洗后置于墊有發芽紙的發芽盒內，于8 000 lx的光照培養箱內16 h光照／8 h黑暗、28℃恒溫處理72 h。然后每個品種選取10棵子葉展開的幼苗，混勻后液氮研磨，取50 mg粉末加入200μL TPS提取液于65℃恒溫箱保溫30～60 min，隨后冷卻至室溫，12 000 r／min離心10 min；將上清轉移至新的離心管中，加入等體積異丙醇使DNA沉淀，12 000 r／min離心10 min，棄上清。DNA沉淀用75%酒精清洗后于室溫干燥10 min，用200μL 10 mmol／L的Tris－HCl（pH 8.0）溶解，4℃保存備用。

1.2.2 DNA指紋構建 所用20對核心引物以及PCR 反應體系均參考本課題組前期的研究［13］。PCR擴增產物用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色，數碼相機拍照。DNA指紋構建參考劉栓桃等［13］的方法，將引物按照染色體編號和物理位置由小到大排列，如果某樣本擴增產物為單一的、相對遷移率較大的條帶則賦值0，如果擴增產物為單一的、相對遷移率較小的條帶則賦值1，如果同時擴增出兩條帶則賦值H。

1.2.3 與已有育種材料和大白菜品種的親緣關系分析 以核心引物的擴增結果為依據，從前期研究中篩選105份大白菜育種材料和72個大白菜雜交種的DNA指紋賦值結果，這些材料的編號、名稱詳見有關文獻［12，13］。參照劉栓桃等［14］的方法將DNA指紋轉換為核酸堿基，即賦值1轉換為AA，賦值0轉換為GG，賦值H轉換為AG，將生成的核酸序列文件用MEGA 7.0軟件［15］以最大似然法構建親緣關系樹。

2 結果與分析

2.1 大白菜新品種DNA指紋構建

圖1是核心引物IDA01054以及IDA02042的擴增結果及賦值示例。依據圖示的賦值標準將20對引物的擴增結果賦值，所得8個品種的DNA指紋如表1所示。經過比對，8個新品種之間沒有重復指紋。

表1 8個新品種的DNA指紋

2.2 新收集品種與已有大白菜品種及育種材料的親緣關系分析

新收集的8個品種與已有品種及育種材料［12，13］的親緣關系如圖2所示。可以發現，耐寒金皇后（NF－1）、梅賽德斯（NF－6）與2019年收集的玲瓏黃515（WS14）、寒鮮（WS16）以及長勝（WS19）三個耐抽薹大白菜親緣關系比較近，與本課題組創制的合抱類春白菜育種材料06－247（R001）、2016－185－3（R100）以及引自韓國的春材料2017－YM59（R085）也有比較近的親緣關系。玲瓏黃012（NF－2）與2019年收集的一個中棵娃娃菜（WS12）、抗根腫病娃娃菜CR－黃心（WS20）、CR－金麗（WS05）、CR－民喜（WS06）、CR－天盛（WS10）都比較接近，與從韓國引進的春白菜材料2016－XC25（R089）有較近的親緣關系。CR新美（NF－3）和直筒類新品種御菜（NF－8）與我國育成的直筒類品種天香80青麻葉（WS27）、北京新三號（F1－13）、中白62號（F1－36）、天白75（F1－31）有較近的親緣關系，但與本課題組已經鑒定的105份育種材料都沒有比較直接的親緣關系。新收集的合抱類秋白菜12CC4912（NF－4）和金德麗（NF－5）兩個比較相似，與我們創制的疊抱類秋材料2016－133－3（R092）和2011－ZC39（R103）有一定的親緣關系。墨玉青（NF－7）與之前收集的品種親緣關系不大，與我們創制的合抱類秋材料2017－YM12（R082）有一定的親緣關系。總體上，新收集的8個品種、2019年收集的32個新品種與課題組創制的合抱類材料親緣關系更近，與疊抱類材料親緣更遠。

圖2 新收集品種與已有品種和種質之間的親緣關系聚類結果

3 討論與結論

大白菜新品種采用登記制，新品種登記之前必須進行特異性、一致性和穩定性測試（即DUS測試），而DUS測試基本以田間種植和調查為主，由農業農村部委托有資質的機構進行［16］。一個新品種在進行DUS測試時，會要求新品種提供者同時提供一個與該新品種相近的對照品種，測試機構按照DUS測試指南的要求，在1～2個生育期內對新品種及其對照品種進行相應指標的調查記錄，出具測試報告。由于新品種育成單位對自己選育的新品種以及市場已經銷售的品種有比較多的了解，因而在選擇對照品種時很可能會有意識地避免選擇各方面性狀與自己品種接近的已有品種，而更傾向于選擇一個與自己品種各方面性狀差異比較大的作為對照，這樣比較容易得到一個符合規定的DUS測試結果，使新品種能盡快進行相關登記而推向市場，從而使新品種選育單位實現利益最大化。更有甚者，可能將相同的品種進行不同的命名，同時委托不同的DUS測試機構進行測試，最終以同種異名進行品種登記而銷售，迷惑市場和種植者。解決上述問題的唯一辦法就是應收盡收地收集所有已經在中國市場登記和銷售的大白菜新品種并構建其DNA指紋數據庫。對于一個新選育的品種，進行DUS測試的同時構建其DNA指紋，并與數據庫中已有的指紋進行比對，將DUS測試結果與DNA指紋比對結果相結合，真正讓有創新的品種進入登記環節并推向市場。

本課題組前期構建了72個大白菜雜交種的DNA指紋數據庫［13］，這為開展新育成大白菜雜交種的DNA指紋比對工作奠定了基礎。本研究對新收集的8個大白菜雜交種與已有品種DNA指紋進行比對，發現了與已有品種近似的品種，但沒有發現完全相同的品種，表明新收集的這8個新品種有一定的利用價值。尤其值得注意的是，本研究利用DNA指紋比對技術將新品種與本課題組已經創制的育種材料進行比對，明確了新品種與已有育種材料之間的親緣關系，今后再進一步結合田間鑒定結果，可以將新收集品種的優良性狀轉移至親緣關系更近的育種材料中，這對指導新種質創制有一定的借鑒意義。

本課題組創制的材料中疊抱類秋材料比較豐富，合抱類春、秋材料相對比較少。合抱類品種由于長途運輸方便，比較受市場的歡迎，因此近年來我們側重于收集合抱類新品種，以創制合抱類育種材料。從本研究鑒定結果發現，2019年收集的WS01～WS32以及本研究收集的8個新品種，均與合抱類型材料的親緣關系較近，而與本課題組已有的疊抱類型材料親緣關系較遠，這對今后選育合抱類白菜新品種有重要的利用價值。

總之，本研究構建了新收集的8個大白菜新品種的DNA指紋，充實了大白菜雜交種DNA指紋數據庫，同時分析了這8個新品種與已有品種以及本課題組已有育種材料之間的親緣關系，為充分利用這些新品種的優良性狀改造已有育種材料、避免系譜關系混雜提供了分子證據。