羧甲基普魯蘭多糖螯合鈣的制備及其功效評價

李海鷹，楊祥禾，魏珍珍，賈 蓓，楊文智*

（河北大學藥學院，河北省藥物質量分析控制重點實驗室，河北 保定 071002）

鈣是人體所含最豐富的營養素，且參與了一系列生理過程，如骨骼發育、血管收縮、血管擴張、肌肉功能、神經傳遞、細胞內信號和激素分泌[1]。人生長、發育及衰老過程中，鈣攝入后得到良好的吸收是增強或穩定骨量的關鍵。有報道顯示，青少年攝取鈣量與骨密度關系密切[2]， 發育期缺鈣，則成熟骨骼的骨峰值低，會增加骨質疏松的患病風險。一般男性和女性分別在21 周歲和19 周歲時骨量達到峰值，此后骨量增長停滯[3]，中年后骨量明顯損失，每年損失總骨量的0.5%～1%[4]。研究表明增加鈣攝入量可使骨折風險降低12%[5]。為了保證較高的骨密度，老年人日攝入800 mg鈣可有效預防骨流失[6-7]。根據年齡和性別不同，成人每日鈣攝入量應在500～1 200 mg之間[8]。 雖然鈣可從膳食中攝取，但日常飲食難以達到推薦攝入量[9]，調查發現大多數東南亞國家人群的平均膳食鈣攝入量低于400 mg/d[10]。2017年《中國家庭健康大數據報告》發布，“補鈣”一詞榜上有名，中國人鈣元素缺失排名第一[11]。因此，補鈣制劑也是人群關注的熱點。

市場上的補鈣制劑可分為無機鈣、有機酸鈣、有機鈣和天然生物活性鈣，這些補鈣制劑各有優缺點，生物利用度也不盡相同[12-14]。無機鈣（如碳酸鈣），鈣含量高且價格低，但體內吸收率低，易引發結石，從而影響服用者正常的胃腸道功能，此外胃酸分泌差的人群存在嚴重的吸收問題。有機酸鈣可改善無機鈣的上述缺點，但葡萄糖酸鈣中鈣含量相對較低，且高糖成分不適合糖尿病患者；乳酸鈣進入消化道產生乳酸根離子，能引起機體酸痛或疲勞；醋酸鈣會抑制小腸對鋅等微量元素吸收，提升高鈣血癥的風險[12]。有機鈣主要是氨基酸或復合氨基酸螯合鈣，鈣離子與酸根結合穩定，此類補鈣制劑具有左旋結構和較好的脂溶性，顯示出良好的生物活性，但其制備工藝相對復雜且價格貴[15]。近年來，研究者發現天然生物活性多糖鈣溶解性好，對胃腸道刺激小，不良反應低，能克服傳統鈣鹽的缺點，是一類值得研究與開發的補鈣劑[16]。為了更好地獲得多糖螯合鈣制劑，有研究者將多糖分子的羥基衍生化，引入強親核原子或基團，常見含氮、磷或羧酸衍生物，從而在多糖分子鏈上引入強配體基團與鈣離子產生穩定螯合[17]。

普魯蘭多糖是一種非離子鏈狀多糖，其來源廣泛，具有天然多糖的生物相容性和可生物降解性，同時具有良好的水溶性、黏性和成膜性特點[18]。此外，其分子鏈上的大量羥基可用于化學修飾，制備衍生物，引入功能基團，拓寬其應用范圍。目前，將普魯蘭多糖及其衍生物應用于食品、保健品和藥品等領域已獲得研究者的 廣泛關注[19]。本實驗以天然普魯蘭多糖為原料合成羧甲基 普魯蘭多糖鰲合鈣，用于治療骨質疏松小鼠，為新型鈣補充劑的開發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

15～20 g清潔級Balb/C小鼠24 只，雌雄各半，由河北省實驗動物中心提供（生產許可證號：SCΧK（冀）2018-004）。

普魯蘭多糖（2 000 kDa） 日本林原化學株式會社；羧甲基普魯蘭多糖（carboxymethyl pullulan，CMP）由實驗室自制；氯化鈣 北京惠寶聯化科技有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

FTIR-8400s傅里葉變換紅外光譜儀 日本島津儀器公司；T6紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；LGJ-18冷凍干燥機 寧波新芝儀器有限公司；TM3000掃描電子顯微鏡 日本日立儀器公司；AU680全自動生化分析儀 美國Beckman公司；YD-20KZ 硬度儀 天津天大天發科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CMP-Ca（II）的制備及表征

參考文獻[20]合成CMP，經絡合滴定法測得制備的CMP羧甲基取代度為40%。配制質量分數1%的CMP水溶液，50 ℃水浴條件下滴加CaCl2溶液，使Ca2+與CMP質量比為2∶1，用2 mol/L NaOH溶液調節反應液pH值至10。反應一定時間后，反應液以4 000 r/min離心5 min除去沉淀（直至無沉淀產生），取上清液，加入過量的2 mol/L Na2CO3溶液除去游離鈣離子，4 000 r/min離心5 min。上清液減壓濃縮后，加入無水乙醇進行醇沉，靜置24 h后抽濾獲得CMP-Ca（II）粗品，適量去離子水溶解，裝入透析袋（截留分子質量8～12 kDa）中用蒸餾水透析后，將透析液凍干，得CMP-Ca（II）純品。CMP和 CMP-Ca（II）樣品用紫外光譜、傅里葉變換紅外光譜和掃描電子顯微鏡進行表征。

1.3.2 紫外光譜分析

將CMP與CMP-Ca（II）分別溶于蒸餾水中，以蒸餾水為對照，采用紫外-可見分光光度計，在200～500 nm波長范圍內進行掃描，分析兩者掃描圖譜的差異。

1.3.3 傅里葉變換紅外光譜分析

分別取干燥的CaCl2、CMP和CMP-Ca（II）樣品，與KBr混合，研磨均勻后壓片，用傅里葉變換紅外光譜儀在4 000～400 cm-1范圍內掃描，測定樣品的紅外吸收光譜。

1.3.4 掃描電子顯微鏡觀察微觀結構

采用掃描電子顯微鏡在真空條件下掃描CMP與 CMP-Ca（II）樣品，電壓為15 kV，放大倍數為100，觀察樣品的微觀形貌特征。

1.3.5 CMP-Ca（II）配合物中鈣離子質量分數測定

精密稱定CMP-Ca（II）35 mg，置于燒杯中，加6 mol/L HCl 5 mL和蒸餾水30 mL溶解，煮沸5 min，冷卻后轉移至50 mL容量瓶中，定容，搖勻。精確量取5.0 mL樣品溶液至錐形瓶中，用NaOH溶液調pH值至13～14，加1 滴鈣紫紅素指示劑，用0.05 mol/L的乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）溶液滴定至溶液由紫紅色變為藍色，即達到滴定終點。記錄消耗EDTA溶液體積，按下式計算鈣離子質量分數，平行測定3 次。

式中：cEDTA為EDTA滴定液濃度/（mol/L）；VEDTA為消耗EDTA溶液體積/mL；MCa為Ca的原子質 量/（g/mol）；m為待測溶液中CMP-Ca（II）的質量/mg。

1.3.6 CMP-Ca（II）配合物制備工藝優化

選取反應pH值（X1）、m（Ca2+）∶m（CMP）（X2）和反應溫度（X3）為考察因素，以鈣離子質量分數為評價指標，采用單因素試驗考察3 個因素的影響，每個單因素試驗平行操作3 次[21]。固定m（Ca2+）∶m（CMP） 為1∶1和溫度為50 ℃，考察反應pH值分別為7、8、9、10、11和12時對CMP-Ca（II）配合物鈣離子質量分數的影響；固定反應pH值為9和溫度為50 ℃，考察m（Ca2+）∶m（CMP）為4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶3時對CMP-Ca（II）配合物鈣離子質量分數的影響；固定m（Ca2+）∶m（CMP）為1∶1和反應pH值為9，考察反應溫度為30、40、50、60 ℃和70 ℃時對CMP-Ca（II）配合物鈣離子質量分數的影響。依據單因素試驗結果，設計3因素3水平的Box-Benhnken響應面試驗[22]，按照表1優化反應條件。其中用1、0、-1代表自變量的高、中、低3 個編碼水平，響應值Y為鈣離子質量分數，進行17 次試驗。用Design Expert 8.0軟件對結果進行分析，獲得 CMP-Ca（II）最佳制備的工藝條件并驗證。

表1 Box-Benhnken響應面法因素水平表Table 1 Factors and levels used for Box-Benhnken design

1.3.7 骨質疏松Balb/C小鼠造模及CMP-Ca（II）體內評價

將15～20 g清潔級Balb/C小鼠隨機分為3 組，每組8 只，雌雄各半，分別為空白對照組、模型對照組和CMPCa（II）組。在第1～14天，模型對照組和CMP-Ca（II） 給藥組灌胃維甲酸70 mg/（kgmb·d），建立小鼠骨質疏松模型[23]，第15～42天，模型對照組灌胃生理鹽水，CMP-Ca（II）給藥組灌胃100 mg/（kgmb·d） CMP-Ca（II），空白對照組在1～42 d均灌胃生理鹽水。實驗期間各組小鼠分籠飼養，飼喂標準飼料，自由飲水，每天記錄體質量。實驗完畢后，小鼠斷頭取血，血液室溫靜置30 min，4 000 r/min離心10 min，分離血清置于4 ℃冰箱貯存。血清樣本采用AU680全自動生化分析儀測定堿性磷酸酶（alkaline phosphatase protein，ALP）活力，通過偶氮砷III法測定血鈣濃度。小鼠取血后，剝離其雙側股骨，剔除骨上附著組織，60 ℃烘至恒質量并稱量，以股骨干質量/體質量來計算骨質量指數，游標卡尺測量其左側股骨長度、寬度和厚度。通過排水法測定股骨體積，以股骨干質量/股骨體積計算骨密度。采用硬度儀測定股骨的骨硬度，記錄最大承載力。

1.4 數據統計與分析

2 結果與分析

2.1 CMP-Ca（II）制備工藝優化結果

采用單因素試驗考察反應pH值、m（Ca2+）∶m（CMP） 和反應溫度對鈣離子質量分數的影響。由圖1A可知，CMP-Ca（II）的鈣離子質量分數隨著pH值的增大先升后降。低pH值時，CMP分子中羧基解離度低，不利于與鈣離子發生配合；pH 10時CMP-Ca（II）配合物中鈣離子質量分數最高；pH＞10時，配合物中鈣離子質量分數隨著pH值的增大而降低，pH值增大可使溶液產生氫氧化鈣沉淀，不利于CMP-Ca（II）配合物的合成。因此，選擇pH 10為制備CMP-Ca（II）的最佳條件。 Ca2+與CMP二者的質量比也影響CMP-Ca（II）的鈣離子質量分數，由圖1B可知，在選定的比例下，隨著m（Ca2+）∶m（CMP）減小，CMP-Ca（II）配合物鈣離子質量分數先升高后降低，適宜的m（Ca2+）∶m（CMP）為2∶1。適當升高反應溫度可提升反應物CMP與Ca2+之間的碰撞頻率，促使產物生成。50 ℃時， CMP-Ca（II）配合物鈣離子質量分數最高（圖1C），若再提高反應溫度，則CMP分子和Ca2+運動速度過快，限制了CMP分子上的配位基團與Ca2+的結合。

圖1 pH值（A）、m（Ca2＋）∶m（CMP）（B）和反應溫度（C） 對CMP-Ca（II）配合物鈣離子質量分數的影響Fig.1 Effect of pH (A), m (Ca2＋)∶m (CMP) ratio (B) and temperature (C) on Ca2+ content of CMP-Ca(II)

參考單因素試驗結果，設計3因素3水平的 Box-Benhnken響應面實驗考察pH值（X1）、m（Ca2+）∶m（CMP）（X2）和反應溫度（X3）對CMP-Ca（II）配合物制備工藝的影響，以鈣離子質量分數（Y）為評價指標，結果見表2。各因素交互作用對鈣離子質量分數影響的等高線和響應面圖見圖2。

表2 響應面法優化CMP-Ca（II）配合物制備工藝參數結果Table 2 Experimental design with results for response surface analysis

圖2 各因素交互作用對鈣離子質量分數影響的等高線和響應面圖Fig.2 Contour plots and three-dimensional response surface plots describing the interactive effects of different factors on calcium content of CMP-Ca(II)

利用Design-Expert軟件，得到回歸方程：Y＝-166.179 5+31.145X1+4.329X2+0.614 75X3-0.01X1X2-0.006 5X1X3-0.005X2X3-1.531X12-0.981X22-0.005 36，其決定系數R2為0.999 3，模型方程擬合度良好；變異系數為0.46%，實驗誤差小，能準確地預測實際情況。回歸方程失擬性檢驗P＝0.896 9＞0.05，符合模型要求，可利用該模型分析預測。經方差分析和統計學檢驗，模型的一次項X1、X2、X3，交互項X1X3、X2X3和二次項X12、X22、X32對CMP-Ca（II）復合物鈣離子質量分數（Y）影響顯著（P＜0.05），其中X1、X12、X22和X32影響高度顯著（P＜0.000 1）。

為探討各因素對制備CMP-Ca（II）配合物鈣離子質量分數的影響，采用Design Expert軟件繪制CMP-Ca（II） 中鈣離子質量分數（Y）與反應pH值（X1）、m（Ca2+）∶m（CMP）（X2）和反應溫度（X3）之間的等高線圖和三維響應面圖，考察X1、X2和X3對Y的影響。 圖2A1和圖2A2為反應pH值與m（Ca2+）∶m（CMP）交互作用對鈣離子質量分數的影響，圖2B1和圖2B2為反應pH值與反應溫度的交互作用對鈣離子質量分數的影響，橢圓形等高線表示反應pH值與m（Ca2+）∶m（CMP）和反應pH值與反應溫度對CMP-Ca（II）配合物鈣離子質量分數有顯著影響。圖2C1和圖2C2為m（Ca2+）∶m（CMP）與反應溫度的交互作用對鈣離子質量分數的影響，等高線稀疏且呈圓形，說明m（Ca2+）∶m（CMP）與溫度對CMP-Ca（II）配合物鈣離子質量分數影響不顯著。采用Design Expert軟件優選CMPCa（II）配合物的最佳制備條件為50 ℃、pH 10和m（Ca2+）∶m（CMP）＝2∶1。為驗證模型可靠性，采用優化條件制備3 批CMP-Ca（II）配合物，獲得的最高鈣離子質量分數為10.3%，與模型方程預測值相一致。

2.2 CMP-Ca（II）的結構表征

CMP-Ca（II）配合物紫外光譜圖如圖3所示，CMP溶液在255 nm波長處顯示出較強吸收峰，但CMP-Ca（II） 在200～400 nm波長處未見明顯的紫外吸收，CMP在255 nm波長處的最大紫外吸收峰消失，表明CMP中的 —COOH與Ca2+發生絡合，使得CMP-Ca（II）未見明顯的羰基基團紫外吸收峰。

圖3 CMP及CMP-Ca（II）配合物的紫外光譜Fig.3 UV spectra of CMP and CMP-Ca(II) complex

CMP-Ca（II）配合物傅里葉變換紅外光譜分析結果見圖4。CMP與CaCl2發生配合反應生成CMP-Ca（II），其紅外光譜與CMP相比，—OH特征吸收峰由3 420 cm-1處 移至3 391 cm-1處，CMP-Ca（II）紅外光譜曲線中CMP在1 732 cm-1處的羰基吸收峰消失，于1 600 cm-1處出現新的強吸收峰，證明成功合成CMP-Ca（II）配合物。CMP-Ca（II） 配合物合成過程中CMP的—OH和—COOH與Ca2+形成強配位鍵，導致CMP的羰基吸收峰消失。此外， CMP-Ca（II）的紅外光譜圖與CaCl2鈣供體的紅外光譜圖存在顯著不同，這與文獻[21,24]報道的結果類似。

圖4 CMP-Ca（II）傅里葉變換紅外光譜圖 Fig.4 FTIR spectra of CMP-Ca (II)

由圖5可看出，CMP呈較為致密的層狀結構，表明多糖分子間作用可形成重疊結構。而CMP與鈣離子配合后，CMP-Ca（II）的結構發生根本改變，表面變為不規則的顆粒狀，說明CMP與金屬離子配合時其糖鏈發生不同程度的卷曲，配位鍵的形成極大改變了多糖結構，配位前后表面形貌發生了顯著的變化[25]。

圖5 CMP（A）和CMP-Ca（II）（B）掃描電子顯微鏡圖 Fig.5 SEM images of CMP (A) and CMP-Ca(II) (B)

2.3 CMP-Ca（II）治療小鼠骨質疏松效果的初步評價

體質量是反映生物體健康狀況的重要指標，經維甲酸及CMP-Ca（II）制劑干預后小鼠體質量的變化如圖6所示。模型對照組小鼠4 d后體質量持續下降，而生理鹽水灌胃的空白對照組小鼠體質量正常增長（圖6A），說明維甲酸對小鼠的生長影響顯著。維甲酸灌胃3 d后，小鼠攝食量、活動量均明顯減少，反應遲鈍，蜷縮成團，可見被毛枯槁乍起、眼鼻部及耳部黏膜紅腫發炎、后腿站立不起等變化。14 d后處死小鼠，比較發現空白對照組小鼠股骨光滑，骨骼關節發白發亮，未發現自發性骨折，而維甲酸模型對照組股骨表面略顯粗糙，有肉眼可見骨質缺失，骨骼關節發黑發暗（圖7A）。摘取空白 對照組與模型對照組小鼠的心、肝、脾、肺和腎，肉眼觀察未見兩組小鼠臟器的大小、形態的異常改變，表明給予70 mg/（kgmb·d）維甲酸建立小鼠骨質疏松模型成功。圖6B是CMP-Ca（II）組和空白對照組小鼠在28 d內體質量的變化情況。初始時，空白對照組小鼠體質量明顯高于模型組，基本維持在25 g左右。隨著補充 CMP-Ca（II），CMP-Ca（II）組小鼠的體質量呈現快速上升趨勢。表明灌胃一定劑量的CMP-Ca（II）在小鼠自身生長過程中可參與營養骨骼并促進小鼠生長。

圖6 不同組別的Balb/C小鼠體質量變化Fig.6 Body mass variation of Balb/C mice in different experimental groups

圖7 空白對照組（A）與模型對照組（B）小鼠股骨形態圖Fig.7 Appearance of femur in normal (A) and model (B) mice

骨質疏松早期無明顯癥狀，通常以測定骨密度來初步判斷是否骨質疏松[26-27]，但僅憑骨密度不能反映骨強度，如患有石骨病時患者骨密度雖正常，但該病引起的骨折發生率卻很高，故除骨密度外，骨硬度也是反映骨是否正常的重要指標[28]。另外，骨質量與骨結構緊密相關，股骨干質量、股骨鈣含量變化等也被作為評價補鈣制劑效果的指標[29]。為全面反映骨骼生長情況，對空白對照組、模型對照組和CMP-Ca（II）給藥組小鼠股骨指標、骨密度、骨硬度、血鈣濃度、ALP活力進行了測定，結果如表3所示。與空白對照組相比，模型對照組 小鼠的股骨長度、寬度、厚度、干質量和骨質量指數均顯著降低，骨密度和骨硬度均顯著減小（P＜0.05），說明維甲酸灌胃對小鼠的骨骼發育產生了明顯影響。動物體內99%以上的鈣沉積于骨骼與牙齒中，正常生物體血鈣含量低，且與骨鈣含量維持動態平衡，但骨質疏松可促使骨鈣溶出，導致血鈣含量升高。此外，骨質疏松時，血液中ALP活力會明顯升高。故測定骨代謝的血鈣濃度和ALP活力對骨質疏松癥等代謝性骨病的診斷具有重要意義[30]。由表3可知，維甲酸使得模型對照組ALP活力顯著升高，表明模型小鼠破骨細胞的活性依舊較強。但血鈣濃度與空白對照組無顯著差異，這可能與長期停用維甲酸后小鼠自身穩態調節有關。上述結果表明，模型對照組小鼠骨骼處于負鈣平衡狀態，骨質疏松傾向明顯，說明造模成功。與模型對照組相比，CMP-Ca（II）組小鼠股骨長度并未增加，表明成年小鼠鈣質的補充并不能增加骨長，但小鼠股骨的寬度、厚度、干質量和骨質量指數均有不同程度的增加，說明CMP-Ca（II）對提高骨質量有明顯效果，主要是通過增加骨橫徑及骨質量實現；此外，CMP-Ca（II）組小鼠股骨的骨密度、骨硬度較模型對照組均有不同程度的改善，ALP活力下降，說明 CMP-Ca（II）可抑制骨破壞并調節骨重建，具有一定改善維甲酸導致的骨質疏松作用。

表3 不同小鼠不同指標的測定結果Table 3 Measured bone indexes of mice in different groups

3 結 論

本實驗采用單因素試驗和Box-Benhnken響應面實驗優化條件，制備了鈣離子質量分數為10.3%的 CMP-Ca（II）。CMP-Ca（II）與CMP相比，紫外光譜和傅里葉變換紅外光譜圖差異明顯，CMP-Ca（II）的紫外光譜中255 nm波長處最大吸收峰消失，而在紅外光譜中于1 600 cm-1處出現新的吸收峰，證明CMP-Ca（II） 配合物成功合成。掃描電子顯微鏡觀察結果顯示， CMP-Ca（II）產物為粒狀結構。采用維甲酸構建骨質疏松小鼠模型，以CMP-Ca（II）配合物為補鈣劑，驗證其對骨質疏松小鼠補鈣效果。經過28 d干預，CMP-Ca（II）可提高骨質量，其中，以增加骨橫徑及骨質量為主，此外CMP-Ca（II）還可改善骨密度、骨硬度，具有一定改善維甲酸導致的骨質疏松作用。